CAPITULO I EVALUACIÓN DE LA EFECTIVIDAD BIOLOGICA DEL
5. RESULTADOS Y DISCUSION
4.2. Descripción de las variedades de semillas utilizadas
La prueba se desarrolló en variedades mejoradas de especies vegetales cultivadas: lechuga y jitomate.
LECHUGA (Figura 2)
Especie: Lactuca sativa, variedad: bola Familia: Asteraceae
Género: Lactuca
Nombre común: Lechuga
Proveedor de la semilla: Caloro Seed.
Germinación: 85%
Pureza: 98%
No. Lote: 785EMOR
Año de incremento de la semilla: 10/01/14
Fecha de aplicación de la prueba de germinación: 01/01/15
57 Figura. 2 Semillas de lechuga bola
JITOMATE (Figura 3)
Especie: Solanum lycopersicum, Hibrido CID F1.
Familia: Solanaceae Género: Solanum
Nombre común: Tomate rojo o jitomate.
Proveedor: Harris Moran Seed Company.
Germinación: 90%
Pureza: 99%
No. Lote: F13556
Año de incremento de la semilla: 2015
58 Figura 3. Semillas de jitomate saladette CID F1.
Para evaluar el efecto tóxico del medio resultante de la prueba de biodegradabilidad, se realizó el efecto potencial de este material sobre la germinación de semillas. Para tal efecto, la prueba de germinación se realizó colocando 20 semillas de lechuga y jitomate en dos placas de Petri (10 por placa) sobre un papel filtro, sobre el cual se agregó el medio resultante de la prueba de biodegradabilidad a diluciones del 50, 25, 10, 5, 1 y 0 % (sin dilución) (Figura 4).
Las cajas Petri con las semillas se incubaron a una temperatura ambiental de 25 °C ± 2 °C en el laboratorio de aseguramiento de calidad de la empresa BYOSS S.A. de C.V., en oscuridad durante cinco días, se observó la germinación de las semillas con las diluciones y los controles (figura 5, 6 y 7), se realizó la cuenta de semillas germinadas y se sacó el promedio (cuadro 2).
Se realizó una gráfica de las semillas germinadas a diferentes concentraciones para evaluar la posible inhibición de la germinación del 50% de las semillas, las cuales se muestran en la figura 8. Donde se observa la germinación las dos especies de semillas a diferentes diluciones del control de toxicidad (cuadro 1) resultante de la prueba OECD 301-A.
59 Para el análisis de varianza se utilizó el software estadístico minitab® versión 17. Considerándose como tratamientos las diferentes diluciones del control de toxicidad de la prueba OCDE 301-A y unidad experimentan 2 cajas Petri con 10 semillas cada una para las dos especies de semillas (jitomate y lechuga) con tres repeticiones. Usando en total 60 semillas por tratamiento.
Figura 4. Semillas en cajas Petri. De arriba a abajo: a) Lechuga. b) jitomate
60 Figura 5. Semillas de jitomate germinadas de arriba – abajo, de izquierda a derecha a) control de toxicidad al sin dilución, b) control de toxicidad a dilución del 50 %, c) control de toxicidad a dilución del 25 %, d) control de toxicidad a dilución del 10 %, e) control de toxicidad a dilución del 5%, f) control de toxicidad a dilución del 1 %.
61 Figura 6. Semillas de lechuga germinadas. De arriba - abajo, de izquierda a derecha a) control de toxicidad al sin dilución, b) control de toxicidad a dilución del 50 %, c) control de toxicidad a dilución del 25 %, d) control de toxicidad a dilución del 10 %, e) control de toxicidad a dilución del 5%, f) control de toxicidad a dilución del 1 %.
Figura 7. Control de semillas de A) lechuga y B) jitomate germinadas.
62 5. RESULTADOS Y DISCUSÓN
El promedio de las semillas germinadas se muestra en el cuadro 2 y 3 para jitomate y lechuga, respectivamente.
