7.2 Determinación de las condiciones medio ambientales para el crecimiento y
7.2.2 Fermentación
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
68
Figura 17. Gráficas de Pareto para a) Peso seco, b) µmáx, c) Yx/s y d) gráfica de interacción para Peso seco de la cepa T1 en medio YPD
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
69 menos de 2 g/L. No se presentó una producción de alcohol en el tratamiento 3 (45o C y 0 rpm) y 9 (45o C y 200 rpm), por lo que la cepa LR4 para poder producir alcohol a 45o C necesita de cierta agitación (100 rpm) aunque resulta uno de los tratamientos menos indicados para obtener una alta producción.
a) Candida glabrata (LR2)
Tiempo (h)
0 5 10 15 20 25
Producción de alcohol (g/L)
0 2 4 6 8 10 12
b) Candida tropicalis (LR4)
Tiempo (h)
0 5 10 15 20 25
Producción de alcohol (g/L)
0 2 4 6 8 10 12
c) Candida glabrata (LR5)
Tiempo (h)
0 5 10 15 20 25
Producción de alcohol (g/L)
0 2 4 6 8 10 12
d) Candida glabrata (T1)
Tiempo (h)
0 5 10 15 20 25
Producción de alcohol (g/L)
0 2 4 6 8 10 12
Figura 18. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. Tratamiento 1 (35o C, 0 rpm, círculo rojo), Tratamiento 2 (40o C y 0 rpm, círculo naranja), Tratamiento 3 (45º C y 0 rpm, triangulo invertido verde claro), Tratamiento 4 (35oC y 100 rpm, triángulo verde oscuro), Tratamiento 5 (40o C y 100 rpm,
cuadrado azul turquesa), Tratamiento 6 (45o C y 100 rpm, azul marino), Tratamiento 7 (35o C y 200 rpm, rombo morado), Tratamiento 8 (40o C y 200 rpm, rombo rojo), Tratamiento 9 (45o C y 200 rpm, triángulo naranja).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
70 Para la cepa LR5 (figura 18c) se observó una producción constante de alcohol a partir de las 4 h donde se destaca el tratamiento 5 (40o C y 100 rpm) donde se obtiene la máxima concentración a las 4 h.
Tabla 13. Parámetros cinéticos para la producción de alcohol de las diferentes cepas según el diseño 32. Trat T
(oC)
Agitación
(RPM) CEPAS Alcohol
(g/L) Yp/s Eficiencia (%)
Pmáx (g/Lh)
Azúcar consumido
(g/L)
1 35 0
LR2 7.94±0.64 0.43±0.04 84.30±8.32 0.79±0.06 18.45±0.17 LR4 8.00±0.07 0.42±0.01 82.40±2.75 0.80±0.01 19.00±0.42 LR5 8.30±0.36 0.43±0.01 84.31±2.77 0.83±0.04 19.26±0.02 T1 8.80±0.17 0.45±0.01 88.23±1.38 0.73±0.01 19.70±0.11
2 40 0
LR2 7.53±0.51 0.38±0.02 74.50±4.17 0.63±0.04 19.56±0.04 LR4 7.40±2.68 0.39±0.015 76.50±29.08 0.62±0.23 19.20±0.04 LR5 9.31±0.07 0.48±0.00 94.11±0.00 0.78±0.01 19.42±0.16 T1 8.79±0.09 0.45±0.00 88.23±0.00 0.74±0.01 19.48±0.02
3 45 0
LR2 8.70±0.81 0.45±0.05 88.24±9.70 0.54±0.05 19.14±0.22
LR4 0±0.16 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.06
LR5 6.91±0.21 0.39±0.01 76.47±2.77 0.58±0.02 17.64±0.08 T1 7.45±0.04 0.45±0.00 88.23±0.00 0.47±0.01 16.46±0.06
4 35 100
