Validación del método analítico

estándar interno (muestra cero, MTA CERO). También deberán de procesarse muestras blanco (MTA BCO) para: plasma lipémico y hemolizado, adicionado con anticoagulantes (EDTA y Heparina de sodio) y una muestra por cada fármaco concomitante a una concentración final de 1µg/mL. Finalmente, preparar una muestra del Límite Inferior de cuantificación (LIC, 0.100 µg/mL). Procesar las muestras de acuerdo al método de extracción. Inyectar al sistema LC-MS/MS cada muestra preparada.

8.4.2.2. Criterio de aceptación: comparar las respuestas obtenidas (área) para cada muestra contra el LIC en los tiempos de retención del analito o del estándar interno y determinar si existe interferencia. Las muestras blancos no deben presentar interferencias en los tiempos de retención para el analito mayores del 20.0% y no más del 5.0% para el estándar interno.

Las muestras cero no deben presentar interferencias en los tiempos de retención para el analito mayores del 20.0%, comparando cada muestra contra la muestra LIC.

8.4.3. Efecto de acarreo.

8.4.3.1. Preparación: preparar una muestra blanco, un LIC y una muestra del Límite Superior de Cuantificación (LSC, 100 µg/mL). Procesar las muestras de acuerdo al método de extracción. Inyectar al sistema LC- MS/MS cada muestra preparada realizando 3 inyecciones de la misma muestra blanco, una antes y dos después de la inyección del LSC, al último inyectar la muestra LIC.

8.4.3.2. Criterio de aceptación: las muestras blanco no deben presentar interferencias a los tiempos de retención para el analito mayores del 20.0% y no más del 5.0% para el estándar interno. Comparando con la muestra LIC.

8.4.4. Efecto Matriz.

8.4.4.1. Preparación: preparar en solución 5 mL de las Muestras Control Bajo (MCB) y Alto (MCA) de Leuprolide, adicionando IS, tomando en cuenta la concentración final después de realizar el proceso de extracción, inyectar 3 réplicas de cada nivel en solución. Procesar muestras blanco de cada lote de plasma utilizado para la preparación del pool de plasma de acuerdo al método de extracción en suficientes cantidades para preparar 3 muestras de MCB y MCA, se debe de analizar plasma hemolizado y lipémico. Reconstituir las muestras blanco con solución diluyente adicionadas a los niveles MCB y MCA y con IS.

8.4.4.2. Criterio de aceptación: determinar el Factor Respuesta de cada muestra y

%CV del Factor Matriz Normalizado debe ser ≤15.0% para cada nivel evaluado (MCB y MCA).

8.4.5. Linealidad e Intervalo del Método.

8.4.5.1. Preparación: realizar esta prueba con al menos tres curvas de calibración diferentes, cada curva debe llevar sus Muestras Blanco (MTA BCO y MTA CERO). Las concentraciones de la curva corresponden a las descritas en la Figura 13. Procesar las muestras de acuerdo al método de extracción e inyectar al sistema LC-MS/MS cada muestra preparada.

8.4.5.2. Calcular para cada muestra el área de los picos cromatográficos, así como el por ciento de Desviación (%Desv.), concentración calculada, coeficiente de correlación (r) y coeficiente de determinación (r²) de cada curva de calibración y de las tres curvas de calibración.

8.4.5.3. Con los datos de linealidad llevar a cabo la prueba de homocedasticidad mediante la F de Fisher (FCalculada= s²LSC/ s²LIC, FTablas= gl1, gl2, α= 0.01), la prueba de residuales. Posteriormente evaluar la curva de calibración sin ponderación, con ponderación 1/x y ponderación 1/x².

8.4.5.4. Criterio de aceptación:

8.4.5.4.1. Determinar si el comportamiento es de homocedasticidad ó heterocedasticidad mediante la prueba F de Fisher.

8.4.5.4.2. La ponderación que produce la suma de menor desviación y el mayor coeficiente de correlación, será elegida como el modelo matemático más apropiado

8.4.5.4.3. Coeficiente de correlación r ≥ 0.99.

8.4.5.4.4. Coeficiente de determinación r² ≥ 0.98.

8.4.5.4.5. Al menos 75% de las concentraciones de la curva de calibración con un mínimo de 6 puntos deben estar dentro del ± 15.0% de la concentración nominal en cada nivel de concentración, excepto para el límite inferior de cuantificación, ya que puede ser de ± 20.0%.

8.4.5.4.6. Del total de las curvas evaluadas el 50% de cada nivel de concentración debe estar dentro del ± 15.0% de la concentración nominal en cada nivel de concentración, excepto para el LIC, ya que puede ser de ± 20.0%.

