Etapa de campo

a) Material biológico.

Para la evaluación y congelación del semen, éstos fueron obtenidos de tres peces machos, sexualmente maduros de la especie Piaractus brachypomus (paco) adaptados y mantenidos en cautiverio en los

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estanques del Instituto de Investigaciones de la Amazonia Peruana IIAP-Ucayali.

Minutos antes a la pesca se tomó la temperatura del agua del estanque y se sacó una muestra del mismo para determinar los parámetros químicos, lo mismo se hizo con el agua de las artesas.

b) Selección de reproductores.

Para la obtención del semen han sido preseleccionados nueve (9) reproductores a partir de tres años de edad.

Para este procedimiento se tuvo en consideración las características y signos de maduración descritas por Zaniboni-Filho y Nuñer, (2004);

citado por Senhorini et al., (2005) en yamú (Brycon amazonicus).

c) Variable de análisis “Características biométricas”

 Longitud total: con un ictiometro se procedió a medir la longitud total desde la punta de la nariz hasta el final de la aleta caudal.

 Peso vivo: en forma individual los peces fueron pesados en una balanza tipo reloj de 10 g de aproximación.

 El perímetro abdominal y diámetro urogenital fue medido con una cinta métrica.

d) Inducción hormonal.

El protocolo para la administración de la hormona e inducir la maduración final de los gametos y estimular la espermiación, fue el aplicado por el Instituto de Investigaciones de la Amazonia peruana IIAP-Ucayali., usándose para este propósito la hormona

“CONCEPTAL” (acetato de buserelina), el cual se inyectó a la altura del origen de las aletas pectorales por vía intraperitoneal. La dosis en machos es de 1ml de hormona/kg de peso vivo.

Para la inducción hormonal se empleó una jeringa de 5 ml por cada reproductor macho.

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La dosis total calculado se aplicó en dos proporciones iguales, 50% al inicio (estimulante) y una última dosis de 50% (desencadenante). Éste último se aplicó doce (12) horas después de la primera aplicación.

e) Obtención del semen.

Se obtuvo por estrujamiento, técnica empleado por Cruz et al., (2005),

f) Variable de análisis: características macroscópicas en semen fresco.

Volumen Seminal.

Se aplicó la metodología empleado por Cruz et al., (2005), en peces como: yamú (Brycon amazonicus) y cachama blanca (Piaractus brachypomus). Se determinó directamente el volumen de la espermiación la cual se expresó en ml.

Color.

Se tomó en cuenta las recomendaciones de Cruz et al., (2005) normalmente el semen debe presentar una coloración blanco marfil.

Viscosidad.

Se practicó la metodología de Suquet et al., (1992).citado por Cruz et al., (2005) cuya calificación es en escala de 0-4, y expresada en porcentaje siendo 0 el menor grado de viscosidad.

g) Variable de análisis: Características microscópicas en semen fresco.

Motilidad.

La metodología empleado para determinar la motilidad es la de Cruz et al, (2005), usado en peces como: yamú (Brycon amazonicus) y cachama blanca (Piaractus brachypomus), estimándose en porcentaje, y su evaluación fue subjetiva con base a la amplitud de las ondas o remolinos que despliegan los espermatozoides.

Para inducir la motilidad del semen fresco y precongelado, se procedió de acuerdo a Cruz et al., (2004a) en Cruz et al., (2005) y como

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solución activadora se usó bicarbonato de sodio (NaHCO3) al 1% en proporción 1:10 µl (v:v, semen: solución activadora). Y se observó en microscopio a un aumento de 10X.

Tiempo de activación.

Esta variable se evaluó según Cruz-Casallas y Velasco-Santamaría, (2005), junto con la movilidad, cronometrando el tiempo transcurrido desde el momento en que se adiciona al semen la solución activadora, y la observación se hizo a un aumento de 10X.

Viabilidad.

Así mismo se realizó la prueba de daño a la membrana citoplasmática en los espermatozoides para determinar el porcentaje de células espermáticas viables y no viables (vivos y muertos). Para ello se empleó la técnica de la coloración diferencial, (Eosina y Nigrosina como colorante de contraste) empleado por Swanson y Bearden, (1951) citado por Cruz et al., (2005). Observándose las láminas en microscopio óptico a 20X. Este resultado se determinó en porcentaje previo conteo de células con daño en membrana (d-Me).

