FRUCTANOS DE AGAVE COMO MATERIA PRIMA Y SU CARACTERIZACIÓN

azul, se acumulan durante su crecimiento, cantidades crecientes de fructanos mixtos ramificados (Wang y Nobel, 1998), los cua- les poseen un gp de entre 3 y 37 unidades

(Lopez et al., 2003; Mancilla-Margalli y López, 2006; Michel-Cuello et al., 2012; Ravenscroft et al., 2009), aunque se han reportado hasta gp de 70 sólo en el tallo del agave (Praznik et al., 2013). Aldrete- Herrera en 2013 reportó un gp apa- rente de 80 en A.

tequilana. Los pará- metros de calidad de los fructanos de agave se están definiendo en términos de sus compues- tos mayoritarios y minoritarios, particularmente la proporción de fos y fructanos, el gp, el contenido de monosa- cáridos, de cenizas y de humedad, lo cual determina la pureza de los compuestos mayoritarios de interés (fructanos de agave).

Estos parámetros de calidad al igual que el rendimiento de fructanos son dependientes de la especie, las condiciones del suelo, la región de cultivo, la madurez cronológica y fisiológica de la planta, así como de las características de la materia prima utilizada, ya sea la piña (tallo más bases foliares con mayor o menor longitud) o sólo el tallo (órgano de almacenamiento de reservas), ya que son estructuras morfológicas de la planta con funciones fisiológicas distintas.

Los fructanos de cadena larga presentan gran interés

de aplicación por sus propiedades fisicoquímicas

y reológicas, mientras que los de cadena corta por sus

propiedades funcionales como prebiótico

Existen metodologías sencillas para evaluar parámetros de calidad de los fructanos de agave, como son contenido de monosacári- dos, cenizas, saponinas y humedad, por otro lado se han desarrollado métodos analíticos para profundizar en detalle su composición y estructura. Así, existen técnicas de cribado (screening) como la cromatografía en capa fina (tlc, por sus siglas en inglés), semi cuan- titativas como la cromatografía en capa fina de alta resolución (hp-tlc, por sus siglas en inglés) que permiten identificar y cuantificar compuestos presentes en una muestra al compararlos con patrones de estándares (Alvarado et al., 2014). Algunas otras técnicas analíticas como la cromatografía de líquidos de alta resolución (hplc, por sus siglas en inglés) con columna de intercambio iónico, permite la identificación y cuantificación de mono, di, tri y tetra-sacáridos mediante un estándar externo, sin embargo, la limi- tante de esta técnica es que los fructanos mayores que cinco grados de polimerización los integra en una sola área, en el mismo tiempo de retención del estándar de inu- lina de achicoria, sin que los fructanos de agave sean precisamente iguales a los de inulina, debido a lo reportado por López et al., (2003) los fructanos de agave son de estructuras complejas y ramificadas. En cuanto al grado de polimerización promedio se ha recurrido a estimaciones por croma- tografía de exclusión de tamaño de alta resolución (hp-sec, por sus siglas en inglés), mediante compuestos de peso molecular conocidos (dextrinas), y a la abundancia que presenta cada polímero de fructosa de diferente grado de polimerización de la muestra; estas estimaciones indican el grado de poli dispersión de fructanos (Camacho- Ruíz y Hernández López, 2015).

Los métodos analíticos comúnmente utili- zados para la determinación del grado de polimerización de fructanos de agave son los siguientes:

» Hidrólisis enzimática

La cuantificación de fructanos por el método enzimático, consiste en purificar el fructano para que esté libre de otros polisacáridos y posteriormente se hidroliza con un coc- tel de inulinasas. La fructosa resultante se cuantifica por los métodos tradicionales.

Aunque esta técnica ha funcionado bien para los fructanos del tipo inulina (lineal con enlaces β-2,1), subestima la cuantificación de fructanos ramificados y complejos como los del agave ya que el coctel de endo y exo inulasas utilizados no logra hidrolizar por completo los enlaces β-2,6) presentes.

