Epimutaciones constitucionales en MLH1

En una pequeña proporción de los casos, el SL se debe a metilación constitucional del gen MLH1.

Las epimutaciones son cambios epigenéticos reversibles en la cromatina, el DNA o las histonas, que no alteran la secuencia de nucleótidos y tienen el potencial de ser heredados (Shah, 2022;

Mohammad and Jha, 2023). A partir de los años 2000, se identificaron defectos epigenéticos en los genes MLH1 y MSH2 como un mecanismo etiológico alternativo de SL. Estos defectos se

conocen como epimutaciones constitucionales y se caracterizan por una hipermetilación monoalélica que provoca el silenciamiento transcripcional de estos genes (Gazzoli et al., 2002;

Hitchins et al., 2005; Hitchins, 2013; Dámaso et al., 2018).

En el SL, se han descritos dos tipos de epimutaciones constitucionales: las epimutaciones primarias, que solo se han reportado en MLH1, y las epimutaciones secundarias, que están presentes tanto en MLH1 como MSH2 (Hitchins, 2013, 2015). Las epimutaciones primarias se caracterizan por no estar asociadas a una secuencia de DNA o alteración genética específica y aparecen aparentemente de novo. Dado que son lábiles en la línea germinal, tienden a ser reversibles entre generaciones y presentan un patrón de herencia no Mendeliano (Figura 8).

Actualmente, se desconoce el mecanismo subyacente que da lugar a este tipo de epimutación (Pineda et al., 2012; Hitchins, 2015; Dámaso et al., 2018). Por otro lado, las epimutaciones secundarias se originan por una alteración en cis en la secuencia de DNA y, a diferencia de las primarias, siguen un patrón de herencia mendeliana autosómico dominante (Hitchins, 2015;

Leclerc et al., 2018; Morak et al., 2018) (Figura 8).

Figura 8. Ejemplo de epimutaciones primarias y secundarias en MLH1 y MSH2. A la izquierda se ha representado la expresión somática normal para ambos genes en ausencia de metilación en la región promotora. Al medio, epimutaciones primarias independientemente de una alteración genética.

Únicamente se han descrito epimutaciones primarias en MLH1. A la derecha se encuentran las epimutaciones secundarias asociadas a defectos genéticos en cis. En MLH1, la variante c.-27C>A se ha asociado con la presencia de metilación aberrante en la región promotora, mientras que para MSH2 se han reportado deleciones en el gen continuo EPCAM. Los círculos negros en las regiones promotoras representan la metilación de las islas CpGs mientras que los círculos blancos ausencia de metilación. Las flechas indican actividad transcripcional. Adaptado de Hitchins, 2015.

Entre el 0,6-2% de los casos que cumplen al menos uno de los criterios de Bethesda revisados (ver apartado 4.1.1) y sin evidencias de una variante deletérea en los genes MLH1, MSH2 o MSH6, el SL puede estar causado por epimutaciones constitucionales en el promotor de MLH1

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(Hitchins, 2016). En estos individuos la adquisición de un segundo hit en el alelo salvaje o wild- type a nivel somático (ya sea por mutaciones puntuales, pérdida de heterocigosidad o metilación) conduce a la pérdida completa de expresión de MLH1 y promueve la carcinogénesis, caracterizada por la presencia de metilación en la región promotora y MSI (Gazzoli et al., 2002;

Goel et al., 2011; Pineda et al., 2012; Hitchins, 2013; Dámaso et al., 2018). A pesar de la baja frecuencia de casos descrita, se estima que entre el 3,5%-15,6% de los individuos con CCR que cumplen los criterios de Bethesda, sin mutación germinal identificada y presencia de metilación en el promotor de MLH1, serían portadores de epimutaciones (Castillejo et al., 2015; Hitchins, 2016; Pearlman et al., 2021).

En estos pacientes, la metilación germinal se encuentra focalmente localizada en las islas CpGs de su región promotora (1.6Kb) (Dámaso et al., 2018), la cual se comparte con el gen contiguo EPM2AIP1. Se ha observado que la metilación en las regiones proximales del promotor, llamadas C y D, se relaciona con el silenciamiento transcripcional de MLH1, mientras que las regiones distales A y B no lo están (Deng et al., 1999). Además, en un número notable de casos se ha reportado un patrón de hipermetilación monoalélica asociado a la variante de la región promotora c.-93a (Figura 9) (Morak et al., 2008; Goel et al., 2011; Hitchins et al., 2011; Pineda et al., 2012; Dámaso et al., 2018).

Por otro lado, se ha demostrado la pérdida de expresión del alelo metilado en casos heterocigotos para la variante c.655G>A ubicada en el exón 8 mediante RT-PCR y posterior secuenciación Sanger o la técnica conocida comúnmente como single-nucleotide primer extensión (SNuPE) (Figura 9) (Morak et al., 2008; Goel et al., 2011; Hitchins et al., 2011; Pineda et al., 2012; Dámaso et al., 2018).

Cabe destacar que en la mayoría de los pacientes con epimutaciones constitucionales en MLH1, bien se observa una distribución homogénea de la metilación en todas las células somáticas del cuerpo (~50%) o como mínimo superior al 10% (Hitchins et al., 2005; Morak et al., 2008; Goel et al., 2011; Hitchins et al., 2011; Pineda et al., 2012; Dámaso et al., 2018). Gracias al desarrollo de técnicas de metilación más sensibles, en los últimos años se han identificado individuos con mosaicismo epigenético de baja intensidad (niveles de metilación <10%) (Sloane et al., 2015;

Ward et al., 2013; Wu et al., 2012). La relevancia de estos hallazgos es controvertida puesto que en un estudio inicial se mostró que el 78% de los controles sanos analizados presentaban niveles bajo de metilación en sangre (<10%) (Auclair et al., 2011). La presencia de mosaicismo epigenético en MLH1 cuestiona la prevalencia real de las epimutaciones constitucionales en el

SL, relacionada con la sensibilidad de las técnicas utilizadas para su cribado y el papel de mosaicismo epigenético en la predisposición al desarrollo del cáncer.

Figura 9. Representación de las características moleculares básicas de las epimutaciones constitucionales en MLH1. En el estado normal transcripcional, la isla CpG de la región promotora de MLH1 se encuentra desmetilada (representado por círculos blancos). Consecuentemente, se observa una expresión bialélica de transcritos gracias al polimorfismo c.655A>G. En presencia de una epimutación en MLH1, se observa una hipermetilación monoalélica aberrante en la región promotora, gracias a la presencia de la variante c.-93G>A (representado por círculos negros). Como resultado, únicamente se expresará el transcrito del alelo no metilado. Los exones están representados por recuadros. Las flechas indican actividad transcripcional. Adaptado de Hitchins, 2013.