8.4.5.4.7. Los extremos de la curva de calibración, LIC y LSC, no podrán excluirse en ninguna de las curvas de calibración.

8.4.5.4.8. Las muestras blanco no deben presentar interferencias a los tiempos de retención para el analito mayores del 20.0% y no más del 5.0%

para el estándar interno. Comparando con la muestra LIC.

8.4.6. Límite Inferior de Cuantificación (LIC).

8.4.6.1. Preparación: el LIC es la mínima concentración a la cual el analito puede ser cuantificado con precisión y exactitud. No debe ser mayor de 5% del valor de Cmáx reportado para Leuprolide; 13.09 ± 6.16 µg/mL. Los datos obtenidos para esta prueba se tomarán a partir de las inyecciones correspondientes a las pruebas de Repetibilidad y Reproducibilidad.

8.4.6.2. Criterio de aceptación: el %CV y el %Desv. global no debe ser mayor al

20.0% para el analito.

8.4.7. Precisión y Exactitud del método: en cada ensayo con el área cromatográfica de los picos obtener el Factor de Repuesta, así como coeficiente de correlación (r) y coeficiente de determinación (r²) de la curva de calibración, la concentración calculada, % Desv y %CV de cada nivel de MC y muestra LIC. Cada curva de calibración debe de cumplir con los criterios de aceptación establecidos en los numerales 8.4.5.4.3 al 8.4.5.4.8.

8.4.7.1. Repetibilidad: evaluar en una sola determinación. La dilución de muestras no debe interferir con la precisión y exactitud del método.

8.4.7.1.1. Preparación: preparar una curva de calibración, una MTA BCO, una MTA CERO y 6 muestras de cada uno de los 6 niveles siguientes: LIC, MCB, MCM-1 (Muestra Control Medio 1), MCM-2 (Muestra Control Medio 2), MCA y MCD (Muestra Control Diluida).

8.4.7.1.2. Solución concentrada: tomar una alícuota de 750 µL de la solución de trabajo de Leuprolide (20 μg/mL) y diluir con 1.25 mL de solución diluyente, volumen final 2.0 mL y mezclar hasta que la solución sea homogénea. Esta solución tiene una concentración de 7,500 ng/mL de Leuprolide.

8.4.7.1.3. MCD: tomar una alícuota de 50 µL de la solución anterior y transferir a un tubo liso, adicionar 950 µL de plasma libre de fármaco. De la muestra anterior tomar 6 alícuotas de 160 µL y transferir cada una de ellas en un tubo de vidrio respectivamente, diluir con 640 µL de plasma libre de fármaco para alcanzar la concentración de MCA (75.000 ng/mL).

8.4.7.1.4. Procesar las muestras de acuerdo al método de extracción. Inyectar al sistema LC-MS/MS cada muestra.

8.4.7.1.5. Criterio de aceptación: el %CV no debe ser mayor del 15.0% para

cada nivel, excepto para el LIC que debe ser menor o igual del 20.0%.

8.4.7.2. Reproducibilidad: evaluar estos parámetros por lo menos en tres corridas con al menos dos analistas diferentes en dos días distintos.

8.4.7.2.1. Preparación: preparar una curva de calibración, una MTA BCO, una MTA CERO y 6 muestras de cada uno de los 5 niveles siguientes: LIC, MCB, MCM-1, MCM-2, MCA. Procesar las muestras de acuerdo al método de extracción e inyectar al sistema LC-MS/MS cada muestra.

8.4.7.2.2. Criterio de aceptación: el %CV no debe ser mayor del 15.0% para cada nivel, excepto para el LIC que debe ser menor o igual del 20.0%.

8.4.7.3. Reproducibilidad Extendida: esta prueba consiste en una simulación de las muestras de voluntarios que se planean analizar por corrida analítica, se pretende evaluar el efecto de las muestras en plasma a través del tiempo que dura la corrida, por lo que en lugar de muestras de voluntarios se emplean muestras blanco.

8.4.7.3.1. Preparación: preparar una serie de muestras control a cada uno de los 4 niveles siguientes: MCB, MCM-1, MCM-2 y MCA (una serie por cada voluntario), así como una curva de calibración en matriz biológica, una MTA BCO, una MTA CERO. Procesar las muestras de acuerdo al método de extracción e inyectar al sistema LC-MS/MS cada muestra.

8.4.7.3.2. Criterio de aceptación: al menos dos terceras partes del total de las muestras control debe cumplir con los criterios de %Desv ± 15.0%.