Además con esta técnica sólo se puede obtener la concentración de fructanos tota- les y no un perfil de tamaños de fructanos o cuantificación de fos (Chacón, 2006).

» Cromatografía de intercambio iónico La Cromatografía de Intercambio Aniónico de Alto Rendimiento con Detector de Pulsos Amperométricos (también conocida como hpaec-pad por sus siglas en inglés), es una de las técnicas más utilizadas para determi- nar la longitud de cadena y polidispersidad del gp en fructanos de diferentes vegetales (Benkeblia, 2013). Éste es el método oficial para la detección y cuantificación de oligo- fructanos en el método 997.08 de la aoac el cual es útil para cualquier alimento y ha demostrado ser muy confiable y exacto (Coussement, 1999). Se ha demostrado la

capacidad de esta técnica con gradientes lineales, para separar en picos individuales a los fructanos tipo inulina. Sin embargo, en la separación de fructanos de agave, se ha logrado con éxito la separación de fruc- to-oligosacáridos. No es posible la separa- ción de fructanos de agave con gp>10, con gradientes lineales debido a la complejidad de estructuras que presentan los fructanos de agave, discutida anteriormente. Ortiz- Basurto (2008), reportó el uso de gradientes escalonados para inducir la separación de fructanos de agave con gp>10 en grupos.

Al comparar los tiempos de elusión de los perfiles obtenidos de los fructanos de agave con un estándar de inulina, con el mismo gradiente, se puede determinar la polidis- persidad y el gp aparente de fructanos de agave de diferentes especies y/o fracciones enriquecidas de fructanos de agave. Entre los inconvenientes que podemos encontrar en este método es que muestran resultados con desviaciones estándar elevadas, cuando la muestra tiene alto contenido de azúca- res, maltodextrinas y/o almidón (Madrigal y Sangronis, 2007).

» Espectrometría de masas

El maldi-tof se denomina maldi por sus siglas en inglés Matrix-Assisted Laser Desorption/

Ionization (Desorción/Ionización Laser Asistida por Matriz) y tof por el detector de iones que se acopla al maldi y cuyo nombre procede también de sus siglas en inglés Time-Of-Flight (Tiempo de Vuelo). Es una técnica de ionización suave utilizada en espectrometría de masas que se ha utilizado para la vinculación y la determinación de secuencias de oligosacáridos y puede ser considerado una herramienta eficaz

para la caracterización estructural de los carbohidratos, que ofrece resultados precisos con versatilidad analítica y muy alta sensibilidad. Esta técnica analítica ha sido utilizada con éxito para determinar el tamaño molecular, permitiendo la caracterización de la masa molar dando el máximo gp, y una fácil verificación de la media de gp desde el registro de una señal para cada cadena presente en la muestra.

El inconveniente principal, una vez más, es la necesidad de un equipo maldi-tof, el cual es un equipo muy sofisticado que implica altos costos y requiere personal capacitado para su uso. Además, es difícil obtener un cromatograma donde se incluya toda la dispersión de tamaños de una sola muestra, ya que según las condiciones de operación, se favorece la visualización de altos o bajos pesos moleculares, más no de ambos. Evans et al., (2016) reportaron que esta técnica es menos efectiva en identificar especies de alto peso molecular.

» Cromatografía en capa fina

Se implementó una técnica de cromatografía en capa fina (tlc) para la cuantificación de oligosacáridos de diferente peso molecular.

Se emplearon estándares como fructosa;

1-kestosa, nistosa, sacarosa y oligosacáridos de glucosa comerciales, debido a que en el mercado no es posible encontrar estánda- res de oligómeros de fructosa. Aunque no fue posible la cuantificación de todos los oligosacáridos presentes en los fructanos, la técnica reveló una buena separación de los oligómeros de fructosa contenidos en los fructanos de agave y fue posible identificar perfiles típicos de acuerdo a la migración de las moléculas (Alvarado et al., 2014).

Este método permite la caracterización de dichos perfiles en muestras de fructanos comerciales así como la discriminación entre fructanos de agave y fructanos de achicoria.