Cuadro 2. Promedio de germinación de las semillas de jitomate a diferentes diluciones del control de toxicidad (cuadro 1) resultante de la prueba OECD 301-A
JITOMATE
Diluciones del control de
toxicidad (%)
Plantas germinadas repetición 1
% de
germinación repetición 1
plantas germinadas repetición 2
% de
germinación repetición 2
plantas germinadas repetición 3
% de
germinación repetición 3
0 16 80 20 100 20 100
1 15 75 20 100 20 100
5 19 95 20 100 19 95
10 16 80 17 85 19 95
25 17 85 19 95 18 90
50 19 95 19 95 20 100
63 Cuadro 3. Promedio de germinación de las semillas de lechuga a diferentes diluciones del control de toxicidad (cuadro 1) resultante de la prueba OECD 301-A.
LECHUGA
Diluciones del
control de
toxicidad (%)
Plantas germinadas repetición 1
% de
germinación repetición 1
plantas germinadas repetición 2
% de
germinación repetición 2
plantas germinadas repetición 3
% de
germinación repetición 3
0 20 100 19 95 20 100
1 20 100 18 90 19 95
5 19 95 19 95 18 90
10 18 90 18 90 18 90
25 19 95 18 90 19 95
50 20 100 18 90 20 100
Se realizó una gráfica de las semillas germinadas a diferentes diluciones para evaluar la posible inhibición de la germinación del 50% de las semillas, las cuales se muestran en la figura 8. Donde se observa que los dos tipos de semillas a diferentes diluciones del control de toxicidad (cuadro 1) resultante de la prueba OECD 301-A germinan por arriba del 50% (10 semillas germinadas).
64 Figura 8. Germinación promedio de semillas de jitomate y lechuga a diferentes diluciones del control de toxicidad (cuadro 1) resultante de la prueba OECD 301-A.
Con el software estadístico Minitab® versión 17, Se evaluó los datos obtenidos de germinación que se muestran en el cuadro 4 (semillas de jitomate) y cuadro 5 (semillas de lechuga). Los resultados del ANOVA se observa en el cuadro 6 y 7 respectivamente.
0 1 5 10 25 50
Lechuga 20 20 19 18 19 20
Jitomate 16 15 19 16 17 19
0 5 10 15 20 25
SEMILLAS GERMINADAS
DILUCIÓN (%)
65 Cuadro 4. Datos obtenidos de la prueba de germinación de semillas de jitomate a diferentes diluciones del control de toxicidad.
Tratamientos
DILUCIÓN DEL CONTROL DE TOXICIDAD (%)
Repeticiones
PLANTAS GERMINADAS REPETICIÓN 1
PLANTAS GERMINADAS REPETICIÓN 2
PLANTAS GERMINADAS REPETICIÓN 3
0 16 20 20
1 15 20 20
5 19 20 19
10 16 17 19
25 17 19 18
50 19 19 20
Cuadro 5. Datos obtenidos de la prueba de germinación de semillas de lechuga a diferentes diluciones del control de toxicidad.
Tratamientos
DILUCIÓN DEL CONTROL DE TOXICIDAD (%)
Repeticiones
PLANTAS GERMINADAS REPETICIÓN 1
PLANTAS GERMINADAS REPETICIÓN 2
PLANTAS GERMINADAS REPETICIÓN 3
0 20 19 20
1 20 18 19
5 19 19 18
10 18 18 18
25 19 18 19
50 20 18 20
66 Cuadro 6. Análisis de varianza germinación de semillas de jitomate.
Fuente GL S. C C M Valor F cal. Valor p
Tratamiento 5 9.167 1.833 1.21 0.367
Bloque 2 20.33 10.167 6.76
Error 10 15.00 1.500
Total 17 44.50
95 % de confiabilidad (α = 0.05), Ftab = 3.326
En base a los resultados del análisis de varianza anteriores se observa que no existe diferencia estadística significativa entre los tratamientos dado que el valor de F calculada es menor que el valor de F tabulada ((Fig. 9), (Fcalc. 1.21
< F tab. 3.326)
Cuadro 7. Análisis de varianza germinación de semillas de lechuga
Fuente GL S. C C M Valor F cal. Valor p
Tratamiento 5 5.111 1.02 2.88 0.73
Bloque 2 3.11 1.55 4.37
Error 10 3.556 0.35
Total 17 11.778
95 % de confiabilidad (α = 0.05), Ftab = 3.326
En base a los resultados del análisis de varianza anteriores se observa que no existe diferencia estadística significativa entre los tratamientos dado que el valor de F calculada es menor que el valor de F tabulada ((Fig. 9), (Fcalc. 2.88
< F tab. 3.326)
67 Figura 9. Grafica de distribución, donde se observa el valor de F tabulada igual a 3.326, para germinación de semillas de jitomate
6. CONCLUSIONES
1.-La prueba de ecotoxicidad o toxicidad demostró que el líquido resultante del control de toxicidad en la prueba OCDE 301-A. en las diferentes diluciones utilizadas no presento actividad fitotóxica, ya que se encontró un porcentaje de germinación para cada especie de semillas superior al 50%.