8.4.7.4. Exactitud del método: evaluar la exactitud intra e inter corrida, calcular a partir de las mismas corridas efectuadas para evaluar la precisión del método; pruebas de Repetibilidad y Reproducibilidad.

8.4.7.4.1. Criterio de aceptación: el % Desv no debe ser mayor al ±15.0% del

valor nominal para todos niveles de muestra control, excepto para el LIC que no debe ser mayor del ±20.0%.

8.4.8. Estabilidades: determinar las condiciones de temperatura y de tiempo, entre otras, en las que el compuesto permanezca estable en la matriz biológica, para asegurarse que las condiciones experimentales y de almacenamiento no afectan la integridad del analito desde el principio hasta el final del estudio. Evaluar las estabilidades; a tiempo cero, a largo plazo (ELP), temperatura ambiente (ETA), ciclos de congelación-descongelación (ECD), muestra procesada almacenada en refrigeración (EMP) y almacenada en el automuestreador (EMPA).

8.4.8.1. Criterio de aceptación: el %CV de todas las muestras MC evaluadas debe ser no mayor de 15.0%. Al menos dos terceras partes del total de las muestras control debe cumplir con los criterios de %Desv ± 15.0%.

8.4.8.1.1. MC estabilidad tiempo cero: preparar solo con Leuprolide el volumen suficiente de muestra plasmática en los niveles de MCB y MCA para obtener las muestras que serán evaluadas en todas las estabilidades, tomar adicionalmente 3 alícuotas de cada nivel (MCB y MCA).

Procesar las muestras de acuerdo al método de extracción e inyectar al sistema LC-MS/MS cada muestra.

8.4.8.1.2. MC Estabilidad Largo Plazo (ELP): preparar solo con Leuprolide 3 réplicas de MC a los niveles MCB y MCA, y almacenar en las mismas condiciones que las muestras del estudio (Ultracongelador a -70±10

°C), al menos por el tiempo transcurrido desde la primer toma de muestra hasta su análisis de la última muestra. Procesar las muestras el día que serán evaluadas de acuerdo al método de extracción, junto con una curva de calibración, una MTA BCO, una MTA CERO y 3 muestras de cada uno de los siguientes niveles: MCB y MCA. Inyectar

al sistema LC-MS/MS cada muestra.

8.4.8.1.3. MC Estabilidad ciclos de Congelación-Descongelación (ECD):

preparar solo con Leuprolide 3 réplicas de MC a los niveles MCB y MCA, y someter a 3 ciclos de congelación-descongelación en las mismas condiciones de congelación que estarán las muestras del estudio (Ultracongelador -70±10 °C). Se debe evaluar la estabilidad de 3 ciclos, cada ciclo de congelación-descongelación debe cumplir con al menos 12 horas de congelación. Procesar la muestras de acuerdo al método de extracción, el día del tercer ciclo de congelación- descongelación, e inyectar al sistema LC-MS/MS cada muestra. Si se requieren evaluar más ciclos de congelación – descongelación se pueden validar.

8.4.8.1.4. MC Estabilidad Temperatura Ambiente (ETA): preparar solo con Leuprolide 3 réplicas de MC a los niveles MCB y MCA, y dejarlas a temperatura ambiente por lo menos 4 horas, transcurrido éste tiempo, procesar las muestras de acuerdo al método de extracción e inyectar al sistema LC-MS/MS cada muestra.

8.4.8.1.5. MC Estabilidad Muestra Procesada (EMP y EMPA): preparar dos series solo con el analito de interés de 3 réplicas de MC a los niveles MCB y MCA, y procesar las muestras de acuerdo al método de extracción. Almacenar una serie en refrigeración (2-8°C) 24±12 h y otra serie en el Automuestreador (10 °C) por el mismo tiempo.

Transcurrido este tiempo evaluar inyectando las dos series de muestras al sistema LC-MS/MS.

8.4.9. Tolerancia: para evaluar este parámetro del método se evalúa con una reproducibilidad el cambio de columna cromatográfica de las mismas especificaciones establecidas en el método analítico, y el cambio de cartuchos HLB de 30 mg a cartuchos HLB de 10 mg.

8.4.9.1. Cambio de columna cromatográfica: preparar una curva de calibración, una MTA BCO, una MTA CERO y 6 muestras de cada uno de los 5 niveles siguientes: LIC, MCB, MCM-1, MCM-2 y MCA. Procesar las muestras de acuerdo al método de extracción e inyectar al sistema LC-MS/MS cada muestra bajo las condiciones establecidas, estas muestras servirán como referencia y deberán cumplir con los criterios de aceptación establecidos para esta prueba. Posteriormente, reinyectar las mismas muestras, precedida de una adecuabilidad, con el cambio de la columna cromatográfica de las mismas especificaciones pero diferente número de lote.