Concentración espermática.

Para determinar la concentración espermática en el paco (Piaractus brachypomus), se procedió de acuerdo a la metodología empleado por Cruz et al, (2005) usado en yamú (Brycon amazonicus) y cachama blanca (Piaractus brachypomus). Se diluyó el semen en NaCl al 0.9%, para luego colocar 1 µl esta dilución en cada uno de los campos de la cámara de Neubauer. La observación y conteo se hizo en las dos cuadriculas, con un aumento de 40X.

Una vez contados los espermatozoides, la concentración espermática se calculó aplicando la siguiente fórmula:

N CE =

(A x P x D)

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CE = Concentración espermática (número de espermatozoides por µl^-1).

N = Número promedio de espermatozoides contados en los cinco sub-cuadros de las dos cuadrículas.

A = Área de la cámara de Neubauer contada (generalmente 0.2 mm²).

P = Profundidad de la cámara (0.1 mm).

D = Dilución del semen (en este caso 1:7000).

h) Protocolo de crioconservación.

El protocolo para la congelación del semen descrito en los siguientes numerales, fue adaptado de Martínez, (2010) quien aplico de forma exitosa en bocachico (Prochilodus magdalenae), carácido con características de maduración y reproducción similares al paco (Piaractus brachypomus). A la cual, se realizaron algunas modificaciones y adaptaciones de acuerdo a otros resultados obtenidos por otros investigadores realizados en otras especies dulceacuícolas tropicales. Este será modificado (punto central del experimento) en cuanto a concentraciones del crioprotector, dimetilsulfóxido (DMSO) y yema de huevo (YH) a fin de detectar las concentraciones y efectos adecuados para el semen en estudio.

i) Preparación del diluyente y distribución.

Para la preparación de los nueve (9) diluyentes (tratamientos) de interacción se usó dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotector permeable en diferentes proporciones (5%, 7% y 10%) y yema de huevo de gallina (YHG) como crioprotector no permeable en diferentes proporciones (10%, 15% y 20%), se marcaron 9 tubos de ensayo de vidrio graduados de 15 ml con los nombres de cada diluyentes (T1; T2;

T3; T4; T5; T6; T7; T8 y T9), en la que se disolvió 5.5% de glucosa en 2 ml de agua destilada, la que previamente se calentó en jarra hervidora por 10 segundos, para una mejor dilución de la glucosa, luego se agregó el volumen (porcentaje) total DMSO según corresponde al tratamiento. Se esperó a que la reacción exotérmica

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del DMSO con el agua haya terminado, para evitar la coagulación de la yema para posteriormente, adicionar YHG.

Finalmente, se adicionó la cantidad suficiente de agua destilada para completar 10 ml de volumen final. La preparación del diluyente fue el empleado por Cruz-Casallas y Velasco-Santamaría, (2005) en yamú (Brycon amazonicus) y se distribuyó en el semen recolectado de cada macho (n=3), convirtiéndose en tres replicas o bloques.

j) Evaluación microscópica en semen precongelado.

Los procedimientos para determinar motilidad, tiempo de activación e integridad de membrana, fueron los mismos realizados en semen fresco, el cual se procedió después de un tiempo de equilibrio de 7 minutos.

k) Dilución, empacado y congelación del semen.

Los procedimientos se hizo de acuerdo a Martínez, (2010), el semen de cada macho y el diluyente antes preparado, se mezclaron en tubos de ensayos de vidrio de 10 ml, (27 tubos), la dilución fue de1:4 (semen:diluyente), agregando 20 µl de semen + 60 µl del diluyente.

Inmediatamente después se empaco en pajillas de 0.5 ml, uno (1) por macho/tratamiento (tabla 2), las cuales se sellaron con alcohol polivinilo. La congelación se procedió de acuerdo al protocolo empleado por Guarnizo, (2007), en bagre rayado (Pseudoplatystoma fasciatum) el cual se hizo en dos fases. Primera fase, exponerlas en vapor de nitrógeno líquido durante 30 minutos. Segunda fase, sumergidas en un tanque de nitrógeno líquido (NL) hasta su evaluación postdescongelación.

l) Descongelación del semen.

Las pajillas han sido descongeladas según Medina et al., (2007), para inducir la motilidad espermática se usó (NaHCO3) al 1% obteniendo cero movilidad.

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