UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

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1

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS – SATIPO

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE ZOOTECNIA TROPICAL

TESIS:

PRESENTADA POR:

BACH. CRISTIAN RICARDO POMA CERRON

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERO EN CIENCIAS AGRARIAS

ESPECIALIDAD ZOOTECNIA

SATIPO, PERÚ 2014

“EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE DIMETILSULFÓXIDO Y YEMA DE HUEVO SOBRE LAS CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Y MICROSCÓPICAS EN ESPERMATOZOIDES CRIOCONSERVADOS DEL Piaractus brachypomus-Cuvier, 1818 (PACO) –CORONEL PORTILLO-UCAYALI”.

2

”

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2

ASESOR

Dr. Magno CORONEL OROZCO

CO-ASESOR

Ing. Ernesto Iván ARROYO JEREMIAS

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3

DEDICATORIA

A mi núcleo familiar: Ángela Petronila CERRON MEDINA, Cesário Claudiano POMA GARCIA y Javier José POMA CERRON

A todos los que creen en mí.

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4

AGRADECIMIENTOS

 A la Escuela Académico Profesional de Zootecnia, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional del Centro del Perú (UNCP),

por brindarme un espacio y acogerme en sus aulas por el tiempo que duró mi formación profesional.

 A los miembros integrantes del Instituto de Investigaciones de la Amazonia Peruana IIAP-Ucayali,

por el cofinanciamiento y su entera confianza al poner a disposición sus instalaciones y laboratorio de reproducción artificiales de peces tropicales del programa AQUAREC.

 Al asesor, por las sugerencias en la redacción.

 Al co-asesor,

por ser partícipe y colaborar con su experiencia para el desarrollo de ésta investigación.

 A los revisores, por las observaciones de algunos errores.

 A mis amigos,

que me alentaron por seguir adelante y siempre

estuvieron brindándome su apoyo incondicional.

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5

ÍNDICE

Pág.

RESUMEN. 13

I. INTRODUCCIÓN 14

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 16

2.1 Bioecología del Piaractus brachypomus (paco) 16

2.1.1 Características generales. 16

2.1.2 Hábitos alimenticios. 16

2.1.3 Taxonomía. 17

2.1.4 Sinonimia. 17

2.1.5 Parámetros físico-químicos del agua. 18

2.1.6 Madurez sexual. 18

2.1.7 Reproducción natural. 18

2.1.8 Reproducción inducida. 18

2.1.9 Selección de reproductores. 19

2.1.10 Aplicación hormonal y obtención del semen. 20 2.1.11 Características físicas y químicas del semen. 20

2.1.12 Espermatozoides. 20

2.2 Evaluación Seminal. 21

2.2.1 Calidad del esperma. 21

2.2.2 Características macroscópicas. 22

a) Volumen. 22

b) Viscosidad. 23

c) Color. 23

2.2.3 Características microscópicas. 23

a) Movilidad espermática. 23

b) Tiempo de activación. 27

c) Viabilidad. 29

d) Concentración espermática. 31

2.3 Investigaciones en crioconservación. 32

2.3.1 Crioconservación. 32

(6)

6

2.3.2 Agentes crioprotectores. 33

a) Crioprotectores permeables. 33

b) Crioprotectores no permeables. 34

2.3.3 Diluyentes. 36

2.3.4 Dilución y Empaque. 36

2.3.5 Tiempo de equilibración. 37

2.3.6 Proceso de crioconservación. 37

2.3.7 Crioconservación del semen de peces. 37

2.3.8 Efecto de la crioconservación sobre la célula espermática. 38

a) Daño morfológico. 38

b) Deterioro fisiológico. 38

2.3.9 Cristalización. 39

2.3.10 Velocidad de congelación y descongelación. 39

a) Congelación. 39

b) Descongelación. 41

III. MATERIALES Y MÉTODOS. 42

3.1 Lugar de ejecución. 42

3.2 Universo de estudio y muestra. 42

3.3 Materiales, equipos y reactivos. 43

3.3.1 Materiales. 43

3.3.2 Equipos. 43

3.3.3 Reactivos. 43

3.4. Variables que influyeron en el objeto de investigación. 44 3.4.1 Variable de análisis: respecto a los reproductores. 44 3.4.2 Variables de análisis respecto al semen fresco. 44 3.4.3 Variables independientes respecto al semen diluido. 44

3.4.4 variables intervinientes. 45

3.4.5 variables dependientes respecto al semen diluido

precongelado. 45

3.5 Análisis estadístico. 45

3.6 Contrastación o prueba estadística de significación. 47

3.7 Análisis de información 47

3.8 Operacionalización de las variables independientes. 47

3.8.1 Etapa preliminar. 47

3.8.2 Etapa de campo. 47

a. Material biológico 47

b. Selección de reproductores. 48

(7)

7

c. Variables de análisis “Características

biométricas.” 48

d. Inducción hormonal. 48

e. Obtención del semen. 49

f. Variable de análisis de las características

macroscópicas en semen fresco. 49

g. Variable de análisis de las características

microscópicas en semen fresco. 49

h. Protocolo de crioconservación. 51

i. Preparación del diluyente y distribución. 51 j. Evaluación microscópica en semen

precongelado. 52

k. Dilución, empacado y congelación del

semen. 52

l. Descongelación del semen. 52

IV. RESULTADOS Y DISCUCIONES. 53

V CONCLUSIONES. 65

VI. RECOMENDACIONES. 66

VII. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 69

ANEXOS. 70

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8

LISTADO DE CUADROS

Pág.

Cuadro 01. Biometría de los machos reproductores del Piaractus

brachypomus (paco). 53

Cuadro 02. Características macroscópicas del semen (volumen, color, y viscosidad) de los machos reproductores del Piaractus

Cuadro 03. Calidad espermática microscópica en semen fresco del

Piaractus brachypomus (paco). 55

Cuadro 04. Análisis de varianza para la variable motilidad masal en

semen diluido del Piaractus brachypomus (paco). 56 Cuadro 05. Prueba de significación de Tukey para la variable motilidad

masal en semen diluido del Piaractus brachypomus (paco). 57 Cuadro 06. Análisis de varianza para la variable tiempo de activación en

semen diluido del Piaractus brachypomus (paco). 58 Cuadro 07 Prueba de significación de Tukey para la variable tiempo de

activación en semen diluido del Piaractus brachypomus

(paco). 59

Cuadro 08 Análisis de varianza para la variable viabilidad espermática

en semen diluido del Piaractus brachypomus (paco). 60 Cuadro 09 Prueba de significación de Tukey para la variable viabilidad

espermática en semen diluido del Piaractus brachypomus

(paco). 61

Cuadro 10. Análisis de varianza para la variable motilidad masal en semen diluido y semen fresco del Piaractus brachypomus

(paco). 62

(9)

9

Cuadro 11 Prueba de significación de Duncan para la variable motilidad masal en semen diluido y semen fresco del

Piaractus brachypomus (paco). 62

Cuadro 12. Análisis de varianza para la variable tiempo de activación en semen diluido y semen fresco del Piaractus brachypomus

(paco). 63

Cuadro 13. Prueba de significación de Duncan para la variable tiempo de activación en semen diluido y semen fresco del Piaractus

Cuadro 14 Análisis de varianza para la variable viabilidad en semen

diluido y semen fresco del Piaractus brachypomus (paco). 64 Cuadro 15. Prueba de significación de Duncan para la variable

viabilidad en semen diluido y semen fresco del Piaractus

Anexo 01. Biometría de los machos reproductores del Piaractus brachypomus (paco) utilizados en la investigación IIAP-

Ucayali. 70

Anexo 02. Características macroscópicas del semen (volumen, color, y viscosidad) de los machos reproductores del Piaractus brachypomus (paco) utilizados en la investigación IIAP-