LR2 8.20±0.05 0.43±0.00 84.30±0.00 1.03±0.01 18.90±0.01 LR4 7.62±0.057 0.42±0.02 82.40±4.17 1.10±0.08 18.15±0.23 LR5 8.94±0.13 0.47±0.01 92.15±2.77 0.89±0.01 19.19±0.18 T1 8.90±0.17 0.46±0.01 90.20±1.39 0.89±0.01 19.24±0.11
5 40 100
LR2 7.99±0.41 0.42±0.02 82.40±4.17 0.80±0.04 19.13±0.03 LR4 6.88±0.90 0.36±0.06 70.59±11.08 0.57±0.08 19.12±0.32 LR5 7.06±0.09 0.43±0.00 84.31±0.00 1.77±0.02 16.41±0.28 T1 7.96±0.09 0.45±0.00 88.23±0.00 0.66±0.01 17.58±0.08
6 45 100
LR2 8.04±1.34 0.43±0.06 84.30±12.48 0.67±0.11 18.81±0.21 LR4 5.90±0.42 0.32±0.01 62.70±2.75 0.42±0.03 18.41±0.59 LR5 7.59±0.38 0.40±0.01 78.47±2.77 0.40±0.01 19.06±0.28 T1 8.03±0.22 0.42±0.02 82.35±4.15 0.42±0.01 19.27±0.26
7 35 200
LR2 7.62±0.45 0.40±0.03 78.40±5.58 0.76±0.04 19.00±0.14 LR4 7.80±0.45 0.41±0.04 80.40±6.92 0.78±0.04 18.90±0.43 LR5 8.76±0.13 0.45±0.01 88.24±1.38 0.73±0.01 19.62±0.02 T1 8.90±0.16 0.47±0.02 91.17±4.15 0.89±0.01 19.22±0.22
8 40 200
LR2 9.40±0.21 0.50±0.01 98.03±2.77 0.94±0.02 18.80±0.23 LR4 6.20±0.13 0.33±0.00 64.70±0.00 0.52±00.101 18.63±0.44 LR5 7.39±0.55 0.49±0.04 96.10±6.93 1.23±0.10 15.31±0.42 T1 6.78±0.53 0.37±0.03 72.54±5.55 0.85±0.01 18.37±0.21
9 45 200
LR2 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
LR4 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
LR5 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
T1 1.38±0.19 0.32±0.04 62.75±6.93 0.08±0.03 4.33±0.17 LR2, Candida glabrata; LR4, Candida tropicalis; LR5, Candida glabrata; y T1 Candida glabrata.
El tratamiento 9, como al igual que la cepa LR2 y LR4, no fue favorable para la producción de alcohol para la cepa LR5. Se destaca el tratamiento 2 (40o C y 0 rpm) que a las 12 h se obtiene la mayor concentración en comparación al resto de los tratamientos. Para la cepa T1 (figura
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
71 18d), las condiciones de 35o C y 200 rpm fueron las más adecuadas para su crecimiento, así como para la producción de alcohol, ya que obtiene la mayor producción de alcohol a las 4 h donde mantiene la misma concentración hasta las 20 h donde se observa una ligera disminución.
Con respecto a los resultados de los parámetros cinéticos de producción (tabla 13), se tiene que a la cepa LR2 le favorece el tratamiento 8 (40o C y 200 rpm) produciendo 9.40 ± 0.21 g/L de alcohol seguido por el tratamiento 3 (45o C y 0 rpm) con 8.70 ± 0.81g/L de alcohol, donde entre estos tratamientos no hubo una diferencia significativa. Para la cepa LR4 y LR5 les favoreció el tratamiento 1 (35o C y 0 rpm) donde se obtuvo 8.00 ± 0.07g/L y el tratamientos 2 (40o C y 0 rpm) con 9.31 ± 0.07g/L de alcohol, respectivamente. Para la cepa T1 se aprecia que con el tratamiento 4 (35o C y 100) y el 7 (35o C y 200rpm) se obtiene una concentración máxima de alcohol de 8.90 ± 0.16g/L por lo que estos tratamientos favorecerían la producción de alcohol en medio YPD para esta cepa.
