Adicionalmente, muchos de los microorganismos productores de bacteriocinas son, a su vez, probióticos. La noción de probiosis alude, en general, al conjunto de efectos fisiológicos que, vinculados a los balances microbianos del tracto intestinal, resultan favorables para la entidad biológica hospedante. Se trata de un concepto relativamente difuso, que se ha relacionado sobre todo con la mejora de la resistencia a las enfermedades por estimulación de las defensas naturales, y que puede implicar mecanismos de naturaleza bastante heterogénea. Entre ellos se citan con frecuencia sin detalles concretos la competencia con microorganismos patógenos por nutrientes limitantes o por puntos de adherencia a las mucosas, la producción de sustancias inhibidoras de estas especies y la activación de la respuesta inmunitaria (Mishra & Lambert, 1996; Isolauri et. al., 1998).
Clásica ya en el campo de la dietética humana, donde subyace, por ejemplo, a la inducción al consumo de productos lácteos fermentados, la idea se ha extendido luego al ámbito de la producción animal. Dado que la colonización de los tractos intestinales por probiontes no es en general permanente, también aquí la estrategia se ha centrado en las formas de administración continua de las correspondientes especies microbianas; esto es, en la formulación de dietas reparadoras o configuradoras de las microfloras, que conduzcan a maximizar rendimientos alimentarios y supervivencias. Los ejemplos de probiontes más citados a este respecto son diversas especies de géneros como Lactobacillus, Streptococus
NUEVAS PERSPECTIVAS SOBRE INOCUIDAD ALIMENTARIA 142 (Lactococcus) y Bifidobacillus (Fuller, 1992; Soomro Et Al., 2002; Thomke
& Elwinger, 1998).
Tanto las bacteriocinas como la propia biomasa probiótica se producen habitualmente en cultivo sumergido discontinuo, obteniéndose en ocasiones mejoras mediante procesos en continuo, alimentado o inmovilizado (Bhugaloo-Vial et. al., 1997; Parente et. al., 1997). En el caso de algunos probióticos es necesaria la presencia en el medio de azúcares específicos (prebióticos) que estimulan su crecimiento. Por su parte, las bacteriocinas se consideran cinéticamente como metabolitos primarios, aunque están referenciadas numerosas excepciones (Paik & Glatz, 1997).
Las principales variables que determinan tanto los niveles de producción como su tipificación cinética son la temperatura, la aireación, el pH y la composición del medio de cultivo. Las temperaturas óptimas de producción y de crecimiento no suelen coincidir aunque ambas se sitúan entre los 30ºC y 37ºC. Con respecto a la aireación se acepta que, dado la naturaleza anaerobia facultativa de las especies productoras, las condiciones más favorables son en anaerobiosis con la mínima agitación necesaria para conseguir una suspensión homogénea (De Vuyst & Vandamme, 1994b). El pH es sin duda la variable más relevante en la producción de bacteriocinas, tanto por la ya discutida influencia sobre la actividad, solubilidad y adsorción a las membranas celulares de las cepas productoras, como por el propio efecto directo de los niveles inicial y final y de su evolución durante el cultivo. Para la mayoría de las bacteriocinas el pH inicial óptimo se sitúa en 5,5.
Finalmente, con respecto a la composición del medio de cultivo cabe señalar que la fuente de carbono de preferencia es la glucosa, mientras la de nitrógeno son los hidrolizados de proteínas de alta calidad (caseína, triptonas, peptonas, extracto de levaduras y extracto de carne), probablemente debido al efecto inductor de algunos aminoácidos sobre la producción (De Vuyst, 1995).
Sin embargo, uno de las causas principales que ha limitado la extensión del uso de probióticos y bacteriocinas es el alto coste de producción de biomasa probionte y/o de sus péptidos activos. En efecto, los medios de cultivo normalmente empleados son caros y las conversiones del sustrato en biomasa reducidas. Además, en el caso de usos en alimentación animal, dada la naturaleza de las fuentes de nitrógeno utilizadas (esencialmente peptonas de carne), no pueden ser incorporadas junto a los probiontes a los piensos, lo que hace necesario un proceso de separación previo de la cosecha microbiana que encarece su obtención.
NUEVAS PERSPECTIVAS SOBRE INOCUIDAD ALIMENTARIA 143 Tres son las posibles estrategias que podrían permitir obviar los problemas mencionados. En primer lugar la búsqueda medios de cultivo baratos que promovieran crecimientos exuberantes de biomasa y producciones elevadas de bacteriocinas. En este sentido, a la vista de la composición, bajo costo y disponibilidad de algunos subproductos y efluentes de la industria alimentaria, su adaptación como medio de cultivo se presenta como una alternativa plausible.
