Identificación molecular

Con el motivo de confirmar los resultados recopilados en la identificación bioquímica, se desea identificar de forma molecular los 5 aislamientos que superaron las pruebas mencionadas para cumplir con el carácter probiótico. Posteriormente, se amplificó la región codificante para el ARNr 16S, con los primers universales 27F y 1492R. Luego, dichas regiones fueron secuenciadas por la empresa Macrogen Inc.

En cuanto a los resultados obtenidos, se confirmó mediante alineaciones en BLASTN que los 5 aislamientos poseen mayor porcentaje de identidad con el género Enterococcus. Dicho

género es clasificado como BALs, con morfología de coco, Gram positiva, oxidasa, catalasa y movilidad negativos, siendo fermentadores de glucosa (18). De esta información, se extrae que las pruebas bioquímicas primarias son coincidentes con los resultados obtenidos en la identificación molecular.

El resultado arrojado por Blastn también demostró que 2 aislamientos tenían mayor porcentaje de identidad con E. faecium (3.3.MRS y 3.5.MRS) y 3 aislamientos por E. hirae (4.2.MRS, 4.3.MRS y 4.3.BDA).

Es preciso mencionar que ciertas cepas de E. faecium poseen la capacidad de ser probióticas, sin embargo, muchas otras cepas de este género son clasificadas como patógenos oportunistas, con capacidad de causar infecciones en humanos. Se ha reportado que poseen la capacidad de tener resistencia antimicrobiana y antibiótica en humanos, mientras que en perros se establecen de forma asintomática, como reservorios de virulencia (82). Se han detectado distintos genes de virulencia presentes en esta especie, como los son los genes asa1, esp, gelE, entre otros (128). En cuanto al carácter probiótico, se han reportado una variedad cepas de E. faecium.

E. faecium NCIMB 10415 induce efectos positivos en la MIC, en la medida que genera un incremento en otras BALs presentes, así como también una mejora en la calidad de la materia fecal y una reducción de colesterol, siendo esto último favorable para perros con hipercolesterolemia (129).

E. faecium IK25 es una cepa aislada de materia fecal de caninos y se ha reportado que posee actividad antimicrobiana frente a distintas cepas de L. monocytogenes y resistencia a SB y pH ácido (130).

E. faecium M74 y E. faecium SF-68 poseen estatus GRAS y están incluidos en suplementos dietarios comerciales para perros como FortiFlora y Cernivet, respectivamente (82).

En cuanto a E. hirae, se han reportado principalmente funciones benéficas, como lo son la actividad antimicrobiana, la inhibición de la proliferación de células tumorales en distintos tipos de cáncer, y el aumento de respuesta en células T CD8 y la producción de citoquinas antiinflamatorias, manifestando un rol potencial en regular la función de las Treg (131).

Además, se ha estudiado el potencial probiótico in vitro de la misma simulando condiciones presentes en la MIC, y resultando en que ciertas cepas de E. hirae (no mencionadas) poseen resistencia a pH ácido y susceptibilidad a una variedad de antibióticos (vancomicina, ampicilina, amoxicilina, entre otros), y producción de diacetil (132).

Por tales razones, se decide buscar genes específicos de ambas especies en cuestión, en orden de confirmar la especie de estas.

Para ello, se sintetizan primers contra genes específicos de estas dos presuntas especies.

Para E. faecium se sintetizan primers para el gen gelE. Este es un gen de virulencia presente principalmente en E. faecium y E. faecalis, que está involucrado en la producción de toxinas que hidrolizan elastina, colágeno y hemoglobina, y se asocia a determinadas cepas patógenas de E. faecium, por lo que la ausencia de estos otorga una aproximación primaria en descartar su patogenicidad y en determinar el carácter probiótico de los 2 aislamientos involucrados

(78). En consecuencia, se realiza una PCR tiempo final utilizando los primers universales para la detección del ARNr 16S (27F y 1492R) y los primers específicos para la detección de gen gelE (gelEF y gelER) y se visualizan los resultados en gel de agarosa al 1%, como se observa en la Figura 9. Se decidió agregar primers para la detección del ARNr 16S debido a que las temperaturas de annealing de ambos pares de primers son similares (52 ^oC para ARNr 16S y 54 ^oC para gelE), utilizando la temperatura que favoreciera la unión a gelE. Otra razón del uso de dos pares de primers se debe a que no se observaba amplificación del gen gelE utilizando únicamente su par de primers específicos, y se decidió emplear primers contra 16S con motivo de chequear el correcto funcionamiento de la PCR.

Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de PCR tiempo final para la detección de gen ARNr 16S y gelE. Se observa presencia de bandas para el gen 16S, y ausencia de bandas para el gen gelE. MP: Marcador de peso molecular

#SM0331. 1: 3.3.MRS, 2: 3.5.MRS, 3: 4.2.MRS, 4: 4.3.MRS, 5: 4.3.BDA, 6: E.coli y 7: Control negativo.

A pesar de que se encuentra reportado que el gen gelE está presente en especies de E.

faecium y E. faecalis, se decidió probar si todas las muestras presuntas Enterococcus presentaban dicho gen de virulencia.

Como se observa en la Figura 8, hay amplificación para todas las muestras en el orden de los 1400 pb, coincidente con el peso molecular del gen ARNr 16s. Como contrapartida, no se observa presencia de bandas para el gen gelE, que deberían ubicarse en el entorno de las 419 pb. Sería prudente contar con un control positivo de E. faecium patógeno en donde se pueda amplificar este gen de virulencia. Un resultado no favorable es la expresión de una banda en el control negativo, en el entorno de los 1400 pb. Esto puede deberse a que existe una contaminación del mix, particularmente de reactivos como los primers, dNTPs o H2O mQ.

Se realizaron repeticiones de dicha PCR, visualizando estos resultados en forma continua, y por cuestiones de tiempo no se pudo descartar dicha contaminación.

A partir de este resultado, se infiere que posiblemente los 2 aislamientos presuntos E. faecium no poseen uno de los genes de virulencia especificados para ser bacteria patógena, por lo

(asa1, esp, entre otros), y de la misma forma, genes que sean específicos de E. faecium, para lograr secuenciarlos y confirmar su especie. Además, se concluye que los 3 aislamientos restantes tampoco poseen dicho gen de virulencia.

De la misma forma, para E. hirae se sintetizan primers específicos para mur2. mur hace referencia a muramidasa, siendo mur2 una enzima encargada del crecimiento celular, ubicada en la pared celular de peptidoglicano de E. hirae (79,133). Otro de los procesos biológicos asociados a esta enzima estriba en su acción como antipatógena rompiendo la pared celular de las mismas, inhibiendo su crecimiento. Es por estas razones que lograr la amplificación de este gen colabora en especificar que los 3 aislamientos de E. hirae son potencialmente probióticos. Para esto, se realiza una PCR tiempo final y se visualizan los resultados en gel de agarosa al 1%, como se observa en la Figura 10.

Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de PCR tiempo final para la detección de mur2. Se observa presencia de banda para 3 aislamientos, mientras que se observa ausencia de banda para 2 aislamientos y controles. MP:

Marcador de peso molecular #SM0331, 1: 3.3.MRS, 2: 3.5.MRS, 3: 4.2.MRS, 4: 4.3.MRS, 5: 4.3.BDA, 6: B. animalis y 7: Control negativo de PCR.

A pesar de que se encuentra reportado que el gen mur2 está presente en especies de E.

hirae, se decidió probar si todas las muestras presuntas Enterococcus presentaban dicho gen.

A partir de la Figura 9, se identifica la ausencia de banda para los primeros 2 aislamientos (3.3.MRS y 3.5.MRS), y la presencia de una banda de un tamaño aproximado a 521 pb para los siguientes 3 aislamientos (4.2.MRS, 4.3.MRS y 4.3.BDA). Esto es coincidente con lo expresado por la bibliografía en cuanto al tamaño del producto de PCR para el gen mur2 y a los porcentajes de identidad presentados en el Blastn primario (79). En cuanto al control de microorganismo modelo (B. animalis), se denota la ausencia de bandas por lo que se puede inferir que no posee el gen mur2. Por lo tanto, se expresa que los 3 aislamientos presuntamente pertenecen a la especie E. hirae. Sin embargo, una perspectiva de este ensayo recae en secuenciar dichos aislamientos con los primers específicos para mur2 en orden de confirmar su especie.

Como perspectivas del ensayo, sería clave realizar ensayos que identifiquen a qué cepas de E. faecium y E.hirae pertenecen los aislamientos. Esto se podría lograr mediante técnicas

como RFLP (Restrictrion Fragment Length Polymorphism) o RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). RFLP trata sobre el uso de enzimas de restricción que cortan en distintos segmentos del ADN dependiendo si están presentes dichos sitios de restricción para corte, denotando diferencias entre los patrones de bandeo, en gel de agarosa, si las cepas son diferentes entre sí (82). RAPD estriba en el uso de un primer corto (10 NTPs), de secuencia arbitraria que hibrida al azar con el ADN durante una PCR. En la misma, se amplifica un conjunto de fragmentos distribuidos aleatoriamente en el genoma de los aislamientos analizados. Luego de la amplificación, los fragmentos se separan por su tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa, logrando diferenciar patrones de distinto tamaño si las cepas son diferentes (21,134).