» Fracciones de Fructanos - HPLC Una muestra de jugo de agave contiene principalmente fructooligosacáridos (fos) de gp menor a 10, Fructanos de gp mayor a 10, saca- rosa, glucosa y fruc- tosa. Así el perfil de carbohidratos se puede determinar combinando técnicas cromatográficas y de filtración. La estrategia general es determinar la con- centración inicial de sólidos solubles con un refractómetro y por cromatografía líquida de alta precisión (hplc) la concen- tración de sacarosa-glucosa-fructosa de la muestra de jugo de agave purificado y clarificado (ja). Posteriormente la muestra se filtra con una membrana mwco 3kDa para separar la mayor proporción de fruc- tanos>10 (A) de los fos<10 (B). Finalmente ja, a y b se hidrolizan a totalidad por inter- cambio iónico y nuevamente se determina la concentración de glucosa-fructosa por hplc, esto representa el 100% de carbohidratos en la muestra y por diferencia se estima la proporción de a y b. Este método per- mite estimar rápidamente la proporción de fructanos grandes y chicos en una muestra (Alvarado et al., 2014).

» Cromatografía de exclusión

La caracterización de un polímero requiere conocer la distribución de pesos moleculares en la muestra y una de las técnicas analí- ticas utilizada para conocer esta distribu- ción es por cromatografía de exclusión

de tamaños de alta resolución (hp-sec). A partir de ella se pueden obtener cur-

vas de distribución de pesos moleculares (Praznik et al., 2013).

La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel o de tamiz mole- cular) es una de las téc- nicas más sencillas de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de las partículas, sólo podrán moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso. En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria;

en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular (Harris, 2007). Se han implementado métodos para determinar la distribución de tamaños en fructanos de agave comerciales, utilizando cromatografía de exclusión (Camacho-Ruíz y Hernández-López, 2015).

Una muestra de jugo de agave contiene [...]

fructooligosacáridos (

) de

menor a 10, fructanos de

mayor a

10, sacarosa, glucosa y

fructosa.

Hay un inconveniente importante en este método ya que también los grupos ter- minales reductores de moléculas de los fructanos se reducen en alditol, por lo tanto estos grupos terminales escapan del análisis; esto implica que la recupe- ración de difructosa (F2) es sólo el 50%, para kestosa (F3) 67%, para nistosa (F4) 75% … progresivamente. La metodología de la aoac 999.07, consta de tres fases;

extracción, hidrólisis enzimática y determi- nación de azúcares por cromatografía. En el primer paso se extraen los fructanos y se cuantifican azúcares libres en la mues- tra, posteriormente se somete a hidrólisis enzimática con amiloglucosidasa y se cuan- tifican azúcares libres provenientes de la hidrólisis del almidón, para posteriormente hacer una segunda hidrólisis con inulinasas y se hace una determinación de azúcares, obteniendo los azúcares totales (glucosa y fructosa total) y a partir de la cuantifi- cación de azúcares en cada fase se puede obtener el contenido total de fructanos (Prosky y Hoebregs, 1999).

Hay dos métodos oficiales para la cuan- tificación de fructanos en los alimentos, El método 999.03 y 997.08 de la aoac. Ambos métodos analíticos están diseña- dos para inulina / fos. La metodología 999.03 es un método enzimático espectro- fotométrico que consiste en la extracción de fructanos del alimento utilizando agua caliente. El extracto es tratado con inver- tasa y amilasa para romper los enlaces de la sacarosa y almidón presentes en la muestra y obtener así azúcares reducto- res, en este punto del método se tiene solo azúcares reductores y fructanos.

Los azúcares reductores provenientes del almidón y la sacarosa son reducidos a poli-alcoholes, utilizando borohidruro de sodio. Después por acción de exo y endo-inulinasas se rompe los fructanos presentes en la muestra obteniéndose azúcares reductores, los cuales son cuanti- ficados mediante el método colorimétrico PAHBAH (Madrigal y Sangronis, 2007).