De esta forma cumple el requisito en el parámetro de germinación considerado en el protocolo OECD 208.
2. El análisis de varianza mostró que no existe diferencia significativa, entre tratamientos (Diluciones del control de toxicidad OCDE 301-A) para las dos variedades de semillas (jitomate y lechuga)
68 7. LITERATURA CITADA
Adam, G., Duncan, H. 2002. Influence of diesel fuel on seed germination.
Environmental Pollution. 120, 363-370.
Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). 1984.
Terrestrial Plants, Growth Test. Guideline for Testing of Chemicals. No.
208. Paris, Francia.
Uribe, R. 2008. Ensayo de inhibición de la germinación y del alargamiento radicular en Evaluación de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con semillas 105 semillas de cebolla Allium cepa y soya Glycine max. 2008. En: Ramírez-Romero, P., Mendoza-Cantú, A.
(compiladoras). Ensayos toxicológicos para la evaluación de sustancias químicas en agua y suelo. La experiencia en México. Instituto Nacional de Ecología, Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales.
México.
Wang, W., Freemark, K. 1995. Use of plants for environmental monitoring and assessment. Ecotoxicology and Environmental Safety. 30, 289-301.
69 A N E X O S
ANEXO 1
MÉTODO DE PREPARACIÓN DEL 0,5 STANDARD DE MCFARLAND
Reactivos
1% Cloruro de Bario (BaCl2) anhídrido 1% Ácido sulfúrico (H2SO4) puro y frío Método de Preparación
1. Añadir 0,5 mL de BaCl2 al 1% a 99,5 mL de H2SO4 al 1%.
2. Mezclar completamente antes de proceder al siguiente paso.
3. Distribuya 5 mL de la solución de McFarland en tubos de diámetros similares.
Se sugiere usar los mismos tubos que se utilizan rutinariamente para ajustar la densidad de las suspensiones antes de la inoculación.
4. Cuando estos estándares están en suspensión completa, la turbidez equivale a un cultivo que contiene 1,5 x 108 células.
5. Los tubos que contienen la solución de 0.5 McFarland se deben guardar en un lugar oscuro, a temperatura ambiente.
70 ANEXO 2
OECD 301-A “Prueba de biodegradabilidad aerobia, disminución de carbono orgánico disuelto (COD)” 1992
Introducción
El contenido de carbono orgánico disuelto (COD) y la pureza o cantidades relativas de los principales componentes de la muestra deben preferentemente ser conocidos. La prueba radica en el uso de densidades microbianas altas.
Fundamento de la prueba
Un volumen determinado de medio mineral pre-inoculado, conteniendo una concentración conocida de la sustancia de prueba (entre 10 y 60 mg COD L-1) como única fuente de carbono orgánico, es mantenido con aireación constante en la oscuridad o con luz difusa a 22 2 °C. El curso de la degradación es monitoreado por medio de análisis de la concentración de COD a intervalos frecuentes de tiempo durante un periodo de 28 días. El grado de biodegradación es calculado a partir de la cantidad de COD removida (corregida por medio de un blanco de inóculo utilizado como control) con respecto al porcentaje de concentración inicialmente presente en el medio.
También puede calcularse la biodegradabilidad primaria del compuesto original por medio de análisis químicos suplementarios realizados al principio y al final del periodo de incubación.
Descripción del método
Equipo:
Matraces Erlenmeyer de 250 mL a 2 L, dependiendo del volumen necesario para realizar el análisis de COD. Los matraces deben ser cuidadosamente
71 limpiados, por ejemplo con solución de ácido clorhídrico-alcohol, enjuagados y secados antes de cada prueba.
