Hidrólisis de la sacarosa
Inicialmente, se realizó la curva patrón de sacarosa preparando una concentración Stock de 1/10. A partir de esta solución se prepararon diferentes concentraciones para obtener la curva patrón. Posteriormente, se tomó 2 mL de cada una de las concentraciones y se adicionó 2 mL de HCI al 20% (w'v) con dilución 1/2. Los tubos fueron agitados en vórtex y calentados a 92 °C durante 10 minutos. La reacción se frenó en hielo. Posteriormente, se adicionaron tres gotas de fenoftaleína cada una de las muestras, luego NaOH al 25% (p/v) (aproximadamente 2.02 mL) hasta obtener un tono ligeramente rosado.
Por último, se adicionó HCI al 5% (v/v) (aproximadamente 0.6 mL), este proceso se realizó porque en presencia de HCl y en caliente, la sacarosa se hidroliza, es decir, incorpora una molécula de agua y se descompone en los monosacáridos que la forman, glucosa y fructosa. y por último se agitó nuevamente en vórtex (Godoy, 2002;
ICONTEC, 1994).
Técnica del Ácido 3,5- dinitrosalicílico (DNS)
Después de la etapa de hidrólisis, se procedió con el protocolo para llevar a cabo la técnica de determinación de azúcares reductores por el método de DNS para lo cual se realizó diluciones 1/100 a 0.5 mL de la solución hidrolizada se agregaron 0.5 mL del reactivo DNS, los tubos fueron calentados en ebullición durante 5 minutos.
Posteriormente, se frenó la reacción con hielo. Se adicionaron 5 mL de agua destilada, se agitó en vórtex y se realizó la lectura de densidad óptica (D.O) a 540 nm para cada tubo (Miller, 1959).
55
Anexo 3: Evaluación de la actividad de agua en cada sistema de fermentación en estado sólido.
Tabla 14: Esquema de Tabla de datos de Aw.
Figura 12: Esquema de grafica de Aw.
Fuente: Elaboración propia - Manual de Agroindustrial UNS.
Anexo 4: Para determinar la humedad en cada sistema de fermentación en estado sólido se procedió a realizar la siguiente tabla.
Cálculo de % Humedad:
Donde:
Pi = Peso de la placa más muestra húmeda.
Pf= Peso de la placa más muestra seca.
W= Peso de la muestra
Tabla 15: Tabla de datos para la construcción de la humedad
N° TIEMPO
Peso de la muestra (g)
Peso de placa + Masa inicial
(g)
Peso de placa + Masa final
(g)
% H. en base húmeda
% H.
en base seca Peso de
placa (g)
1 - - - - - -
2 - - - - - -
3 - - - - - -
4 - - - - - -
5 - - - - - -
Fuente: Elaboración propia Muestras Aw
Fermentación 24 h ##
Fermentación 48 h ##
Fermentación 72 h ##
% 𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 =𝑃𝑖 − 𝑃𝑓 𝑊 ∗ 100
56 LEYENDA:
Masa inicial: Muestra al inicio de la fermentación Masa final: Muestra al final de la fermentación
Tabla 16: Evaluación inicial de la humedad en el tiempo de fermentación de estado sólido.
FERMENTACIÓN EN ESTADO SOLIDO
Peso de placa
(g)
Peso de la muestra
(g)
Peso de placa + Masa inicial
(g)
Peso de placa + Masa
final (g)
% H.
en base húmeda
% H.
en base seca R1
24 H 45.143 5 50.143 46.032 100 82.22
48 H 41.6734 5 46.6734 42.532 100 82.828
72 H 49.2358 5 54.2358 50.103 100 82.656
R2
24 H 49.9205 5 54.9205 50.628 100 85.85
48 H 34.4819 5 39.4819 35.186 100 85.918
72 H 51.1818 5 56.1818 52.0215 100 83.206
R3
24 H 43.8482 5 48.8482 44.622 100 84.524
48 H 35.3721 5 40.3721 36.214 100 83.162
72 H 49.3473 5 54.3473 50.124 100 84.466
Fuente: Elaboración propia
Tabla 17: Evaluación final de la humedad en el tiempo de fermentación de estado sólido del día 14.