Ucayali. 70

Anexo 03. Calidad espermáticas microscópicas (motilidad, tiempo de activación, viabilidad y concentración espermática) en semen fresco del Piaractus brachypomus (paco) utilizados

en la investigación IIAP-Ucayali. 70

Anexo 04. Motilidad en semen diluido por tratamiento y repeticiones expresado en % después de estar sometido a un tiempo de

equilibrio. 71

Anexo 05. Tiempo de activación por tratamiento y repeticiones expresado en minutos después de estar sometido a un

tiempo de equilibrio. 71

Anexo 06. Registro de la evaluación de la calidad espermática microscópica del semen diluido (precongelado) del macho

(10)

10

reproductor I (repetición I) y por tratamiento en Piaractus

brachypomus. 72

Anexo 07. Registro de la evaluación de la calidad espermática microscópica del semen diluido (precongelado) del macho reproductor II (repetición II) y por tratamiento en Piaractus

brachypomus. 73

Anexo 08. Registro de la evaluación de la calidad espermática microscópica del semen diluido (precongelado) del macho reproductor III (repetición III) y por tratamiento en Piaractus

brachypomus. 74

Anexo 09. Registro de viabilidad en semen diluido por tratamiento y

repeticiones expresado en % 75

Anexo 10. Matriz de consistencia. 76

Anexo 11. Reporte de las características macroscópicas y microscópicas en semen fresco de algunos peces

dulceacuícolas. 85

Anexo 12. Características biométricas de los tres machos

reproductores del Piaractus brachypomus (paco). 86 Anexo 13. Resultados obtenidos con el Sistema SAS versión 9.0,

motilidad masal espermática del semen diluido (Piaractus

brachypomus). 87

Anexo 14. Sistema SAS Procedimiento ANOVA Variable dependiente:

VR. 87

Anexo 15. Prueba de significación Tukey para la variable motilidad

masal entre bloque. 87

masal del factor “B” 88

Anexo 17. Media y desviación estándar de motilidad masal en semen

diluido. 88

Anexo 18. Resultados obtenidos con el Sistema SAS versión 9.0, tiempo de activación del semen diluido del Piaractus

brachypomus (paco) 89

VR. 89

(11)

11

masal del factor “B” 92

Anexo 22. Resultados obtenidos con el Sistema SAS versión 9.0, viabilidad espermática del semen diluido del Piaractus

VR. 90

Anexo 25. Prueba del rango estudentizado de Tukey (HSD) para VR. 91 Anexo 26. Media y desviación estándar de la viabilidad en semen

diluido. 91

Anexo 27. Resultados obtenidos con el Sistema SAS versión 9.0, para la variable motilidad masal espermática comparados entre semen diluido y semen fresco del Piaractus brachypomus

(paco). 92

resp. 92

Anexo 29. Prueba del rango múltiple de Duncan para resp. 92 Anexo 30. Resultados obtenidos con el Sistema SAS versión 9.0, para

la variable tiempo de activación espermática comparados entre semen diluido y semen fresco del Piaractus

resp. 93

Anexo 32. Prueba del rango múltiple de Duncan para resp. 93 Anexo 33. Resultados obtenidos con el Sistema SAS versión 9.0, para

la variable viabilidad espermática comparados entre semen

diluido y semen fresco del Piaractus brachypomus (paco). 94 Anexo 34. Sistema SAS Procedimiento ANOVA Variable dependiente:

resp. 94

Anexo 35. Prueba del rango múltiple de Duncan para resp. 94

Anexo 36. Esquema de causas y efectos. 95

(12)

12

LISTADO DE FOTOGRAFIAS

Pág .

Fotografía 01. Equipos empleados en la evaluación de las

características microscópicas. 96

Fotografía 02. Solución activadora NaHCO3. 96

Fotografía 03. Dimetilsulfóxido (crioprotector intra celular). 96 Fotografía 04. Yema de huevo de gallina (crioprotector extra celular). 96

Fotografía 05. Preparación de los diluyentes. 96

Fotografía 06. Tubos de ensayos conteniendo los nueve tratamientos 96 Fotografía 07. Semen recolectado de los tres machos reproductores. 97 Fotografía 08. Evaluación de la macroscópica (grado de viscosidad). 97 Fotografía09. Evaluación microscópicas (viabilidad; puntos amarillos

son espermatozoides muertos). 97

Fotografía 10. Alcohol polivinilo usado para el sellado de las pajillas. 97 Fotografía 11. Pajillas sometidas a la primera etapa del proceso de

congelación a vapores de nitrógeno. 97

Fotografía 12. Monitoreo de la temperatura de las pajillas sumergidas

en nitrógeno líquido en la segunda etapa. 97

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13

RESUMEN

Lugar IIAP-Ucayali. Problema ¿Qué porcentaje de concentración de dimetilsulfóxido y yema de huevo serán los adecuados para mantener a los espermatozoides del Piaractus brachypomus (paco) diluidos precongelado con similares características microscópicas al semen fresco, y mayor porcentaje de larvas normales postcongelado? Hipótesis I; como la acción de la yema de huevo es termoprotectora ésta no influirá en la primera etapa, obteniéndose similares características microscópicas al semen fresco con 5% de DMSO.

Hipótesis II; la dilución del semen de Piaractus brachypomus (paco) con el diluyente a base de 7% de dimetilsulfóxido y 20% de yema de huevo se obtendrá el mayor porcentaje de larvas normales postcongelación. Objetivos: a) Determinar las características biométricas de los reproductores machos del Piaractus brachypomus (paco). b) Determinar las características macroscópicas del semen fresco (volumen, viscosidad, color) del Piaractus brachypomus (paco). c) Determinar las características microscópicas (motilidad, tiempo de activación, viabilidad y concentración espermática) del semen fresco del Piaractus brachypomus (paco). d) Evaluar el efecto de las diferentes concentraciones del dimetilsulfóxido y yema de huevo en las características microscópicas (motilidad, tiempo de activación, y viabilidad) en semen diluido (etapa precongelación) del Piaractus brachypomus (paco), sometido a un tiempo de equilibrio. e) Comparar el efecto de las diferentes concentraciones del dimetilsulfóxido y yema de huevo en las características microscópicas (motilidad, tiempo de activación, y viabilidad) entre el semen fresco y el semen diluido del Piaractus brachypomus (paco). Metodología:

Captura, selección, aplicación hormonal, obtención, evaluación macro y microscópicas del semen, preparación del diluyente, dilución semen diluyente, evaluación, envasado, congelación y descongelación. Resultados: peso vivo 4.433 ± 0.51kg, longitud 62.33 ± 2.51 cm y perímetro abdominal 52.07 ± 0.90 cm; 98 ± 1%, motilidad 98 ± 1%, tiempo de activación 25.30 ± 3.67 min, viabilidad 95.96±0.72% y concentración espermática 12 401 666.7±965 729.431 Spz/µl. Espermatozoides diluidos en 5%, 7% y 10% de DMSO motilidad 93.11; 89.11 y 79.33%, tiempo de activación 21.96; 19.18 y 13.21 min.

Viabilidad 94.38; 92.68 y 87.74 %.

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14

I. INTRODUCCIÓN

Debido a la estacionalidad reproductiva, al asincronismo en la maduración gonadal presentada por machos y hembras y a la disminución en la calidad seminal observada dentro de la misma época reproductiva, en el que se hace necesario implementar estrategias como la crioconservación que permitan conservar los gametos obtenidos durante la época de reproducción, para asegurar la oferta permanente de alevinos, y constituyendo una herramienta importante para la conservación de la diversidad y para la acuicultura.

Sin embargo, la crioconservación de semen en peces, como en muchas otras especies, aún no es una técnica perfecta, teniendo efectos sobre la calidad espermática que compromete directamente la capacidad de la célula para participar con éxito en los procesos de fertilización y desarrollo embrionario, afectando la calidad morfológica de la larva y por lo tanto su sobrevivencia.