Con respecto a los aislamientos identificados como presuntos Lactobacillus y Bifidobacterium una vez realizadas las pruebas bioquímicas, se buscan genes específicos para ambos géneros. Esto se efectúa en orden de detectar si los aislamientos con morfología de bacilo y Gram positivas cumplen con las características de ser Lactobacillus y Bifidobacterium.

Para Lactobacillus, se sintetizan primers contra una secuencia consenso que presentan varias especies de Lactobacillus, como L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, entre otros. La bibliografía expresa el uso del primer específico LbLMA1-rev para identificar una secuencia consenso en Lactobacillus, mientras que el primer universal R16-1 hibrida contra una región terminal del gen que codifica para el ARNr 16S. Para esto, se realiza una PCR tiempo final y se visualizan los resultados en gel de agarosa al 1%, como se observa en la Figura 11.

Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de PCR tiempo final para la detección de secuencia consenso de Lactobacillus. Se observa presencia de bandas para 2 asilamientos y el control positivo. MP: Marcador de peso molecular

#SM0331, 1: 1.7.MRS, 2: 5.1.MRS, 3: 5.2.MRS, 4: 5.4.MRS, 5: 5.5.MRS, 6: L. plantarum, 7: E. coli y 8: Control negativo de PCR.

A partir de la Figura 10, se observa presencia de bandas en los carriles 1 (1.7.MRS), 4 (5.4.MRS) y 6 (L. plantarum) en el orden de los 250 pb. Esto es coincidente con lo que expresa la bibliografía en relación con el producto de PCR obtenido para este gen. Es importante destacar una intensidad de banda mayor observada en el carril 6 (L. plantarum), permitiendo ejercer una correlación entre lo mencionado con el método de extracción de ADN. Para esta

bacteria modelo fue empleado un kit comercial, mientras que para las extracciones de las muestras presuntas Lactobacillus fue empleado un kit in house. Dicho esto, se puede inferir que la extracción por el método comercial logra ADN de alta calidad, con posibilidad de que tenga mayor concentración de ADN que la extracción in house y por ello las bandas se observa una banda más intensa en la bacteria modelo. Para confirmar este supuesto, se debería comparar la extracción del mismo aislamiento por ambos métodos en orden de confirmar lo expresado.

Una de las perspectivas a futuro necesarias es ajustar las condiciones de PCR en orden de obtener bandas más intensas que las visibles en la Figura 10. Los autores de la bibliografía referenciada utilizaron un volumen de la mezcla de la reacción, con dichos primers, de 50 μL utilizando una concentración de ADN bacteriano de 50 – 100 ng, mientras que en este caso se hizo uso de una mezcla de 25 μL, sin conocer exactamente su concentración debido a problemas en los equipos de laboratorio. De la misma forma, en la bibliografía empleada se utilizó 10 μL de los productos de PCR, mientras que en este caso se hizo uso de 5 μL de producto de PCR, ambos a ser cargados en un gel de 1% agarosa (80).

Para Bifidobacterium, se sintetizaron primers contra una secuencia consenso que presentan varias especies de Bifidobacterium. Sobre los resultados obtenidos, se visualizó la ausencia de bandas en los 2 aislamientos probados (3.2.BDA y 3.3.BDA) presuntos Bifidobacterium, y de los controles positivos (B. animalis y B. longum).

En este caso, no se observaron productos de PCR en gel de agarosa al 1%, por lo que se pueden estimar una serie de fundamentos para ello. Una de las razones se debe a síntesis de primers errónea, debido a que no se visualiza amplificación en el control positivo. Otra razón puede deberse a errores en el templado de PCR. Al no haber existido amplificación, se pudieron haber considerado tiempos de extensión incorrectos. Es importante señalar que se deberían ajustar ambas condiciones de forma de observar bandas en el producto de PCR de los controles positivos. Es importante señalar que las extracciones de ADN de los aislamientos y controles positivos fueron cuantificados, por lo que la no amplificación del producto de PCR se debe exclusivamente a las condiciones de dicha PCR.

Como perspectiva del ensayo para identificar los presuntos aislamientos de Bifidobacterium utilizando la misma técnica, se deberían diseñar primers donde se identifiquen regiones conservadas de los controles positivos (B. animalis B. longum), conociendo la temperatura de annealing y el largo de producto de PCR, en orden de amplificar y visualizar bandas en un gel de agarosa.