FERMENTACIÓN EN ESTADO SOLIDO
Peso de placa
(g)
Peso de la muestra
(g)
Peso de placa + Masa inicial
(g)
Peso de placa + Masa
final (g)
% H.
en base húmeda
% H.
en base seca
R1 24 H 38.124 5 43.124 38.853 100 85.42
48 H 45.632 5 50.632 46.241 100 87.82
72H 38.321 5 43.321 38.9218 100 87.984
R2
24 H 41.6565 5 46.6565 42.2414 100 88.302
48 H 48.0032 5 53.0032 48.5319 100 89.426
72 H 39.344 5 44.344 39.9218 100 88.444
R3
24 H 42.654 5 47.654 43.385 100 85.38
48 H 37.532 5 42.532 38.319 100 84.26
72 H 39.632 5 44.632 40.348 100 85.68
Fuente: Elaboración propia
57
Anexo 5: Evaluación de crecimiento: Para determinar los datos se siguió los parámetros y criterios de evaluación detallados en la tabla 6 donde se especifica:
Numero de generaciones:
En donde: 𝑛 =𝑙𝑛𝑁−𝑙𝑛𝑁𝑜
ln 2
N= Número de conídios/g final.
No= Numero de conidios/g inicial
Tabla 18: Evaluación de parámetros y criterios de crecimiento de Trichoderma sp. en la fermentación de estado sólido del día 14.
CRECIMIENTO DE Trichoderma sp.
COMPOSICIÓN 14 DIAS n g(h˄-1) µ Conidios/(h˄-1)
REPLICA 1 24 H
5% - 30g 1.5 mL: 30 g 7.88E+10 13.701 10.510 0.066 5% - 40g 2 mL: 40 g 7.88E+10 13.701 10.510 0.066 5% - 50g 2.5 mL: 50 g 7.88E+10 13.701 10.510 0.066
48H
5% - 30g 1.5 mL: 30 g 7.88E+10 13.701 10.510 0.066 5% - 40g 2 mL: 40 g 7.88E+10 13.701 10.510 0.066 5% - 50g 2.5 mL: 50 g 7.88E+10 13.701 10.510 0.066
72 H
5% - 30g 1.5 mL: 30 g 7.88E+10 13.701 10.510 0.066 5% - 40g 2 mL: 40 g 7.88E+10 13.701 10.510 0.066 5% - 50g 2.5 m : 50 g 7.88E+10 13.701 10.510 0.066
REPLICA 2 24 H
5% - 30g 1.5 mL: 30 g 8.25E+10 13.767 10.460 0.066 5% - 40g 2 mL: 40 g 8.49E+10 13.808 10.428 0.066 5% - 50g 2.5 mL: 50 g 8.70E+10 13.843 10.403 0.067
48H
5% - 30g 1.5 mL: 30 g 8.63E+10 13.831 10.411 0.067 5% - 40g 2 mL: 40 g 8.17E+10 13.752 10.471 0.066 5% - 50g 2.5 mL: 50 g 8.86E+10 13.869 10.383 0.067
72 H
5% - 30g 1.5 mL: 30 g 8.50E+10 13.810 10.428 0.066 5% - 40g 2 mL: 40 g 8.72E+10 13.847 10.399 0.067 5% - 50g 2.5 mL: 50 g 9.05E+10 13.900 10.360 0.067
REPLICA 3 24 H
5% - 30g 1.5 mL: 30 g 8.18E+10 13.754 10.470 0.066 5% - 40g 2 mL: 40 g 8.18E+10 13.754 10.470 0.066 5% - 50g 2.5 mL: 50 g 8.43E+10 13.798 10.437 0.066
48H
5% - 30g 1.5 mL: 30 g 8.50E+10 13.810 10.428 0.066 5% - 40g 2 mL: 40 g 8.42E+10 13.797 10.437 0.066 5% - 50g 2.5 mL : 50 g 8.78E+10 13.857 10.392 0.067
72 H
5% - 30g 1.5 mL: 30 g 8.55E+10 13.819 10.421 0.067 5% - 40g 2 mL: 40 g 8.64E+10 13.834 10.409 0.067 5% - 50g 2.5 mL: 50 g 8.91E+10 13.878 10.496 0.067
58
Anexo 6: Crecimiento de Trichoderma sp. en la fermentación en estado sólido.
Tabla 19: Evaluación de la fermentación en estado sólido de Trichoderma sp. en el tiempo.