Durante el proceso de congelación, las sustancias crioprotectoras son esenciales para disminuir el daño espermático ocasionado por el descenso de temperatura.

Actualmente en el Perú existe escasos trabajos en esta rama, por lo tanto, el presente trabajo de investigación busca lograr nuevos avances en la reproducción artificial en peces; contribuyendo al conocimiento de las características seminales y a la estandarización de un protocolo para la crioconservación de semen del Piaractus brachypomus (paco).

Conociendo las bondades de la crioconservación y la problemática que aqueja al cultivo de peces tropicales dulceacuícolas para obtener alevinos por fuera del periodo reproductivo, se planteó el problema siguiente: ¿Qué porcentaje de concentración de dimetilsulfóxido y yema de huevo serán los adecuados para mantener a los espermatozoides del Piaractus brachypomus (paco) diluidos precongelado con similares características microscópicas al semen fresco, y mayor porcentaje de larvas normales

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15

postcongelado? Considerándose para ello dos hipótesis: Hipótesis I; como la acción de la yema de huevo es termoprotectora ésta no influirá en la primera etapa, obteniéndose similares características microscópicas al semen fresco con 5% de DMSO. Hipótesis II; la dilución del semen de Piaractus brachypomus (paco) con el diluyente a base de 7% de dimetilsulfóxido y 20% de yema de huevo se obtendrá el mayor porcentaje de larvas normales postcongelación. Planteándose para ello los siguientes objetivos:

General.

Determinar el porcentaje de concentración de dimetilsulfóxido y yema de huevo que serán los adecuados para mantener a los espermatozoides del Piaractus brachypomus (paco) diluido, con una buena calidad espermática en las etapas de precongelado y postcongelado.

Específicos.

 Determinar las características biométricas de los reproductores machos del Piaractus brachypomus (paco) utilizados en la investigación.

 Determinar las características macroscópicas (volumen, viscosidad, color) del semen fresco del Piaractus brachypomus (paco) utilizados en la investigación.

 Determinar las características microscópicas (motilidad, tiempo de activación, viabilidad y concentración espermática) del semen fresco del Piaractus brachypomus (paco) utilizados en la investigación.

 Evaluar el efecto de las diferentes concentraciones del dimetilsulfóxido y yema de huevo en las características microscópicas (motilidad, tiempo de activación, y viabilidad) en semen diluido (etapa precongelación) del Piaractus brachypomus (paco), sometido a un tiempo de equilibrio.

 Comparar el efecto de las diferentes concentraciones del dimetilsulfóxido y yema de huevo en las características microscópicas (motilidad, tiempo de activación, y viabilidad) entre el semen fresco y el semen diluido del Piaractus brachypomus (paco).

 Establecer el tratamiento que obtiene mayor porcentaje de larvas malformadas en Piaractus brachypomus (paco) postdescongelación.

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II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.

2.1. BIOECOLOGÍA DEL Piaractus brachypomus (PACO).

2.1.1 Características generales.

El Piaractus brachypomus (paco), en adelante nombrado como P.

brachypomus, es una especie nativa que se encuentra ampliamente distribuida en el río Orinoco, la cuenca del río Amazonas y la cuenca del río de La Plata en América de Sur (Chaparro, 1994; Lauzanne, L.

Loubens, G. et al., 1983; citado por Atta, 2006).

La cachama blanca es nativa de la cuenca del Amazonas y del Orinoco, aunque también se ha reportado como especie introducida en Asia. Habita en ciénagas y ríos, preferentemente en tributarios laterales, dependiendo de la disponibilidad de alimento. Se le ha reportado en zonas de Bolivia, Perú, Brasil, Venezuela, Colombia y Ecuador. Geográficamente se ubican en latitudes que van desde 23ºN a 11ºS (FAO, 2010).

2.1.2 Hábitos alimenticios.

El P. brachypomus es un pez omnívoro, su alimentación en el medio natural se basa en las frutas, semillas y hojas verdes que caen al agua.

Durante el periodo de inundación, se alimenta casi por completo de frutas y semillas que se encuentran en el bosque inundado, se alimenta principalmente de hojas después de la creciente, pero, ocasionalmente parte de su dieta puede ser peces pequeños e invertebrados. El crecimiento del P. brachypomus en su hábitat natural es significativamente menor comparándolo con el Colossoma macropomum. El P. brachypomus alcanza su madurez sexual un año más antes, además, es un consumidor menos agresivo y tiene un menor espectro alimenticio que Colossoma macropomum (Woynarovich, A. y Woynarovich, E. 1998; Goulding 1982; Da Silva 1988; citado por Atta, 2006).

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17

Los peces poseen sustancias de reserva almacenadas en los tejidos, como estrategia para tener una fuente de nutrientes disponible para el desarrollo de las gónadas al entrar en la etapa de migración, ayuno y maduración final (Ridelman et al 1984 citado por Wills et al., 2005).

Es bien conocido que una nutrición apropiada es uno de los factores más importantes que influencian la habilidad para alcanzar el potencial genético para crecimiento, reproducción y longevidad (Lall, 1991 citado por Wills et al., 2005).

La reducción de la ingestión de alimento es una ocurrencia natural durante el ciclo de vida los peces, incluyendo la migración para la reproducción (Mackkenzie et al., 1998, citado por Wills et al., 2005)

2.1.3 Taxonomía.

 Phylum : Chordata

 Sub-Phylum : Vertebrata

 Clase : Peces

 Subclase : Gnathostomata

 Orden : Characiformes

 Familia : Characidae

 Sub-familia : Serrasalmidae

 Género : Piaractus

 Especie : brachypomus (Cuvier, 1818)

 N.C. : Piaractus brachypomus: (Lauder

y Liem en 1983, Zubieta 2001; citado por Atta, 2006).

2.1.4 Sinonimia.

El nombre común o vernáculo del Piaractus brachypomus en los diferentes países se presentan de la siguiente manera:

 Bolivia : Tambaquí.

 Brasil : Pirapitinga, Tambaqui, Caranha.

 Colombia : Cachama blanca, Paco.

 Perú : Paco.

 Venezuela : Morocoto, Cachama. (Guerra et al 1996;

Woynarovich 1998; Alcántara, F. 1985; citado por Atta, 2006).

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18 2.1.5 Parámetros físico-químicos del agua.

Existen factores del medio ambiente que afectan tanto al desarrollo del pez como también al desarrollo de los futuros huevos, entre ellos se encuentran: la temperatura, la luz, el oxígeno disuelto, el potencial de hidrógeno y el alimento (Woynarovich, A. y E. Horváth, 1981, citado por Atta, 2006).

Prefiere aguas ligeramente ácidas, con pH entre 4,5 y 6,8. En condiciones naturales crecen a temperaturas de 23 a 28ºC (FAO, 2010).

Condiciones físico-químicas del agua para la incubación de cachama blanca.

 Temperatura 25 – 28,5 °C.

 STD Menor a 30 ppm.

 Oxígeno disuelto 4 – 6 ppm.

 pH 6,5 – 8,5.

 Amonio (no ionizado) 0,01 – 0,1 ppm.

 Alcalinidad ≥ 20 ppm.

 Dióxido de carbono 10 - 20 ppm.

 Conductividad 10 – 20 um. (FAO, 2010).

2.1.6 Madurez sexual.

El P. brachypomus alcanza la madurez sexual al tercer año de edad, con un peso que varía entre 2.5 a 3.0Kg. Las hembras pueden colocar en promedio de 100.000 - 150.000 huevos por kilogramo de peso vivo (Guerra, H. 2000; citado por Atta, 2006).

2.1.7 Reproducción natural.

La cachama blanca se caracteriza por desovar masivamente una vez al año a inicio de la época de lluvia, antes de producirse los niveles máximos de agua (noviembre y diciembre) (FAO, 2010).