La mayor eficiencia fue para la cepa LR2 en el tratamiento 8 (40o C y 200 rpm) que fue de 98.03 ± 2.77 % seguido de la cepa LR5 donde en el mismo tratamiento obtuvo una eficiencia del 96.10 ± 6.93%. Existen reportes de la utilización de microorganismos en medio YPD para conocer la capacidad de producción de alcohol, la cepa LR2 presenta una eficiencia (98.03 ± 2.77 %) similar a la reportada por López-Álvarez y col., (2012) donde utilizan una cepa silvestre Kluyveromyces marxianus para la producción de etanol con una eficiencia del 98%.
La cepa LR5 presenta una eficiencia (96.10 ± 6.93%) ligeramente más baja que la reportada por Hayashi y col., (2011) que utilizan una cepa mutante Zymomones mobilis con deficiencia respiratoria, donde obtienen una eficiencia del 97.4 %. Pero ambas cepas (LR2 y LR5) presentan una eficiencia superior a la cepa Saccharomyces cerevisiae modificada genéticamente que presenta una eficiencia del 76.5 %, reportada por Govindaswamy y Vane (2007). Los análisis de varianza realizados se resumen con los gráficos de Pareto (figura 19) y de interacción para cada una de las cepas probadas. En la figura 19a, para la respuesta de producción de alcohol para la cepa LR2 se observa que la interacción de la temperatura y
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
72 agitación tiene un efecto significativo en la respuesta, así como en la eficiencia (figura 19b) en la producción de alcohol.
Para la producción máxima (Pmáx) (figura 19c) se observa que solo la temperatura tiene un efecto significativo en la variable. Con el gráfico de interacción (figura 19d) se obtuvo que las condiciones más adecuadas para la obtención de la mayor producción de alcohol en promedio sería utilizando una temperatura de 40o C y una agitación de 200 rpm, seguido por las condiciones de 45o C y 0 rpm.
Figura 19. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) eficiencia, c) Pmáx y d) gráfica de interacción para producción de alcohol para la cepa LR2 en medio YPD
En la figura 20, para las respuestas de producción de alcohol, Pmáx y eficiencia de la cepa LR4 se observa que la temperatura es el principal factor que influye en éstas respuestas. En la gráfica de interacción se observa que los mejores resultados de producción de alcohol en promedio se podrían obtener a las temperaturas de 35, 40 o 45o C con 0 rpm.
En la figura 21a, para las respuestas de producción de alcohol para la cepa LR5 se observa que la temperatura, la agitación y su interacción tienen un efecto significativo sobre la respuesta. Para la eficiencia (figura 21b) en la producción de alcohol la temperatura y la
Gráfica de Pareto para producción de alcohol (g/L)
Efectos estandarizados
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
A:Temperatura B:Agitación AB
+ -
Gráfica de Pareto para Eficiencia
Efectos estandarizados
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
B:Agitación A:Temperatura AB
+ -
Gráfica de Pareto para Pmáx
Efectos estandarizados
0 1 2 3 4
B:Agitación AB A:Temperatura
+ -
Gráfica de interacción
Temperatura (oC)
Producción de alcohol (g/L)
Agitación 0 100 200
0 2 4 6 8 10
35 40 45
a) b)
c) d)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
73 interacción tienen un efecto significativo sobre la respuesta. En ambas respuestas se observa que el mayor efecto lo tiene la temperatura.
Figura 20. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) eficiencia, c) Pmáx y d) gráfica de interacción para producción de alcohol para la cepa LR4 en medio YPD
Para la Pmáx (figura 21c) no se observó un efecto significativo por los factores empleados. Con la gráfica de interacción (figura 21d) se observa que los mejores resultados de producción de alcohol en promedio se podrían obtener utilizando las condiciones de temperatura de 40o C y 0 rpm.
Al igual que la cepa LR4, en la cepa LR5 se obtiene la mayor producción sin una agitación en el sistema, esto podría deberse a que la fermentación alcohólica se da en anaerobiosis (Kosaric y col., 2001) debido a la baja difusión de oxígeno en el medio evitando que la ruta metabólica se dirija al crecimiento en alta concentración del microorganismo (Van Maris y col., 2006).