Muestra/
días
CONTEO
(PRO) Vol. CN N° en 0.5mL
N° 1g sustrato
N° 50 g sustrato
2 46.4 0.00000
4 11600000 116000000 5.80E+09
4 48.3 0.00000
4 12075000 120750000 6.04E+09
6 49.2 0.00000
4 12300000 123000000 6.15E+09
8 50 0.00000
4 12500000 125000000 6.25E+09
10 52.4 0.00000
4 13100000 131000000 6.55E+09
12 54.8 0.00000
4 13700000 137000000 6.85E+09
14 82 0.00000
4 20500000 205000000 1.03E+10
16 84.8 0.00000
4 21200000 212000000 1.06E+10
18 83.9 0.00000
4 20975000 209750000 1.05E+10
20 81.2 0.00000
4 20300000 203000000 1.02E+10
22 81.2 0.00000
4 20300000 203000000 1.02E+10
24 77.4 0.00000
4 19350000 193500000 9.68E+09
26 75 0.00000
4 18750000 187500000 9.38E+09
28 62.4 0.00000
4 15600000 156000000 7.80E+09 Fuente: Elaboración propia
LEYENDA:
CONTEO (PRO): Conteo de conídios de Trichoderma sp. (promedio) Vol. CN: Volumen de Conidios
N° en 0.5mL: Numero de conidios de Trichoderma sp. en 0.5 mL
N°1g de substrato: Número de conídios de Trichoderma sp. en 1 g de substrato N°50 g substrato: Número de conídios de Trichoderma sp. en 50 g de substrato
59
Tabla 20: Crecimiento de Trichoderma sp. en la fermentación en estado sólido en las 3 réplicas realizadas a los 14 días de incubación.
CRECIMIENTO De Trichoderma sp 14 DIAS conidios/g sustrato
COMPOSICIÓN MELAZA:
ESPARRAGO R1 R2 R3
REPLICA 1
24 H
5% - 30 g 1.5 mL: 30 g 8.24E+10 8.47E+10 6.94E+10 5% - 40 g 2 mL: 40 g 8.18E+10 7.29E+10 6.35E+10 5% - 50 g 2.5 mL: 50 g 8.37E+10 8.53E+10 7.49E+10 48H
5% - 30 g 1.5 mL: 30 g 8.57E+10 8.49E+10 7.53E+10 5% - 40 g 2 mL: 40 g 8.52E+10 8.38E+10 6.98E+10 5% - 50 g 2. 5mL: 50 g 8.66E+10 8.76E+10 8.63E+10 72 H
5% - 30g 1.5mL: 30 g 8.47E+10 8.49E+10 8.58E+10 5% - 40g 2 mL: 40 g 8.56E+10 8.95E+10 8.46E+10 5% - 50g 2.5mL: 50 g 8.71E+10 8.86E+10 8.66E+10
REPLICA 2
24 H 5% - 30 g 1.5mL: 30 g 8.45E+10 8.37E+10 7.94E+10 5% - 40 g 2 mL: 40 g 8.61E+10 8.52E+10 8.35E+10 5% - 50 g 2.5mL: 50 g 8.87E+10 8.73E+10 8.49E+10 48H 5% - 30 g 1.5mL: 30 g 8.87E+10 8.48E+10 8.53E+10 5% - 40 g 2 mL: 40 g 7.93E+10 7.88E+10 8.69E+10 5% - 50 g 2.5mL : 50 g 8.96E+10 8.86E+10 8.75E+10
72 H
5% - 30 g 1.5mL: 30 g 8.34E+10 8.58E+10 8.58E+10 5% - 40 g 2 mL: 40 g 8.46E+10 9.15E+10 8.56E+10 5% - 50 g 2.5mL: 50 g 8.75E+10 9.63E+10 8.76E+10
REPLICA 3
24 H
5% - 30 g 1.5mL: 30 g 8.12E+10 8.27E+10 8.14E+10 5% - 40 g 2 mL: 40 g 8.21E+10 8.35E+10 7.98E+10 5% - 50 g 2.5mL: 50 g 8.17E+10 8.43E+10 8.69E+10 48H
5% - 30 g 1.5mL: 30 g 8.47E+10 8.45E+10 8.58E+10 5% - 40 g 2 mL: 40 g 8.14E+10 8.48E+10 8.65E+10 5% - 50 g 2.5 mL: 50 g 8.72E+10 8.76E+10 8.87E+10 72 H
5% - 30 g 1.5 mL: 30 g 8.41E+10 8.57E+10 8.68E+10 5% - 40 g 2 mL: 40 g 8.39E+10 8.95E+10 8.59E+10 5% - 50 g 2.5 mL: 50 g 8.54E+10 9.23E+10 8.96E+10
Fuente: Elaboración propia
60
Anexo 6: Desarrollo de la bioformulación a partir de Trichoderma sp.