2.1.8 Reproducción inducida.

En cautiverio los peces reofílicos realizan la maduración ovocitaria (vitelogénesis e inicio de la maduración final) pero no ovulan ni desovan debido a la falta de estímulos ambientales finales. La variación del caudal

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19

en los ríos ha sido reportada como el principal estímulo para la ovulación y desove de estas especies (Atencio-García, 2003; citado por Chaves et al., 2011).

Es posible inducir al macho a expulsar semen al practicarle masaje en la parte abdominal. La temperatura óptima para la reproducción y cultivo es entre 26 y 28,5 °C. El periodo de incubación de huevos es entre 15 y 18 horas, dependiendo de la temperatura (FAO, 2010).

La reproducción artificial inducida de peces en América Latina fue iniciada en Argentina, por Houssay (1928), sin éxito; luego, Ihering y Acevedo (1934), obtuvieron resultados positivos en “boquichico” Prochilodus sp, con hipófisis de la misma especie (Ascon, 1992).

En Colombia, Solano (1974), también logró resultados positivos en

“boquichico”. Con respecto al género Colossoma, los estudios sobre reproducción inducida fueron iniciados por Lovshin et al. (1974) y Da Silva (1977), en Brasil, quienes describieron las primeras técnicas para desovar y reproducir artificialmente “gamitana” Colossoma macropomum y “paco”

Piaractus brachypomus (Ascon, 1992).

2.1.9 Selección de reproductores.

La selección de los peces para inducción a la reproducción deberá ser realizada en el propio estanque, con base en las características extra genitales presentes durante el periodo reproductivo. Dentro de dichas características, las más importantes y fáciles de observar son las siguientes: En los machos maduros, al hacer leve presión en el abdomen dejan fluir su líquido espermático, el cual debe ser de aspecto blanco lechoso y de considerable viscosidad, no obstante, existen especies en las que por la conformación de las gónadas es literalmente imposible obtener semen al presionar el abdomen, dificultando enormemente el proceso de selección de machos (Zaniboni-Filho y Nuñer, 2004; citado por Senhorini et al., 2005).

2.1.10 Aplicación hormonal y obtención del semen.

La hormona más utilizada para inducir con éxito la maduración final y el desove en cautiverio de los bagres es el Extracto de Hipófisis o Pituitaria

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20

de carpa (EPC) que se adquiere con relativa facilidad en el comercio. Las dosis hormonales varían entre 5.5 y 6.6 miligramos de hormona por kilogramo de peso vivo o biomasa en dos inyecciones que se aplican con intervalos de 12 horas; sin embargo, se ha obtenido éxito en la reproducción de (Pseudoplatystoma fasciatum) utilizando Primogonyl, LHRH, Acetato de buserelina combinadas con EPC (Contreras y Contreras, 1989b; citado por Rodriguez et al., 2005).

El semen puede obtenerse de animales que han alcanzado la madurez gonadal espontáneamente o de ejemplares cuya espermiación ha sido inducida hormonalmente. En yamú (Brycon amazonicus) y cachama blanca (Piaractus brachypomus), una dosis de 4.0 mg.kg-1 de peso corporal de extracto de hipófisis de carpa (EHC), administrada vía intramuscular 18 a 24 h antes de la extracción del semen, ha mostrado ser efectiva para inducir la espermiación en estas especies (Cruz et al., 2004a; citado por Cruz et al., 2005).

2.1.11 Características físicas y químicas del semen.

El semen está compuesto por el plasma seminal y por los espermatozoides. La concentración de los componentes del plasma seminal puede variar de individuo a individuo dentro de una misma especie. Cabe destacar que su función es proveer un ambiente óptimo para el almacenamiento de los espermatozoides dentro y fuera de los testículos (Cierreszko et al., 2000, citado por Guarnizo, 2007).

2.1.12 Espermatozoides.

Las células espermáticas de los teleósteos, a diferencia de los mamíferos son relativamente simples, compuesta por una cabeza desprovista de acrosoma, lo cual está relacionado con la presencia en el oocito de un orificio conocido como micrópilo permitiendo la entrada del espermatozoide al ovulo y se produzca la singamia (Andrade et al., 2001; Grassiotto et al., 2001; citado por Ramirez et al., 2010).

El flagelo está constituido por el axonéma en arreglo de nueve pares de microtúbulos periféricos y un par central (Callard y Callard, 1999, Cosson et al., 2000), con una longitud entre 20 y 100 µm y una membrana plasmática que forma una especie de aleta en el plano horizontal

(21)

21

confiriéndole una forma acintada (Cosson et al., 1999; citado por Ramirez et al., 2010).

Finalmente, es necesario tener en cuenta que el espermatozoide de la mayoría de los peces teleósteos difiere del de mamíferos en cuatro aspectos importantes: a) es inmóvil al momento de la eyaculación; b) la movilidad es adquirida únicamente después de entrar en contacto con el agua; c) los espermatozoides permanecen móviles por un corto periodo de tiempo, raras veces superior a 50 s y d) los espermatozoides carecen de acrosoma. Estas diferencias determinan también variaciones en los protocolos utilizados para establecer la calidad seminal (Kime et al., 2001;

citado por Cruz et al., 2005).

2.2. EVALUACIÓN SEMINAL.

La evaluación del semen debe realizarse inmediatamente después de recolectado, ya que su movilidad disminuye rápidamente a medida que transcurre el tiempo. El semen puede ser conservado a temperatura ambiente; sin embargo, varios investigadores han recomendado mantenerlo bajo temperatura de refrigeración o colocarlo en hielo molido; pero experiencias realizadas en el laboratorio con semen de yamú (B. siebenthalae), mostraron que las bajas temperaturas disminuyen rápidamente la movilidad espermática en esta especie (Cruz et al., 2005).

La calidad del semen se puede evaluar en diferentes niveles de complejidad:

espermatocrito, viabilidad espermática, porcentaje de movilidad espermática, intensidad de movilidad espermática, ultraestuctura de los espermatozoides, composición química del plasma seminal o la capacidad de fertilización que poseen los espermatozoides (Rurangwa et al., 2001; citado por Guarnizo, 2007).

2.2.1 Calidad del esperma.

Pequeñas cantidades de contaminantes pueden afectar seriamente la calidad seminal, siendo la orina el contaminante más común, la cual es difícil de detectar debido a que no confiere coloración especial a la muestra de semen (Ciereszko et al., 2000; citado en Cruz et al., 2005).

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La contaminación con heces puede ocurrir con frecuencia, pero puede ser determina-da visualmente. Aún muy pequeñas cantidades de heces producen un incremento en la actividad de la fosfatasa alcalina en el plasma seminal, por lo que el nivel de actividad de esta enzima puede servir como indicador del grado de contaminación fecal de la muestra (Ciereszko et al., 2000; citado por Cruz et al., 2005).

Además, hay enormes diferencias en la calidad del esperma a nivel intra e interespecífico, estas diferencias son debidas fundamentalmente a la variabilidad genética, a la época del periodo reproductivo, a la biogeografía, la alimentación y el medio ambiente (Rana, 1995ª; citado por Chereguini, 2003).

2.2.2 Características macroscópicas.

Inmediatamente después de recolectada la muestra deben registrarse las siguientes variables: volumen, color y consistencia o viscosidad, lo cual debe hacerse directamente en el tubo empleado para la recolección del material seminal (Cruz, 2005).

a) Volumen.

Se mide directamente dentro del recipiente de recolección, por lo cual se recomienda siempre utilizar un tubo aforado para recibir el semen.

Esta característica se expresa en ml y su valor puede utilizarse posteriormente para calcular el número total de espermatozoides presentes en la muestra, así como la cantidad de espermatozoides obtenidos por kilogramo de reproductor (Cruz et al., 2005).

La densidad de siembra afecta el desarrollo gonadal y en general el desempeño productivo de los peces, debido principalmente a que al encontrarse en densidades altas tendrán problemas de baja calidad del agua y disponibilidad de alimento, lo cual aumenta el estrés de los animales, puesto que durante la fase de desarrollo gonadal son más sensibles a cambios en dichos parámetros (Filho y Nuñer, 2004 citado por Wills et al., 2005)

La cantidad de semen producida por un reproductor esta depende de muchos factores, incluyendo desde la especie hasta la habilidad del

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técnico que realiza su extracción; también el tratamiento hormonal con EHC aumentó significativamente el volumen de semen obtenido, pero disminuyó su concentración espermática (Cruz et al., 2005).

b) Viscosidad.

Es una medida subjetiva de la consistencia o densidad del material seminal, basada en el aspecto visual que presenta la muestra y que puede ir desde líquido hasta viscoso (Suquet et al., 1992; citado por Cruz et al., 2005).

Se califica en una escala de 0 a 4, siendo 0 el menor grado de viscosidad. Esta característica cualitativa está relacionada con la concentración espermática y el espermatocrito y es útil para decidir el grado de dilución a que debe someterse el semen para determinar su concentración (Cruz et al., 2005).

c) Color.

Esta característica sirve como referencia indirecta de la concentración espermática. Normalmente el semen debe presentar una coloración blanco marfil, cuya intensidad guarda relación directa con el número de espermatozoides por unidad de volumen. Sin embargo, la coloración del semen permite conocer principalmente la presencia de contaminantes, tales como materia fecal, bilis o sangre, los cuales afectan negativamente la calidad espermática. Es necesario anotar que carotenoides sintéticos presentes en algunas dietas comerciales, pueden producir una coloración rosada del semen, simulando contaminación con sangre (Cruz et al., 2005).

2.2.3 Características microscópicas.

Las características microscópicas del semen deben determinarse dentro de la media hora siguiente a su recolección, ya que como se mencionó anteriormente, a medida que pasa el tiempo su calidad disminuye considerablemente, especialmente la movilidad (Cruz et al., 2005).

a) Movilidad espermática.

Inicialmente puede estimarse el porcentaje de movilidad global o en masa, el cual consiste en observar una gota de semen

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inmediatamente después de adicionarle agua u otra solución activadora, la cual debe tener una osmolaridad inferior a la del plasma seminal, como por ejemplo bicarbonato de sodio (NaHCO3) al 1%, en proporción 1:10 a 1:100 (v:v, semen: solución activadora). La solución de NaHCO3 es especialmente útil para activar la movilidad espermática de semen crioconservado (Cruz et al., 2004a citado por Cruz et al., 2005).

La muestra así diluida debe observarse con objetivo de bajo aumento (máximo 10X) y la movilidad masal se califica subjetivamente con base en la amplitud de las ondas o remolinos que desplieguen las células en movimiento. Su valor puede expresarse directamente en porcentaje o en una escala de 1 a 4, donde 1 = 0 - 25 %; 2 = 25 - 50 %; 3 = 50 - 75 % y, 4 = 75 - 100 % de espermatozoides móviles (Suquet et al., 1992; citado por Cruz et al., 2005).

Activación de la movilidad espermática.

Los factores involucrados en la activación del esperma son fundamentalmente la presión osmótica, la composición iónica y el pH del plasma seminal. El conocimiento de estos factores es de gran importancia a la hora de crioconservar, ya que previamente hay que seleccionar espermas de buena calidad, es decir, que presenten mejor movilidad. La movilidad del esperma es usada como parámetro para evaluar su viabilidad ya que existe generalmente una correlación entre la presencia de movilidad del esperma y su capacidad fecundante (Stoss, 1983; citado por Chereguini, 2003).

Hasta el momento, han sido considerados dos mecanismos que mantienen inmóviles los espermatozoides en el fluido seminal, en peces de agua dulce. El primer mecanismo, observado en salmones principalmente, está basado en la concentración del potasio; cuando su concentración está elevada (por encima de 40 mM), la motilidad es inhibida y posteriormente activada cuando su concentración disminuye (menos de 25 mM). Y el segundo mecanismo, presente en la mayoría de las especies, está basado en la diferencia de la osmolaridad del plasma seminal con la del medio ambiente. La osmolaridad espermática, en especies de agua dulce, es inhibida cuando la

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osmolaridad del medio es mayor en relación con la del plasma seminal (encima de 300 mOsm.kg^-1), y activada cuando la osmolaridad ambiental es menor a 200 m Osm.kg^-1 (Ciereszko et al., 2000, citado por Guarnizo, 2007).

La activación de la movilidad espermática ocurre en respuesta a los cambios del medio externo, tales como: concentración de los iones, osmolaridad y pH (Morisawa y Susuki, 1980, Hamamah y Gatti, 1998; citado por Guarnizo, 2007).

El aumento en la concentración del crioprotector podría agudizar este evento disminuyendo así la movilidad y el tiempo de activación espermática (Guarnizo, 2007).

Es entonces claro hasta ahora decir que definitivamente los daños en la célula espermática que hacen sucumbir la calidad móvil del espermatozoide pueden ser originados por la toxicidad del crioprotector (por su exceso) o la no presencia de este (por defecto) en el interior de la célula, lo que desencadenó una vulnerabilidad ante los procesos de nucleación (Zachariassen, 2000; citado por Martinez, 2010).

Concentración entre 10 y 15% de DMSO disminuye significativamente la movilidad espermática del lobina rayada (Morone saxatilis), mientras que concentraciones cercanas al 5% no ocasionaron cambios significativos durante la primera hora (He y Curri, 2001; citado por Pinzón et al., 2005).

Tras la comparación 24 diluyentes a base de glucosa (GL) 5.5%, yema de huevo (YH) 12% y leche entera (LE) 5% como crioprotector no permeable y dimetilsulfóxido (DMSO), metanol (MET), y etilenglicol (ETG) en diferentes concentraciones (5, 10, 12 y 15%) como crioprotector permeable, evaluando el porcentaje de movilidad espermática precongelación en crioconservación de semen en bagre rayado (Pseudoplatystoma fasciatum), activado con bicarbonato de sodio (NaHCo3) al 1%, observó: 86.4 ± 2.3% con 5% DMSO + 5% LE + 5.5 GL; 72.5 ± 2.5% con 10% DMSO + 12% YH + 5.5%GL y 70.0 ±

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6.3% con 12% DMSO + 5% LE + 5.5% GL. Para el MET se obtuvieron 88.1 ± 2.4% con 10%MET + 5%LE + 5.5%GL y 77.5 ± 15.5% con 5%MET + 5%LE + 5.5%GL. Para ETG se obtuvieron 76.6 ± 3.3% CON 5% ETG + 5%LE + 5.5%GL. Y los menores porcentajes de motilidad masal precongelación fueron obtenidos con los diluyentes 15%DMSO + 12%YH + 5.5%GL (5.0 ± 0.0%), 15%MET + 5%LE + 5.5%GL (0.0 ± 0.0%) y 15%ETG + 5%LE + 5.5%GL (5.0 ± 0.0%) (Guarnizo, 2007).

Concentraciones de 5%; 10% y 15% de DMSO fueron agregados al diluyente Stein y Bayrle para evaluar la motilidad espermática del bagre rayado (Pseudoplatystoma fasciatum) almacenado a 4^ºC (refrigerado). La mayor movilidad fue con 5% DMSO (92 ±2%) y con 10% DMSO (81 ±4%), movilidad espermática más baja fue con 15%

de DMSO (37 ±3%), evaluados todos a los cero horas, el cual va disminuyendo con transcurso de las horas en todos los tratamientos (Pinzón et al., 2005).

