Ensayos de co-transfección para lograr el silenciamiento de la

De inicio, se obtuvo el análisis de genes de referencia de actina y GAPDH mediante cinco métodos que se muestran en la Tabla 8, indicando el gen más estable obtenido para cada método, por lo que se decidió trabajar con la media geométrica de ambos genes.

Tabla 8. Análisis de estabilidad de genes de referencia.

Método

Comprehensive Delta CT BestKeeper NormFinder Genorm Actina Actina/GAPDH GAPDH/Actina Actina/GAPDH GAPDH/Actina Gen colocado a la izquierda representa mayor estabilidad

En el experimento de co-transfección en los fibroblastos, donde se administró al mismo tiempo la mstn-1 de L. gutattus y las dos secuencias de shRNAs (sh915 y sh1047) o bien los dsiRNAs (dsi920 y dsi1025), no se observó disminución significativa del transcrito de mstn-1 a las 12 h (P=0.033) después de la co-transfección, aunque puede observarse disminución en la expresión del transcrito. A las 24 h después de la co-transfeccción, se obtuvo disminución significativa en la expresión de mstn-1, específicamente las secuencias de sh915 (P=<0.001), sh1047 (P=<0.001) y el dsi920 (P=0.013), es decir, hubo un silenciamiento del transcrito con

73 ambos shRNAs utilizados, sin embargo, los dsiRNAs fueron menos eficientes, sólo el dsi920 logró silenciar parcialmente el transcrito (Figura 32).

Figura 32. Expresión mstn-1 en fibroblastos de ratón co-transfectados a las 12 h y 24 h con plásmido de mstn-1 y shRNA ó dsiRNA. Se utiliza como control los fibroblastos de ratón que expresan mstn-1 de L. guttatus (F-Mstn); shRNA (sh); dsiRNA (dsi); Fibroblastos de ratón (Cel). Los resultados están representados como media + desviación estándar. Las flechas indican diferencias significativas con respecto a los fibroblastos transfectados solo con el vector de expresión de msnt-1.

Debido a que el plásmido de expresión de mstn-1 de L. guttatus se expresa muy rápido y abundante desde la primera hora post-transfección, se decidió realizar un pre-transfección, en donde primero se transfectaron los shRNA y dsiRNA en las células, para darle tiempo al mecanismo de RNAi de interferencia de procesar tanto los shRNA y dsiRNA, con la finalidad de que estén listos para bloquear la expresión de msnt-1 una vez que el plásmido ha sido transfectado e inicia su expresión. En este ensayo de pre-transfección, se logró disminuir significativamente (P<0.001) la expresión de mstn-1 en las células, las comparaciones pareadas de Fisher indican que ambos shRNAs funcionan, sh915 (P<0.001) y sh1047 (P

=0.014), no obstante, los dsiRNA mostraron resultados distintos, ya que el dsi920 no logró silenciar significativamente la miostatina-1 (P=0.086), mientras que el dsi1025 sí disminuyó significativamente los niveles del transcrito (P=0.003) (Figura 33).

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

F-Mstn sh915 sh1047 dsi920 dsi1025 Cel

Expresión relativa

12h 24h

74 Figura 33. Expresión miostatina-1 en fibroblastos de ratón transfectados inicialmente con shRNA ó dsiRNA, a las 21hr se transfectó el plásmido de expresión de miostatina y 3 hr más tarde las células fueron cosechadas. Se utiliza como control los fibroblastos de ratón que expresan mstn-1 de L.

guttatus (F-Mstn); shRNA (sh); dsiRNA (dsi); Fibroblastos de ratón (Cel). Los resultados están representados como media + desviación estándar. Las flechas indican diferencias significativas con respecto a los fibroblastos transfectados solo con el vector de expresión de msnt-1.

Estos resultados fueron consistentes al medir los niveles de proteína por medio de Western Blot, ya que se muestra una disminución en los niveles de proteína 24 h post transfección (Figura 34). En el análisis semi-cuantitativo se puede visualizar que los sh1047 reducen principalmente los niveles de proteína, seguidos por los dsiRNA y finalmente el shRNA915, a pesar que este último fue el que redujo mayormente el transcrito de mstn-1. Se puede apreciar que los fibroblastos de ratón (cel), expresan miostatina endógena (Figura 35).

Figura 34. Western Blot de miostatina-1 y β-actina en fibroblastos de ratón, transfectados inicialmente con shRNA ó dsiRNA; a las 21 h se transfectó el plásmido de expresión de miostatina-1 y 3 h más tarde las células fueron cosechadas; cel indica niveles basales en fibroblastos de ratón.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

F-Mstn sh915 sh1047 dsi920 dsi1025 Cel

Expresión relativa

75 .

Figura 35. Semi-cuantificación por densitometría de la proteína de miostatina-1, en fibroblastos de ratón transfectados inicialmente con shRNA ó dsiRNA. A las 21 h se transfectó el plásmido de expresión de mstn-1 y 3 h más tarde las células fueron cosechadas. Se utilizaron como control los fibroblastos de ratón que expresan mstn-1 de L. guttatus (F-Mstn); secuencia aleatoria (scrambled sequence) que no tiene gen blanco (dsisc); shRNA (sh); dsiRNA (dsi); control negativo: fibroblastos de ratón (cel).

Para evaluar la duración del efecto y el tiempo en el cual ocurre mayor silenciamiento génico de mstn-1, se corrió un experimento que duró 96 h, donde las células se cosecharon cada 24 h, sin embargo, a las 96 h se observó muerte celular, por tal motivo no fue considerado en los análisis y sólo fueron utilizados los shRNA por ser los que mayor efecto de silenciamiento presentaron.

Durante este experimento, se observó silenciamiento génico desde las 24 h como ya se había observado en los experimentos previos, asimismo el efecto de silenciamiento se mantuvo hasta las 72 h después de la transfección, tanto por sh1047, como sh915, comparado con el control (F-Mstn), el cual fue transfectado sólo con el plásmido de expresión de mstn-1 de L.

guttatus (Figura 36).

Al analizar los shRNAs por separado, el sh915 mostró un silenciamiento progresivo, se observó silenciamiento génico desde las 24 h y este silenciamiento incrementó hasta el final del experimento a las 72 h. Por otro lado, el sh1047 presentó un silenciamiento variable, ya que logró silenciar a partir de las 24 h pero a las 48 h se detectó un pequeño aumento en la expresión de mstn-1, volviendo a disminuir a las 72 h (Figura 37).

0 5 10 15 20 25

F-Mstn dsisc sh915 sh1047 dsi920 dsi1025 cel

Intensidad

76 Figura 36. Expresión de mstn-1 en fibroblastos de ratón a las 24, 48 y 72 h después de la transfección de los shRNA1047 y shRNA915. El vector de expresión de mstn-1 de L. guttatus se transfectó a las 21 h. Se utilizaron como control los fibroblastos de ratón que expresan mstn-1 de L. guttatus (F-Mstn); shRNA (sh); dsiRNA (dsi).

Figura 37. Comparación de la expresión de mstn-1 en fibroblastos de ratón co-transfectados con shRNA-1047 y shRNA-915 a las 24, 48 y 72 h. El vector de expresión de mstn-1 de L. guttatus se transfectó a las 21 h. Se utilizaron como control los fibroblastos de ratón que expresan mstn-1 de L. guttatus (F-Mstn); shRNA (sh); dsiRNA (dsi).

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