En efecto, existen precedentes de la utilización de los efluentes del procesado de mejillón y el suero de leche como materias primas de procesos microbianos para la producción de metabolitos de interés. Los efluentes del procesado de mejillón (EPM) se generan en el tratamiento térmico al que se somete el mejillón destinado a congelados y conservas. Sólo en Galicia (noroeste de España) representan 75 millones de litros anuales de elevadísimo impacto contaminante tanto por su temperatura de salida (cercana a los 100ºC) como por su DQO (25.000 ppm como valor medio).
Los EPM son la base de un proceso biotecnológico denominado IIM que permite la obtención por vía microbiana de enzimas (Torrado et. al., 1998), ácidos orgánicos (Pintado et. al., 1994), hormonas (Pastrana et. al., 1993) y otros metabolitos de interés (Guerra & Pastrana, 2002). Por su parte, el suero de leche (SL) resultante de los procesos de fabricación del queso (con una DQO entre 60.000 y 80.000 ppm y una elevadísima producción mundial) se usa, en forma líquida o concentrada como suplemento en alimentos animales y humanos, para la recuperación de la fracción proteica y la lactosa mediante procesos de ultrafiltración y para la obtención de metabolitos microbianos por fermentación de la lactosa (Gonzalez, 1996).
La segunda de las estrategias consiste en diseñar procedimientos y operatorias de fermentación que incrementen las producciones tanto de biomasa probionte como de bacteriocinas y que supongan una alternativa viable a los procesos discontinuos clásicos. En este sentido, se abren varias posibilidades que comprenden, la aplicación de modalidades como los cultivos alimentados o por lotes, el mantenimiento del pH en los cultivos y la generación de perfiles de pH.
Finalmente, la tercera estrategia trata de elaborar modelos matemáticos que permitan describir el comportamiento de los sistemas microbianos de producción de bacteriocinas con el fin de poderlos utilizar en la construcción de algoritmos de control eficientes. De este modo, será fácil predecir el comportamiento de los cultivos y adoptar políticas de control adecuadas, lo que reducirá las posibilidades de que la fermentación no transcurra por el camino previsto. Todo ello redundará en una reducción de
NUEVAS PERSPECTIVAS SOBRE INOCUIDAD ALIMENTARIA 144 los costes producción en general y, en particular los vinculados con el personal de mantenimiento de la planta.
A continuación se recoge el trabajo realizado en nuestro laboratorio en las tres estrategias mencionadas para la producción tanto de biomasa potencialmente probiótica de Lactococcus lactis (Lc 1.04) y Pediococcus acidilactici (Pc 1.02), así como nisina y pediocina a partir de EPM y suero de leche. De este modo se presentarán los estudios llevados a cabo para la búsqueda de las concentraciones de los nutrientes adecuados con los que suplementar los efluentes y convertirlos en medios de cultivo adecuados, la aplicación de la modalidad de proceso alimentado sometido a realcalinizaciones periódicas para incrementar y prolongar las producciones y la modificación de los modelos cinéticos convencionales incluyendo las variables relevantes en estos sistemas para describir su evolución adecuadamente. Finalmente se presentan dos aplicaciones de las bacteriocinas y de la biomasa productora: el desarrollo de envases activos y la sustitución de antibióticos en piensos animales.
NUEVAS PERSPECTIVAS SOBRE INOCUIDAD ALIMENTARIA 145 2: Acondicionamiento de los efluentes del procesado de mejillón y el suero de leche para el cultivo de Lactococcus lactis y Pediococcus acidilactici
Aunque tanto los EPM como el SL conforme salen de las instalaciones pueden soportar el crecimiento microbiano, sus elevados contenidos en proteínas aconsejan un pretratamiento para su eliminación parcial. Ello se debe a varias razones: son proteinas de asimilación lenta quedando importantes remanentes en los postincubados y por tanto no constituyen buenas fuentes de nitrógeno; aisladamente pueden ser utilizadas directamente con propósitos de refuerzo de alimentos y, finalmente, precipitan a valores de pH ácido (usuales durante los cultivos de bacterias lácticas) dificultando las determinaciones de biomasa en los cultivos.
Basándose en esta última característica, ambos efluentes se sometieron a pretratamientos de desproteinización y, adicionalmente, dado que las bacterias lácticas no poseen capacidad amilolítica, en el caso de los EPM, el glucógeno presente se sacarificó con amilasas comerciales para convertirlo en glucosa, fuente de carbono asimilable. Por su parte, el suero lácteo (SL) fue obtenido de instalaciones industriales locales en dos formas, una como suero lácteo concentrado (SLC) y la otra como suero lácteo diluido (SLD). La primera se obtiene del líquido resultante del prensado natural del queso, y la segunda, como resultado de la mezcla de las aguas de lavado con el suero residual que aún contiene el queso una vez prensado. En ambos, el pretratamiento sólo afectó a su fracción proteica.
La composición resultante de los EPM y los SLC y SLD que se utilizaron en los cultivos después del tratamiento de acondicionamiento se muestra en la tabla 1.