Agitador para contener los matraces cónicos, con control automático de temperatura o a temperatura ambiente constante y con suficiente fuerza como para mantener condiciones aerobias en todos los matraces.
Aparato de filtración con membranas.
Analizador de COD
Medidor de oxígeno disuelto, para comprobar que los matraces se encuentran bajo condiciones aerobias.
Centrifuga Agua
Debe de utilizarse agua desionizada o destilada, libre de concentraciones inhibitorias de sustancias tóxicas (ejemplo CU2+) No debe de contener más de un 10% de carbono orgánico disuelto, pues introduciría un error a la sustancia de prueba. Se requiere agua con alta pureza para eliminar valores altos del blanco. La contaminación del agua puede ser causada por impurezas propias, por las resinas de intercambio iónico y material contaminado de bacterias y algas.
Para cada corrida de prueba, usar sólo lote de agua a la que previamente se le habrá determinado la concentración de COD presente.
Soluciones patrón de medio mineral
Solución a:
Fosfato monobásico de potasio, KH2PO4... 8.50 g Fosfato dibásico de potasio, K2HPO4...21.75 g Fosfato dibásico de sodio dihidratado, Na2HPO4 2H2O...33.40 g Cloruro de amonio, NH4Cl………0.50 g Disolver en agua y aforar a 1L. El pH de la solución deber ser de 7.4
72 Solución b:
Cloruro de calcio anhidro, CaCl2...27.50 g o
Cloruro de calcio dihidratado, CaCl2 2H2O……...………36.40 g Disolver en agua y aforar a 1 L
Solución c:
Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO4 7H2O………..22.50 g Disolver en agua y aforar a 1 L
Solución d:
Cloruro de hierro (III) hexadidratado, FeCl3 6H2O………..0.25 g Disolver en agua y aforar a 1 L
Preparación del medio mineral
Mezclar 10 mL de solución (a) con 800 mL de agua, añadir 1 mL de solución (b), (c) y (d). Aforar a 1 L con agua.
Soluciones patrón de sustancia de prueba
Cuando la solubilidad de sustancia de prueba excede 1 g L-1, disolver 1-10 g, de sustancia de prueba o de referencia en agua y aforar a 1 L. Otra opción es preparar soluciones patrón en medio mineral o añadir la sustancia directamente al medio mineral, permitiendo su completa disolución antes de continuar con el procedimiento de montaje. (Acetato de sodio o Biftalato de potasio)
Inóculo
El inóculo puede derivarse de una gran variedad de fuentes: lodos activados, efluentes de aguas residuales, aguas superficiales, suelo o una mezcla de éstos.
73 Inóculo a partir de lodos activados
Colectar una muestra fresca de lodos activados, a partir de un tanque de aireación de planta de tratamiento de aguas residuales o un reactor a escala de laboratorio que trate principalmente aguas residuales domésticas. Si es necesario, remover las partículas gruesas por filtración a través de un tamiz fino y mantener el lodo bajo condiciones aerobias.
Alternativamente, después de retirar las partículas gruesas, centrifugar (por ejemplo 1100 g durante 10 minutos). Descartar el sobrenadante. El lodo debe ser lavado con medio mineral. Re-suspender el lodo concentrado en medio mineral para obtener una concentración final de 3-5 g de solidos suspendidos L-1. Mantener en aireación hasta su uso.
Una alternativa es homogenizar el lodo activado para obtener una concentración de 3-5 g de solidos suspendidos L-1. Tratar el lodo en una mezcladora por a velocidad media durante 2 minutos. Dejar sedimentar el lodo mezclado por 30 minutos o más si se requiere, decantar el líquido que será utilizado como inóculo (10 mL L-1 de medio mineral).
Pre-acondicionamiento del inóculo
El inóculo puede ser pre-acondicionado, pero no pre-adaptado a la sustancia de prueba. El pre-acondicionamiento consiste en mantener en aireación el lodo activo (en medio mineral) o en el efluente secundario por 5 – 7 días a temperatura ambiente (22 °C 2). El pre-acondicionamiento en ocasiones provee de precisión al método de prueba, disminuyendo el valor del blanco.
Preparación de matraces
74 A modo de ejemplo: tomar 800 mL de medio mineral y colocarlos en matraces de 2 litros, añadir el volumen suficiente de solución patrón de la sustancia de prueba y de referencia, según corresponda, para obtener una concentración equivalente entre 10 y 60 mg COD L-1. Registrar el pH, ajustar el valor a 7.4.
Inocular los matraces con el lodo activado u otra fuente de inóculo para obtener una concentración final no mayor de 30 mg SST L-1. Preparar también controles del inóculo en el medio mineral pero sin la sustancia de referencia.
De ser necesario, utilizar un matraz para verificar el posible efecto inhibitorio de la sustancia de prueba por medio de la inoculación de una solución conteniendo concentraciones comparables de la sustancia de prueba y de referencia en el medio mineral.
De igual manera, si se quiere verificar la degradación abiótica de la sustancia de prueba, utilizar un matraz conteniendo una solución estéril sin inóculo. Dicha solución se esteriliza a través de filtración por membrana (0.2 – 0.45 μm) o mediante la adición de una sustancia tóxica con la concentración apropiada. Si se utiliza la filtración a través de membrana, tomar las muestras asépticamente para mantener condiciones de esterilidad.
Adicionalmente, si se sospecha que la sustancia de prueba puede ser adsorbida en vidrio, lodo, etc., de acuerdo a los resultados obtenidos previamente, se debe incluir un matraz que contenga solución de sustancia de prueba + inóculo + agente esterilizante.
Aforar todos los volúmenes a 1 L con medio mineral y mezclar perfectamente.
Tomar una muestra de cada matraz para determinar la concentración inicial de COD por duplicado. Tapar los matraces con papel aluminio, de manera que se permita el libre intercambio de aire entre el matraz y la atmósfera circundante.
Finalmente, colocar los matraces en la incubadora con agitación e iniciar la prueba.
75 Distribución de los matraces
En una corrida típica, se utilizan los siguientes matraces:
1. Matraz 1 y 2 que contiene la sustancia de prueba + el inoculo (Suspensión de prueba, una sola dilución)
2. Matraz 3 y 4 que solamente contiene inóculo + medio mineral (blanco del inóculo).
3. Matraz 5 que contiene el compuesto de referencia + el inóculo (control del procedimiento); y cuando sea necesario también incluir:
4. Matraz 6 que contiene la sustancia de prueba + el agente esterilizante (control de degradación abiótico estéril).
5. Matraz 7 que contiene la sustancia de prueba + el inóculo + el agente esterilizante (control de adsorción).
6. Matraz 8 que contiene la sustancia de prueba + el compuesto de referencia + el inóculo (control de toxicidad)
Procedimiento
Cuantificación de COD
A lo largo del período de prueba, determinar las concentraciones de COD de las muestras en cada matraz por duplicado a intervalos de tiempo conocidos.
Es obligatorio cuantificar la concentración de COD en la suspensión de prueba y el blanco del inóculo al mismo tiempo. Se recomienda monitorear la concentración de COD en los demás matraces.
Muestreo
Tomar una muestra compuesta por el volumen mínimo de la suspensión de prueba necesaria para cada determinación de COD. Antes de realizar el muestreo eliminar cualquier pérdida por evaporación en los matraces, mediante adición de agua en cantidad necesaria para recuperar el volumen anterior.
Mezclar perfectamente el medio de cultivo, para que el material adherido a la pared del matraz sea re-disuelto o re-suspendido. Filtrar a través de membrana
76 o centrifugar la muestra inmediatamente después de ser tomada. Analizar el filtrado o centrifugado el mismo día, de otra manera almacenar a 2-4 °C por un máximo de 48 h o a -18 ° C para periodos más largos.
Frecuencia de muestreo
Asegurar que un número suficiente de muestras sean tomadas para permitir valorar el porcentaje de remoción del periodo de días a ser valorados. El nivel de aceptación para las pruebas de biodegradabilidad rápida aerobia es de 70
% de remoción de COD, este debe ser alcanzado en un periodo de 10 días dentro de los 28 días que dura la prueba. Se deben analizar primero las últimas muestras (28 días), y por selección de muestras apropiada es posible obtener una buena descripción, de la curva de biodegradación con relativamente pocas determinaciones. Por supuesto, si las últimas muestras (28 días) no muestran degradación, el experimento se da por terminado.
Datos y reporte
Los datos obtenidos deberán ser organizados en una hoja de datos. El porcentaje de degradación (Dt) correspondiente a cada tiempo de muestreo, puede ser obtenido a través de las determinaciones por duplicado de COD en cada matraz con sustancia de prueba y registrando el valor promedio para verificar la validez de la prueba.
El cálculo es realizado aplicando la siguiente ecuación:
𝐷𝑡 = [1 − 𝐶𝑡− 𝐶𝑏𝑙(𝑡)
𝐶0− 𝐶𝑏𝑙(0)] 𝑥100
Dónde:
Dt = % de degradación al tiempo t
C0 = concentración inicial promedio de COD en el medio de cultivo (mineral) inoculado con la sustancia de prueba (mg COD L-1)
77 Ct = concentración promedio de COD en el medio de cultivo (mineral) inoculado con la sustancia de estudio al tiempo t (mg DQO L-1)
Cbl (0) = concentración inicial promedio de COD en el blanco del medio mineral inoculado (mg COD L-1)
Cbl (t) = concentración promedio del blanco del medio mineral inoculado al tiempo t (mg COD L-1).
Todas las concentraciones son determinadas experimentalmente. Si la prueba ha cumplido con los criterios de validez, construir una gráfica para seguir el curso de la biodegradación, utilizando los valores promedio de los matraces con la sustancia de prueba. Calcular y reportar el porcentaje de remoción alcanzado en las muestras, al final de la prueba.
Validez de la prueba
La prueba se considera como válida si la diferencia de los valores por duplicado de remoción de COD de la sustancia química en análisis, al final de la prueba es mayor de 70 %.
78 Anexo 3
PRUEBAS DE LABORATORIO A CULTIVOS BACTERIANOS PREPARADOS PARA UN EXTRACTO DE AJO (DESINFECTANTE) HIDROSOLUBLE
Una muestra del extracto de ajo fue preservada en un recipiente plástico blanco no estéril con tapón de rosca, de 250 mL, presentó al momento del vaciado un aspecto de líquido, translucido, con aroma ligero a alcohol, solubilidad en agua, con formación de espuma y un pH de 7.5 unidades (Figura 1).
Fig. 1. Muestra del extracto de ajo
Para la evaluación de la eficiencia se incluye el informe relativo a las “Pruebas de laboratorio a cultivos bacterianos preparados para el extracto de ajo hidrosoluble”.
En este sentido se describe de manera detallada la evaluación del efecto del producto desinfectante sobre cepas de Pseudomonas sp. y del ciliado Paramecium sp.
79 A nivel nacional no existe un procedimiento oficialmente reconocido Sin embargo, en el ámbito internacional se encuentra se encuentran normas europeas para el control y regulación del uso de desinfectantes donde se establece la actividad bactericida, fungicida, esporicida entre otros.
Se realizó un estudio preliminar de actividad microbicida del producto hidrosoluble extracto de ajo estandarizado, formulado en colaboración con la empresa BYOSS S.A. DE C.V. Donde se utilizó la metodología de actividad bactericida y pruebas de contacto, de tal forma que permitió definir la actividad de la muestra sobre los microorganismos.
Para tal efecto se seleccionaron los siguientes cultivos: 5 especies del género Pseudomonas (P. aeruginosa, P. fluorescens, P. alcaligenes, P. sutzerii y P.
putida), y el ciliado Paramecium sp. Los cultivos bacterianos se sembraron en un medio de cultivo con producto hidrosoluble extracto de ajo estandarizado a dos diferentes concentraciones y se incubaron por 24 horas a 37 ºC.
Para contar con resultados experimentales que permitan visualizar y evidenciar la actividad desinfectante del extracto de ajo estandarizado por síntesis orgánica, desarrollado con apoyo de la empresa BYOSS S.A. de C.V., Se procedió a realizar un estudio preliminar de actividad microbicida en una muestra del producto sobre dos tipos de microorganismos (bacterias y protozoos).