Gráfica de Pareto para producción de alcohol (g/L)
Efectos estandarizados
0 1 2 3 4 5
AB B:Agitación A:Temperatura
+ -
Gráfica de Pareto para eficiencia
0 1 2 3 4 5
Efectos estandarizados AB
B:Agitación A:Temperatura
+ -
Gráfica de Pareto para Pmáx
0 2 4 6 8
Efectos estandarizados AB
B:Agitación A:Temperatura
+ -
Gráfica de interacción
Temperatura (oC)
Producción de alcohol (g/L)
Agitación 0 100 200
0 2 4 6 8 10
35 40 45
a) b)
c) d)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
74
Figura 21. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) eficiencia, c) Pmáx y d) gráfica de interacción para producción de alcohol para la cepa LR5 en medio YPD
En la figura 22a, para las respuestas de producción de alcohol para la cepa T1 se observa que la temperatura, la agitación y su interacción tienen un efecto significativo sobre la respuesta, donde la temperatura presenta el mayor efecto sobre la producción de alcohol.
Para la eficiencia (figura 22b) en la producción de alcohol se obtuvo que los factores de temperatura, agitación y su interacción tienen un efecto significativo sobre la respuesta, donde la agitación presenta el mayor efecto. Para la Pmáx (figura 22c), solo la temperatura y la agitación tienen un efecto significativo sobre la obtención de la mayor productividad en la producción de alcohol.
Con la gráfica de interacción (figura 22d) se observa que la temperatura de 35o C con una agitación de 0, 100 o 200 rpm podría obtener la mayor producción de alcohol en promedio, seguido de 40o C y 200 rpm, en este caso para la cepa T1 le beneficia una alta agitación.
Gráfica de Pareto para producción de alcohol (g/L)
0 1 2 3 4 5
Efectos estandarizados B:Agitación
AB A:Temperatura
+ -
Gráfica de Pareto para eficiencia
0 1 2 3 4
Efectos estandarizados B:Agitación
AB A:Temperatura
+ -
Gráfica de Pareto para Pmáx
Efectos estandarizados
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4
B:Agitación AB A:Temperatura
+ -
Temperatura (oC)
Producción de alcohol (g/L)
Agitación 0 100 200 Gráfica de interacción
0 2 4 6 8 10
35 40 45
a) b)
c) d)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
75
Figura 22. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) eficiencia, c) Pmáx y d) gráfica de interacción para producción de alcohol para la cepa T1 en medio YPD
Con los resultados cinéticos obtenidos y con base al análisis estadístico correspondiente, se determinaron las condiciones más adecuadas tanto para el crecimiento como para la fermentación alcohólica de las distintas cepas (tabla 14).
Tabla 14. Condiciones de fermentación más adecuadas obtenidas a partir de los resultados cinéticos y estadísticos
Cepas Crecimiento poblacional Producción de alcohol
LR2 (Candida glabrata)
35o C, 200 rpm
45o C, 0 rpm
LR4 (Candida tropicalis) 35o C, 0 rpm
LR5 (Candida glabrata) 40o C, 0 rpm
T1 (Candida glabrata) 35o C, 200 rpm
Las cuatro cepas presentaron resultados favorables para el crecimiento utilizando las condiciones de 35o C y 200 rpm, aunque la cepa LR4 se destaca entre ellas. Mientras que para la etapa de fermentación hubo una diferencia en las condiciones necesarias para obtener la mayor concentración del metabolito. La característica de termotolerancia observada en la cepa
Gráfica de Pareto para producción de alcohol (g/L)
Efectos estandarizados
0 1 2 3 4 5
AB B:Agitación A:Temperatura
+ -
Gráfica de Pareto para eficiencia
Efectos estandarizados
0 1 2 3 4 5 6
A:Temperatura AB B:Agitación
+ -
Gráfica de Pareto para Pmáx
Efectos estandarizados
0 2 4 6 8
B:Agitación AB A:Temperatura
+ -
Temperatura (oC)
Producción de alcohol (g/L)
Agitación 0 100 200 Gráfica de interacción
0 2 4 6 8 10
35 40 45
a) b)
c) d)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
76 LR2 la hace atractiva para ser empleada en procesos fermentativos a nivel industrial en climas tropicales.
7.3 Obtención del perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados en