Cromatografía de Líquidos acoplado a Masas/Masas…

El uso de la Cromatografía de Líquidos acoplado a Masas/Masas (LC-MS/MS) se ha incrementado en las dos últimas décadas, principalmente para monitorear las concentraciones de fármacos en fluidos biológicos. Su alta especificidad, sensibilidad y su capacidad de multianálisis hacen de ésta técnica una alternativa ideal comparada con el inmunoanálisis o la convencional Cromatografía de Líquidos acoplado a un detector ultravioleta-visible (Sze-Yin y Mei-Wah, 2014; Lee, 2012 ).

La espectrometría de masas es una técnica analítica que nos permite separar, caracterizar y/o cuantificar diversas moléculas con base a su relación masa/carga (m/z) (Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2014; Sze-Yin y Mei-Wah, 2014). Para tal fin, las moléculas deben ser introducidas en estado gaseoso al espectrómetro de masas e ionizarse; éstas son separadas por efecto de la acción combinada de radiofrecuencias y/o diferencias de potencial eléctrico (voltaje). Un aspecto muy importante para el funcionamiento de los equipos LC-MS/MS, es el alto vacío (hasta 10^-

8 Pa) en que los iones son analizados, para evitar su interacción y pérdida. Una vez que las moléculas en su forma ionizada y en estado gaseoso, pueden desplazarse por el analizador y son dirigidos e impactan en un detector que transforma la frecuencia e intensidad de choque, en un impulso eléctrico que será transformado por el software de cada equipo en una señal proporcional a la abundancia iónica de la molécula (Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2014). Los componentes principales de un espectrómetro de masas y sus variables son (Figura 8): a) sistema de introducción de la muestra, b) fuente de ionización, c) analizador de masas, d) detector y e) computadora (Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2014; Sze-Yin y Mei- Wah, 2014).

Los sistemas de introducción de muestras acoplados a un espectrómetro de masas dependen de la naturaleza de las moléculas a analizar y del estado físico de las

muestras. Considerando que las moléculas deben ingresar al analizador en estado gaseoso, los diversos tipos de sistemas de interés farmacéutico son: la Cromatografía de Gases (CG) y la Cromatografía de Líquidos (HPLC o UPLC) (Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2014).

Figura 8. Esquema de un Espectrómetro de masas y las variables en cada uno de sus componentes. Adaptada de Kelvin Sze-Yin Leung yBonnie Mei-Wah Fong, 2014.

Existen diversas técnicas de ionización, tales como; Ionización por Electrospray (ESI), Ionización Química a Presión Atmosférica (APCI), Foto-ionización a Presión Atmosférica (APPI), Ionización por Desorción con Láser Asistida por Matriz (MALDI) (Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2014; Sze-Yin y Mei-Wah, 2014; Lee, 2012). En este proyecto de tesis se trabajó con la ionización tipo ESI, la cual se describe a continuación.

• Ionización por Electrospray (ESI): en este tipo de ionización se forma un circuito eléctrico entre la punta metálica de la fuente de ionización y la entrada del analizador. A medida que la muestra va eluyendo por el extremo de la fuente, se forma un cono biconvexo (Cono de Taylor) por el efecto conjunto del voltaje aplicado en dicho circuito y el flujo de un gas acarreador inerte (usualmente nitrógeno) y al

final del cono, se forma un rocío (Electrospray) que liberará pequeñas gotas de fase móvil conteniendo cierto número de moléculas ionizadas (la muestra ya va ionizada en el medio liquido por efecto del pH del medio y el pKa de las moléculas disueltas).

A medida que las gotas van avanzando hasta Ia entrada del analizador, éstas se van desolvatando y como consecuencia de Ia disminución en su volumen llega un momento en que los iones con la misma carga están tan juntos que se repelen (explosión Coulombica), quedando los iones completamente aislados (Figura 9). La eficiencia de este tipo de ionización es afectada por la calidad de la aspersión, el pH del medio, el voltaje aplicado y la presencia de compuestos que inhiban la ionización (contra iones, fosfolípidos, sales no volátiles). Este tipo de ionización es también muy eficiente y puede evaporar flujos de hasta 500 μL/min, característicos de la Cromatografía de Líquidos de Ultra Alta Eficacia (UPLC; Ultra Performance Liquid Chromatography, por sus siglas en inglés) (Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2014; Lee, 2012).

Figura 9. Mecanismo de Ionización por Electrospray. Adaptada de Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2014.

En relación a los analizadores, existen diversos sistemas tales como: los triple cuadrupolo, trampa de iones y tiempo de vuelo. En este proyecto de tesis, se trabajó con el analizador de masas en un sistema de triple cuadrupolo (Q1, Q2 y Q3), donde la

detección se realiza en modo de Monitoreo de Reacción Múltiple (MRM; Multiple Reaction Monitoring, por sus siglas en ingles). La característica primordial de los cuadrupolos en tándem, es que son dos cuadrupolos conectados en serie, divididos por una celda de colisión en donde los iones filtrados por el primer cuadrupolo (Q1, ion precursor) son fragmentados al chocar con un gas inerte (nitrógeno o argón) en la celda de colisión (Q2). El patrón de fragmentación obtenido de cada molécula, y los fragmentos obtenidos (ion fragmento) pueden volver a ser filtrados en el tercer cuadrupolo (Q3) (Figura 10). Lo anterior tiene Ia ventaja de generar métodos cuantitativos sensibles y selectivos, además de brindar información estructural de Ia molécula analizada (Grebe y Ravinde, 2011; Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2014).

Figura 10. Analizador de masas triple cuadrupolo en modo de Monitoreo de Reacción Multiple.

Adaptada de Grebe Stefan KG y Ravinder J Singh, 2011.

La LC-MS/MS empleando como fuente de ionización Electrospray y como analizador de masas un triple cuadrupolo, tiene una amplia aplicación en moléculas de elevado peso molecular (100-2000 uma) y extremadamente polares, es una herramienta poderosa en la cuantificación de fármacos a concentraciones muy bajas y en diversos tipos de matriz biológica (plasma, suero, sangre, orinas, entre otras) en aplicaciones clínicas tales como; 1) monitoreo de fármacos y drogas, 2) toxicología, 3) metabolismo de fármacos, 4) cuantificación de proteínas, entre otras (Sze-Yin y Mei-Wah, 2014; Grebe y Ravinde, 2011). Debido a la naturaleza de las matrices biológicas más comunes usadas en el monitoreo de fármacos, es necesario realizar un tratamiento previo a su análisis por LC-

MS/MS, inyectar directamente la muestra puede inhibir la ionización del analito de interés y generar un rápido deterioro del equipo (Sze-Yin y Mei-Wah, 2014), por lo tanto en este proyecto de tesis se estandarizaron las condiciones de tratamiento de la muestra.