8.4.9.2. Cambio de cartuchos: preparar una curva de calibración, una MTA BCO, una MTA CERO y 6 muestras de cada uno de los 5 niveles siguientes:

LIC, MCB, MCM-1, MCM-2 y MCA, para procesar con los cartuchos de 30 mg y de 10 mg el mismo número de muestras. Estas muestras deberán ser preparadas el mismo día y procedentes del mismo origen. Procesar las muestras de acuerdo al método de extracción e inyectar al sistema LC- MS/MS.

8.4.9.3. Criterio de aceptación:

8.4.9.3.1. Al menos 75% de las concentraciones de la curva de calibración con un mínimo de 6 puntos deben estar dentro del ±15.0% de la concentración nominal en cada nivel de concentración, excepto para el límite inferior de cuantificación, ya que puede ser de ±20.0%.

8.4.9.3.2. Coeficiente de correlación r ≥ 0.99.

8.4.9.3.3. Coeficiente de determinación r² ≥ 0.98.

8.4.9.3.4. Las muestras blanco no deben presentar interferencias a los tiempos de retención para el analito mayores del 20.0% y no más del 5.0%

para el estándar interno. En la muestra cero no deberá presentar interferencias a los tiempos de retención para el analito mayores del

20.0% comparando con la muestra LIC.

8.4.9.3.5. El %CV no debe ser mayor del 15.0% para cada nivel de muestra control, excepto para el LIC que no debe ser mayor del 20.0%.

8.4.9.3.6. El % Desv no debe ser mayor al ±15.0% del valor nominal para todos niveles de muestra control, excepto para el LIC que no debe ser mayor del ±20.0%.

8.4.10. Recobro: evaluación de la eficiencia del método analítico para extraer Leuprolide y estándar interno (O-Desacetildiltiazem) de la matriz biológica, mediante la comparación de muestras blanco procesadas y reconstituidas con solución que contengan al analito y al estándar interno con las muestras control procesadas (extraídas).

8.4.10.1. Preparación: procesar por sextuplicado todas las concentraciones de las muestras control en matriz biológica (MCB, MCM-1, MCM-2 y MCA) conteniendo Leuprolide y el estándar interno. Junto con las muestras control deberán procesarse 24 muestras blanco suficientes para inyectar por sextuplicado las muestras blanco adicionadas con la solución del analito y el estándar interno (muestras blanco adicionadas).

8.4.10.2. Preparar las soluciones de cada muestras control que contengan al analito y al estándar interno, para reconstituir las muestras blanco procesadas, considerando el factor de dilución de la muestra.

8.4.10.3. Procesar las muestras de acuerdo al método de extracción e inyectar al sistema LC-MS/MS.

8.4.10.4. El recobro deberá evaluarse con ambos cartuchos HLB (30 y 10 mg).

8.4.10.5. Criterio de aceptación: el valor obtenido no tiene que estar en un intervalo de porcentajes, pero debe ser reproducible en los niveles evaluados, lo cual es determinado con el %CV de no más del 15.0%.

8.4.11. Estabilidad de soluciones Stock y de Trabajo: emplear las soluciones de

trabajo y stock preparadas en el Desarrollo del método analítico, las cuales servirán como soluciones de prueba.

8.4.11.1. Criterio de aceptación: el % de Desviación obtenido de la comparación del promedio de las áreas entre la solución de referencia y la solución de prueba, debe estar dentro del intervalo de ±10%, el CV% de las réplicas debe ser menor al 15.0%.

8.4.11.2. Soluciones stock: al inicio de la validación pesar y preparar las soluciones Stock del analito y del estándar interno que servirán como referencia. Preparar la concentración del MCM-2 de las soluciones de prueba y de referencia. Realizar la dilución de la solución INT MCM 2 de Leuprolide (Figura 12) y del IS (O-Desacetil Diltiazem) para alcanzar la concentración del MCM-2 (Figura 13).

8.4.11.3. Soluciones de Trabajo: emplear las soluciones de trabajo preparadas en el Desarrollo del método analítico, las cuales servirán como soluciones de prueba. Al inicio de la validación preparar las soluciones de trabajo del analito y estándar interno que servirán como referencia, preparadas a partir de soluciones stock de recién preparación. Preparar la concentración del MCM-2 en las soluciones de prueba y de referencia.

Realizar la dilución de la solución INT MCM 2 de Leuprolide (Figura 12) y del IS (O-Desacetil Diltiazem) para alcanzar la concentración del MCM-2 (Figura 13).