CAPÍTULO III: USO DE CICLODEXTRINAS EN BIOTECNOLOGÍA
3. Uso de ciclodextrinas en biotecnología enzimática
3.3. R ESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.3.1. Lombarda
3.3.1.1. Extracción, efecto de pH y SDS
La extracción de POD de lombarda se llevó a cabo en dos fases: por una parte, en medio tamponado se extrajo la POD soluble y por otra parte, utilizando TX-114 para hacer la digestión de las membranas celulares, se extrajo POD ligada a membranas.
En la Tabla 3.1 se muestran los resultados obtenidos en cuanto a proteína, actividad enzimática total y actividad específica en cada una de las partes.
La cantidad de proteínas solubles extraídas en medio tamponado, a partir de 50 g de lombarda fue de 125 mg y las unidades de enzima totales 475, lo que supuso una actividad específica de 3.8 U/mg.
En el caso de POD ligada, se obtuvieron 70 mg de proteína, con 365 unidades enzimáticas y por tanto, una actividad específica de 5.2 U/mg.
Estos resultados indicaron que en el caso de las proteínas ligadas a membrana extraídas con TX-114, POD es más abundante proporcionalmente hablando, que en el caso de las proteínas solubles extraídas sólo con tampón.
Tabla 3.1. Actividad específica y total de POD ligada y soluble de lombarda.
Formas Enzimáticas Vol (mL)
Proteína total (mg)
Actividad totala (U)
Actividad específica(U/mg) Sobrenadante
(POD soluble)
70 125 475 3.8
Sobrenadante 4%
TX-114 (POD ligada)
17 70 365 5.2
aABTS como donador.
El pH es un factor determinante en la expresión de la actividad enzimática.
La Figura 3.6A muestra el perfil de pH en el caso de POD ligada (círculos negros) en un rango de pH de 3.0 a 9.0. El pH óptimo para POD ligada de lombarda fue de 4.0, similar al obtenido para POD de la fruta marula (Mdluli, 2004) e inferior que el obtenido para POD de melón (Rodríguez-López y col., 2000), pimiento (Serrano-Martínez y col., 2008) o alga roja (Fortea y col., 2011).
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Figura 3.6. (A) Efecto del pH en la actividad de POD ligada en ausencia (●) o en presencia (○) de SDS 1.5 mM. El medio de reacción, contenía a 25 ˚C 100 mM de tampón acetato sódico (pH 3.0-5.0), 100 mM de tampón fosfato sódico (pH 6.0-7.5) ó 100 mM de tampón borato sódico (pH 8.0-9.0), 20 µg/mL de proteína, ABTS 2 mM, H2O2 4 mM y tropolona 0.2 mM, en un volumen final de 1 mL. (B) Efecto de la concentración de SDS en la actividad enzimática. El medio de reacción estándar a pH 4.0 contenía concentraciones crecientes de SDS de 0 a 1.5 mM.
pH
3 4 5 6 7 8 9
V(M/min)
0 1 2 3 4
5 A
[SDS] mM
0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5
V(M/min)
0 1 2 3 4 5
B
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Detergentes aniónicos, como SDS, interaccionan fuertemente con proteínas cargadas y las desnaturalizan. La interacción de las proteínas con compuestos anfifílicos con largas colas hidrocarbonados, como es el caso del SDS, da lugar a cambios conformacionales en las proteínas (Ruso, Deo y Somasundaran, 2004). El efecto activador o inhibidor que puede tener SDS sobre diferentes enzimas, incluyendo PPO y POD, se encuentra ampliamente descrito en la literatura. En el caso de POD, SDS mostró efecto inhibidor en diferentes ocasiones (Nazari y col., 2005; Fortea y col., 2009).
El perfil de pH de POD ligada se analizó en presencia de 1.5 mM de SDS (Figura 3.6A, círculos blancos). La enzima fue inactivada por este detergente en todos los pHs analizados. Un efecto similar fue descrito con anterioridad para POD de rábano (Nazari y col., 2005), uva de mesa Crimson seedless (Fortea y col., 2009) o en el alga roja Mastocarpus stellatus (Fortea y col., 2011).
El efecto del SDS depende de la concentración de surfactante utilizado, tal y como se aprecia en la Figura 3.6B. La actividad enzimática disminuyó con el aumento de la concentración de SDS, alcanzándose la inactivación total a una concentración de SDS 1.5 mM. Esta inactivación se debe a cambios conformacionales producidos en la proteína por la interacción con las moléculas de detergente. Estos resultados contrastan con los descritos para PPO de diversas fuentes vegetales, donde SDS muestra un efecto activador de la actividad enzimática (Núñez-Delicado y col., 2005; Cabanes y col., 2007; Fortea y col., 2009).
En el caso de POD soluble (Figura 3.7A), al estudiar el efecto del pH en la oxidación de ABTS (círculos negros) se observó un pH óptimo de 4.0. Este resultado es idéntico al observado para POD ligada descrita en el apartado anterior. El efecto del pH en la actividad de POD soluble se estudió en presencia de SDS 0.5 mM (Figura 3.7A, círculos blancos). La enzima fue inactivada en todos los pHs estudiados, aunque a pH 5.0 se observó solamente una pequeña inhibición en presencia de SDS. El grado de inactivación con SDS a pH 5.0 para POD soluble fue de 1.5 veces, mientras que en el caso de POD ligada fue 2.8 veces.
Si comparamos el efecto de la concentración de SDS en ambas enzimas, POD soluble y ligada, se observó un efecto inhibitorio en ambos casos. Sin embargo, este efecto fue mucho más acusado para POD soluble, donde la inactivación completa de la enzima se observó a una concentración menor de SDS (0.5 mM) (Figura 3.7B).
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Figura 3.7. (A) Efecto del pH en la actividad de POD soluble en ausencia (●) o en presencia (○) de SDS 0.5 mM. El medio de reacción, contenía a 25 ˚C 100 mM de tampón acetato sódico (pH 3.0-5.0), 100 mM de tampón fosfato sódico (pH 6.0-7.5) ó 100 mM de tampón borato sódico (pH 8.0-9.0), 20 µg/mL de proteína, ABTS 5 mM, H2O2 3 mM y tropolona 0.2 mM, en un volumen final de 1 mL. (B) Efecto de la concentración de SDS en la actividad enzimática. El medio de reacción estándar a pH 4.0 contenía concentraciones crecientes de SDS de 0 a 0.5 mM.
pH
3 4 5 6 7 8 9
V(M/min)
0 1 2 3 4 5 6 7
[SDS] mM
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
V(M/min)
0 1 2 3 4 5 6 7
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