La calidad y fertilidad de semen de cachama blanca (Piaractus brachypomus) crioconservado en cinco diferentes sustancias crioprotectoras: glicerol (GLY), dimetilsulfóxido (DMSO), metanol (MET), propilenglicol (PPG) y etilenglicol (ETG), en concentraciones 5, 10 y 15%. Para el GLY y DMSO usaron glucosa 5,5 g + yema de huevo 7.0 ml + agua destilada c.s.p. 100 ml, y para MET, PPG y ETG utilizaron leche entera en polvo 15 g, + agua destilada c.s.p. 100 ml reportándose los mayores porcentajes de movilidad masal postdescongelación con los tratamientos 15 g leche entera en polvo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 5% PPG (64 ± 2.4%), 15 g leche entera en polvo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 10% MET (57 ± 4.9%), 5,5 g glucosa +7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 5%

DMSO (55 ± 4.5%) y 5,5 g glucosa +7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 10% DMSO (40 ± 3.5%) y los más bajos porcentajes de motilidad postdescongelación se obtuvo con 15 g.

leche entera en polvo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 15% PPG (0%);

5,5 g glucosa +7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 10% GLY (1 ± 0.2%) y 5,5 g glucosa +7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 15% DMSO (2 ± 0.7%) (Navarro et al., 2004).

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La toxicidad de los crioprotectores y su efecto sobre la disminución de la movilidad espermática ha sido relacionado con el estado bioenergético del espermatozoide después del proceso observándose de congelación. En general concentraciones de 3.75% DMSO (60 ± 6%), y 5% DMSO (76 ± 2%), mostraron los valores más altos postdescongelación sin presentar diferencias significativas entre ellas y los más bajos fueron observados con 7.5% DMSO (57 ± 6%), 10%

DMSO (33 ± 4%), 11.25% DMSO (48 ± 5%) y 15% DMSO (2 ± 1%) (Cruz et al., 2006).

b) Tiempo de activación.

La duración e intensidad de la movilidad espermática permite inferir sobre la capacidad fecundante del semen estudiado. Esta variable es evaluada junto con la movilidad, cronometrando el tiempo transcurrido desde el momento en que se adiciona al semen la solución activadora, hasta la verificación de ausencia de movilidad espermática en la muestra (Cruz et al., 2005).

La duración de la movilidad espermática varía ampliamente entre las especies de peces y coincide en general con el periodo fértil del espermatozoide. Las características químicas, así como el volumen de la solución activadora utilizada determinan la duración de la movilidad del espermatozoide. Por ejemplo, una solución de NaHCO3 al 1%

aumenta el tiempo de activación de espermatozoides de yamú (Brycon amazonicus) y cachama (Piaractus brachypomus) (Navarro et al., 2000; citado por Cruz et al., 2005).

El desbalance iónico también juega un papel en la adquisición de la para la activación de la movilidad y está relacionado con los cambios en las concentraciones extracelulares de K⁺, Na⁺, HCO3, y/o iones de hidrógeno (Shinriki, 1998; citado por Tabares, 2005).

La toxicidad de los crioprotectores y su efecto en la disminución de la movilidad y del tiempo de activación espermático se encuentran relacionados con el estado bioenergético del espermatozoide después del proceso de congelación. Crioprotectores como DMSO o glicerol pueden inferir en el balance entre la síntesis y la utilización de ATP,

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ocasionando una inapropiada activación de fosfolipasas, proteasas y un daño celular irreversible (Hammerstedt y Graham, 1992; Holt, 2000; citado por Guarnizo, 2007).

Algunas hipótesis plantean la posibilidad que los crioprotectores interactúen directamente con las reservas de ATP, inestabilizando la molécula energética y disminuyendo su concentración en la célula. Así en Morone saxatilis, encontraron que el nivel de ATP precongelación disminuyó considerablemente cuando el DMSO entró en contacto con las células espermáticas, y que adicionalmente, el descenso en su concentración se vio aún más acentuado después de la congelación (He y Woods, 2004; citado por Martinez, 2010).

En cachama blanca (Piaractus brachypomus) el mayor tiempo de activación postdescongelación se dio con 15 g leche entera en polvo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 10% PPG (172 ± 17seg); 15 g leche entera en polvo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 10% MET (133 ± 5 seg); 5,5 g glucosa +7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 5% DMSO (103 ± 3.4 seg) y 5,5 g glucosa + 7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 10% DMSO (88 ± 11 seg), el tiempo de activación más bajo se observó en 5,5 g glucosa + 7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 10% GLY (40 ± 2 seg), 5,5 g glucosa + 7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 15% GLY (60 ± 22 seg) y 5.5 glucosa + 7.0 ml de yeme de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 15% DMSO (63 ± 13) (Navarro et al., 2004).

De los tratamientos evaluados se pudo evidenciar que el aumento de en la concentración del crioprotector ocasionó disminución en el tiempo de activación 3.75% DMSO (76 ± 4 seg), 5% DMSO (88 ± 6 seg), 7.5% DMSO (80 ± 4 seg), 10% DMSO (82 ± 5 seg), 11.25%

DMSO (89 ± 4 seg) y 15% DMSO (22 ± 6 seg) (Cruz et al., 2006).

Los espermatozoides de bocachico (Prochilodus magdalenae) con mayor tiempo de activación correspondieron a los tratamientos DMSO 5% y DMSO 10%, siempre que la concentración de la glucosa fue 6%

en ambos (30.38 ± 2.63 segundos y 27.38 ± 0.74 segundos,

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respectivamente), no en tanto, éstos no difirieron estadísticamente de tratamientos como DMSO 5%-5.5% glucosa. Por el contrario, los menores tiempos de activación fueron registrados en todos los tratamientos bajo la concentración DMSO 15%, no siendo posible observar tiempo de activación espermático alguno bajo el microscopio (o segundos). Así, estos tratamientos difirieron significativamente de todos aquellos bajo las concentraciones de DMSO 5% y 10%

(Martinez, 2010).

En bagre rayado (Pseudoplatystoma fasciatum), el tiempo de activación postdescongelación es de 84 ± 2 seg (Stein y Bayrle + 5%

de DMSO) y 85 ± 2 seg (diluyente 5.5% glucosa + 20% yema de huevo + 7.5% DMSO), y activada con bicarbonato de sodio (NaHCO3) (Pinzón et al., 2005).

c) Viabilidad.

Determina el porcentaje de células espermáticas muertas o con graves daños en la integridad de su membrana celular. Para el cálculo se utiliza el método de la coloración diferencial, empleando una solución de eosina y como colorante de contraste nigrosina, basada en que los espermatozoides muertos son permeables a los colorantes y por lo tanto aparecen coloreados en el micropreparado (Swanson y Bearden, 1951; citado por Cruz et al., 2005).

Diversos estudios han demostrado que la cantidad de lípidos y el perfil de ácidos grasos de las dietas de los reproductores tienen gran influencia sobre los niveles hormonales de los padrotes, calidad y composición de las ovas y semen, incubabilidad, desarrollo embrionario y sobrevivencia larval (Wills et al., 2005).

La composición y organización lateral de la membrana plasmática regula la afinidad por factores de adhesión, controla la permeabilidad de solutos hidrofílicos y dirige eventos de fusión y señalización celular (Frits y Baren, 2000). Las propiedades de la membrana están dadas por la proporción lipídica: 70% de fosfolípidos; 25% de lípidos neutros (especialmente colesterol) y 5% glicolípidos (Eddy y O´Brien, 1994) y por su organización asimétrica en los diferentes dominios de

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membrana que le dan una fluidez especial (Frits y Baren, 2000). Los fosfolípidos hacen parte del 65-70% del total de la membrana, los cuales le pueden conferir fluidez, pero también mayor inestabilidad, que es contrarrestada por las cantidades variables de colesterol (Holt, 2000; citado por Martinez, 2010).

En general, todo crioprotector ejerce efecto tóxico sobre el espermatozoide y se cree que las altas concentraciones de estos y durante periodos prolongados pueden desnaturalizar las proteínas celulares reduciendo la viabilidad durante la precongelación (Shlafer, 1981 citado por Guarnizo, 2007).

El mayor porcentaje de viabilidad espermática postdescongelación en cachama blanca (Piaractus brachypomus) se presentó en 15 g leche entera en polvo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 10% MET (29 ± 4%);

5,5 g glucosa + 7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 15% DMSO (23 ± 3%) y 5,5 g glucosa + 7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 10% DMSO (22 ± 7%) y los más bajos porcentajes de viabilidad postdescongelación se obtuvo con 5.5 g glucosa + 7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p + 5%

DMASO (11 ± 3) y 5,5 g glucosa + 7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 15% GLY (0%), 5,5 g glucosa + 7.0 ml yema de huevo + 100 ml agua destilada c.s.p. + 5% GLY (1 ± 0.5%) (Navarro et al., 2004).

Los menores daños a la membrana en gametos bocachico (Prochilodus magdalenae) se generaron en los tratamientos DMSO 10% - 5.5% glucosa (30.22 ± 2.15%), seguido DMSO 5% - 5.5%

glucosa (36.57±2.29%), sin haber diferencia estadística significativa entre ellos (p>0.05). Sin embargo, grandes porcentaje de células con daño en membrana, se observaron en tratamientos como DMSO 15%

- 6.5% glucosa (58.33 ± 2.81%), el cual fue significativamente diferente de todos los demás tratamientos (p<0.05) sin excepción (Martinez, 2010).

Concentraciones de DMSO iguales o superiores al 10% acortaron considerablemente la viabilidad de los espermatozoides en

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Pseudoplatystoma fasciatum bajo condiciones de refrigeración (4⁰C) (Pinzón et al., 2005).

d) Concentración espermática.

Consiste en el número de células espermáticas por unidad de volumen y se expresa en millones de espermatozoides por μl o por ml para su determinación se utiliza el método del hemocitómetro o cualquier cámara contadora de partículas como la de Neubauer, la cual ha sido empleada con éxito en muchas especies de animales domésticos (Sorensen, 1992) y en varias especies de peces (Kavamoto et al., 1985; Foglida Silveira et al., 1985; Neira et al., 1992; citado por Cruz et al., 2005).

Una vez contados los espermatozoides, la concentración espermática es calculada aplicando la siguiente fórmula:

CE = n / (A x P x D)

Dónde:

CE = Concentración espermática (número de espermatozoides.µl^-1).

n = Número promedio de espermatozoides contados en los cinco sub-cuadros de las dos cuadrículas.

A = Área de la cámara de Neubauer contada (generalmente 0.2 mm²).

P = Profundidad de la cámara (0.1 mm).

D = Dilución del semen (por ejemplo 1/1200, en yamú) (Cruz et al., 2005).

Una alternativa para estimar la concentración espermática consiste en estandarizar una curva de su relación con el espermatocrito, definido como la relación entre el volumen de las células empacadas y el volumen total de la columna de semen sometida a centrifugación, multiplicada por 100 (Cruz et al., 2005).

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Usaron solución salina al 0.9% para mantener inactivos a los espermatozoides de anchoveta peruana (Engraulis ringens) para calcular la concentración espermática (Catcoparco et al., 2010).

La disminución significativa de la concentración espermática, es a consecuencia del tratamiento hormonal para inducir la espermiación.

Por lo tanto, á baja concentración espermática observada en las muestras de Pseudoplatystoma fasciatum, podría atribuirse en primera instancia al efecto dilutor de la administración del EHO al ocasionar un aumento de las secreciones testiculares y por consiguiente del plasma seminal (Velasco et al., 2004; citado por Pinzón et al., 2005).

Se puede presentar disminución en la concentración de esperma, el total de esperma y motilidad cuando se reduce la vitamina C (Dabrowski iCiereszko, 2001 citado por Wills et al., 2005).

El ácido ascórbico juega un papel importante en la proliferación celular y la expresión genética (Ciereszko et al., 1999 citado por Wills et al., 2005).

Además, hay enormes diferencias en la calidad del esperma a nivel intra e interespecífico, estas diferencias son debidas fundamentalmente a la variabilidad genética, a la época del periodo reproductivo, a la biogeografía, la alimentación y el medio ambiente (Rana, 1995ª; citado por Chereguini, 2003).

2.3 CONCEPTOS E INVESTIGACIONES EN CRIOCONSERVACIÓN.

2.3.1 Crioconservación.

La crioconservación es una técnica para el almacenamiento de tejidos, células u otros materiales biológicos a muy baja temperatura, a la cual los materiales permanecen genéticamente estables y metabólicamente inertes (Hafez, 1986; citado en Pinzon et al., 2005).

La crioconservación requiere de la deshidratación de las células, inducidas por un diluyente que debe congelarse más rápido que las células en él contenidas (Harvey et. al., 1982), evitando así la formación de cristales de

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hielo y la concentración de los solutos intracelulares, lo cual es deletéreo para la célula (Hafez, 1986; citaado en Guarnizo 2007).

2.3.2 Agentes crioprotectores.

La mayoría de los crioprotectores son sustancias orgánicas con una fuerte afinidad por el agua que minimizan los daños celulares durante la congelación. En general, debido a sus propiedades coligativas, modifican las características físico-químicas de las soluciones, llegando incluso a reducir la velocidad de crecimiento de los cristales y modificar su forma (Vicente, 2001; citado en Garzon, 2007).

La finalidad de los crioprotectores es mantener la viabilidad celular durante un periodo determinado, previniendo el daño celular durante el proceso de congelación y descongelación, con características tales como: Solubles en soluciones acuosas de electrolitos, atravesar las membranas celulares y no ser tóxicos a altas concentraciones (Vincet et al., 1998; Mizukami et al., 1999, citado en RAMIREZ et al., 2010).

a) Crioprotectores permeables.

Dimetilsulfóxido (DMSO).

El DMSO ha sido muy utilizado en el estudio de congelación de semen, en los cuales se reporta la observación de efectos positivos en la descongelación del semen (Neira et al., 1992; citado por Guarnizo, 2007).

La interacción del DMSO con la célula puede tener diferentes mecanismos y se ha sugerido que existe una interacción electrostática entre el grupo sulfóxido polar del DMSO y la bicapa de fosfolípidos de la membrana plasmática (Anchordoguy, 1991; citado por Gauarnizo, 2007).

En general el DMSO ha sido mostrado como uno de los más efectivos crioprotectores para espermatozoides de muchas especies de peces cuando se compara con otros como: metanol, dimetilacetamida, glicerol, etilenglicol y propilenglicol (Kerby, 1983; He y Woods, 2003;

citado por Martinez, 2010).

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34 b) Crioprotectores no permeables.

Yema de huevo.

Los huevos han de ser frescos, no trascurrido más de cuatro días desde la postura hasta el momento de su utilización. La incorporación de la yema se realiza sobre el volumen final del diluyente base homogenizándose adecuadamente. Para eliminar las partículas gruesas se realiza centrifugación del diluyente. La yema de huevo posee acción termoprotectora, la cual es ejercida por la fracción lipídica compuesta por la lecitina y cefalina y una acción conservadora, dada por la acción de la lipoproteína (Ramos, 1986; Medina-Robles, 2005; citado por Guarnizo, 2007).

Se ha detectado que la eficiencia de la congelación de células espermáticas, se debe en gran parte a la acción protectora de la yema, debido a su contenido de lipoproteínas de baja densidad (Moussa et al., 2002; citado por Martinez, 2010).

Por otra parte, la yema de huevo ha sido usada con éxito en diluyentes en alianza con crioprotectores extracelulares para espermatozoides crioconservados (peces y mamíferos) contra el choque térmico durante el enfriamiento, congelación y descongelación (Cruz 2005;

Una explicación a este evento, es su composición química en términos de colesterol, ácidos grasos, lipoproteínas y fosfolípidos, los cuales influyen en la protección del semen crioconservado (Bathgat, 2006;

La adición de la yema de huevo como estabilizador de la membrana fue investigado por Cabrita et. al., (1998), quienes observaron que esta proporcionó una mayor supervivencia post-descongelación. Otros estudios demuestran que la adición de huevo de gallina a la muestra congelada protege la membrana de la célula espermática durante los procesos de congelación y mejora significativamente los porcentajes de fertilización post-descongelación (Babiak et al., 1995; citado por Guarnizo, 2007).

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El incremento de la concentración de crioprotectores no permeables (yema de huevo o leche descremada del 10% al 20%), en los medios Mounib o Ringer 200 al 10% de DMSO, la mayor movilidad espermática de rodaballo (Scophthalmus maximus) fue con 20%, en contraste con 10% de yema de huevo, y comparando la yema de huevo con la leche descremada, se observó mayor movilidad con yema de huevo (Chereguini, 2003).

La motilidad espermática postdescongelación del bagre rayado (Pseudoplatystoma fasciatum), tratado con 5.5% glucosa + 20% yema de huevo + 7.5% DMSO es mayor, 35±1 % de motilidad, en comparación con 3, 5, 10 y 15% DMSO, siendo cero la motilidad con estos tratamientos. El diluyente 5.5% glucosa + 20% yema de huevo + 7.5% DMSO, fue superior al diluyente Stein y Bayrle + 5%DMSO observándose solo un 31±1% de motilidad (Pinzón et al., 2005).

Carbohidratos.

Los azúcares presentes en los diluyentes ejercen un efecto positivo sobre la viabilidad espermática debido al aporte energético al espermatozoide, ya que estos son capaces de metabolizar glucosa, fructosa, manosa y arabinosa, esta última por la vía oxidativa; y su acción como crioprotectores contribuye a mantener el equilibrio osmótico. Y los azúcares (fructosa y glucosa) suministran energía a los espermatozoides en los procesos vitales y aportan sustitutos de electrolitos para el mantenimiento de la presión osmótica (Ramos, 1986; citado por Guarnizo, 2007).

Los efecto de la concentración de DMSO asociado con 5.5% de glucosa sobre la movilidad espermática de bagre rayado (Pseudoplatystoma fasciatum) almacenado a 4⁰C (refrigerado), la mayor movilidad es con 5% DMSO (94±1%), mientras que con 10%

DMSO solo se obtuvo un (68±6%) y la movilidad más baja se observó con 15% de DMSO (33±95) también evaluado a los cero horas, evaluado a las 24 horas se observó 66±4%, 10±3% y 0% de movilidad para 5, 10 y 15% DMSO respectivamente (Pinzón et al., 2005).

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36 3.3.3 Diluyentes.

Los diluyentes utilizados en peces han sido formulados simulando la composición y osmolaridad del plasma seminal de cada especie, con el propósito de no activar su movilidad, ya que soluciones no isosmóticas conducen a cambios iónicos produciendo la activación espermática (Medina et al., 2005; citado por Garzón, 2007).

2.3.4 Dilución y Empaque.

Por otro lado, hay que determinar la dilución esperma-diluyente que se empleará en la crioconservación. Aunque se han realizado investigaciones utilizando diferentes diluciones, los resultados son confusos. Así, en salmónidos no se han encontrado diferencias en la viabilidad del esperma descongelado utilizando diluciones (volumen de esperma: diluyente) que van desde 1:1 a 1: 9 (Truscott&Idler, 1969; Ott&Horton 1971;

Horton&Ott 1976; citado por Chereguini, 2003).

Los sistemas de empacado utilizados actualmente incluyen envases de diferentes volúmenes, que van desde microtubos de 0,08 ml hasta macrotubos de 5,0 ml. También son empleados pellets (0,07-0,1 ml) y pajillas plásticas de pequeño volumen (0,25-0,5 ml), siendo estas últimas utilizadas con éxito en varias especies de peces (Lahnsteiner y col 1996, Lahnsteiner 2000, Cruz-Casallas y col 2004; citado por Medina et al., 2007).

El material seminal del yamú (Brycon amazonicus) se diluyó en proporción 1:4 (semen:diluyente) y evaluaron diferentes volúmenes de empaque 0.5;

1.8; 2.5 y 4.0 ml obteniendo mejores resultados en pajillas de 0,5 ml (Medina et al., 2007).

El semen de cachama blanca, (Piaractus brachypomus) se diluyó en proporción 1:4 y se empacó manualmente en pajillas francesas de 0.5 ml (Navarro et al., 2004).

Para bagre rayado (Pseudoplatystoma. fasciatum) diluyo el semen con el diluyente en proporción 1:6 (1 parte de semen y 5 partes de diluyente) y el empaque se hizo en pajillas francesas de 0.5 ml (Guarnizo, 2007).

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37 2.3.5 Tiempo de equilibración.

Para que el crioprotector penetre en la célula antes del proceso de congelación es preciso dejar un tiempo que llamamos de equilibración. La tasa de incorporación de éste dependerá del tamaño de la célula y del peso molecular del crioprotector; así el metanol con un peso molecular más bajo penetra más rápidamente que el glicerol (Harvey &Ashwood- Smith, 1982; citado por Chereguini, 2003).

Sobre este punto también hay resultados contradictorios, mientras Harvey (1983) recomendó eliminar el tiempo de equilibración, es decir, congelar inmediatamente tras diluir el esperma en el diluyente que contiene el crioprotector, Rana et al. (1990) sugieren tiempos de equilibración entre 30-90 minutos y encuentran que hay una interrelación entre el diluyente y el tiempo de equilibración, es decir, que el tiempo de equilibración dependerá del diluyente. Sin embargo, en los trabajos de crioconservación más recientes se elimina o reduce este tiempo para evitar el efecto tóxico del crioprotector y la posible activación del esperma por el diluyente o por el crioprotector (Chereguini, 2003).

El tiempo de exposición del semen de bocachico (Prochilodus magdalenae) en el diluyente a los 15 minutos pos-mezcla, no afecta significativamente la calidad del espermatozoides en términos de motilidad y que por tanto las características permanecen intactas con respecto del semen fresco, la movilidad rápida (Ma)=78.66±2.51% y Movilidad Total=

99.83±0.15% (Martinez, 2010).

2.3.6 Proceso de crioconservación.

A pesar que la crioconservación garantiza el mantenimiento del espermatozoide por largos periodos de tiempo, esta puede ocasionar daño irreversible a la membrana plasmática por la formación de cristales de hielo, o por la despolarización de la membrana como consecuencia del intercambio iónico, conllevando a la activación y capacitación espermática espontánea (Lahnsteiner et al., 2000; citado por Ramirez et al., 2010).

2.3.7 Crioconservación del semen de peces.

El proceso de crioconservación de semen involucra diferentes cambios intracelulares que pueden originar una disminución en la sobrevivencia

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espermática. El control de la velocidad de cambio de la temperatura, la osmolaridad y la formación de cristales de hielo en el medio intra y extracelular son los aspectos más relevantes para optimizar la viabilidad celular (Medina-Robles et al., 2004; citado por Martinez, 2010).

La calidad de la composición del plasma seminal, el semen apto para la crioconservación debe contener osmolaridad elevada (encima de 320 mOsm.kg-1) y pH menor que 8.2 (Lahnsteiner et. al., 1995; citado por Guarnizo, 2007).

2.3.8 Efecto de la crioconservación sobre la célula espermática.

La crioconservación de espermatozoides de agua dulce generalmente reduce la fertilidad post descongelación del semen; este daño del esperma ha sido monitoreado por medio de estudios de bioquímica y de ultra estructura celular (Billard, 1983; Ogier de Baulny et al., 1997; citado por Ramirez et al., 2010).

a) Daño morfoló