Como se indica anteriormente se procedió a preparar la bioformulación con diferentes concentraciones de adyuvantes los cuales ayudaran a la conservación de la bioformulación.
Figura 13: Preparación de la bioformulación liquido; a) Extracto de maíz + 5% de melaza.
b y c) Concentración de adyuvantes + 250 mL de Tween 80 al 0.1% d) Crecimiento de Trichoderma sp. cultivado en FES. E y f) Lavado con Tween 80 al 0.1% a los frascos.
Tabla 21: Cuantificación y viabilidad de conidios en la bioformulación a partir de la FES de Trichoderma sp.
Fuente: Elaboración propia Bioformulado de Trichoderma sp. a base de una fermentación en estado solido
Replica 1 Número de conidios/mL Replica 2 Número de conidios/mL Replica 3 Número de conidios/mL
D 24 H 48 H 72 H 24 H 48 H 72 H 24 H 48 H 72 H
1 7.932 8.423 8.462 7.723 8.242 8.423 8.123 8.324 8.343
4 8.192 8.435 8.652 7.832 8.423 8.432 8.195 8.423 8.396
8 8.395 8.522 8.82 8.143 8.498 8.621 8.241 8.391 8.423
12 8.482 8.724 9.134 8.352 8.601 8.691 8.261 8.464 8.513
16 8.789 8.789 9.421 8.543 8.698 8.723 8.312 8.502 8.595
20 8.935 8.893 9.543 8.592 8.724 8.773 8.401 8.532 8.616
24 9.134 9.325 9.624 8.752 8.743 8.802 8.494 8.592 8.634
28 8.842 9.183 9.601 8.763 8.714 8.793 8.482 8.602 8.631
32 8.812 9.132 9.589 8.694 8.692 8.754 8.415 8.586 8.501
61
Tabla 22: Crecimiento de micelio de Fusarium sp. durante 12 días de evaluación a diferentes concentraciones de la bioformulación
Fuente: Elaboración propia
Tabla 23: Porcentaje del crecimiento micelial de Fusarium sp durante 12 días de evaluación a diferentes concentraciones de la bioformulación en porcentaje DÍA DE
EVALUACIÓN
CRECIMIENTO DE MICELIO DE FUSARIUM SP EN PORCENTAJE
REPLICA 1 REPLICA 2 REPLICA 3
0% 1% 5% 0% 1% 5% 0% 1% 5%
3 37% 24% 11% 19% 31% 9% 37% 26% 10%
6 62% 17% 5% 58% 26% 5% 84% 20% 6%
9 89% 9% 0% 80% 20% 0% 95% 10% 0%
12 100% 7% 0% 100% 18% 0% 100% 8% 0%
Fuente: Elaboración propia Tabla 24: Porcentaje de inhibición de la bioformulación frente al crecimiento micelial de
Fusarium sp. durante 12 días de evaluación
DÍA DE EVALUA CIÓN
% INHIBITORIO DE LA BIOFORMULACIÓN FRENTE AL CRECIMIENTO DE FUSARIUM SP
REPLICA 1 REPLICA 2 REPLICA 3
0% 1% 5% 0% 1% 5% 0% 1% 5%
3 63% 76% 89% 81% 69% 91% 63% 74% 90%
6 38% 83% 95% 42% 74% 95% 16% 80% 94%
9 11% 91% 100% 20% 80% 100% 5% 90% 100%
12 0% 93% 100% 0% 82% 100% 0% 92% 100%
Fuente: Elaboración propia CRECIMIENTO DE MICELIO DE Fusarium sp.
DÍA DE EVALUACIÓN
REPLICA 1 Crecimiento radial/cm
REPLICA 2 Crecimiento radial/cm
REPLICA 3 Crecimiento radial/cm
0% 1% 5% 0% 1% 5% 0% 1% 5%
3 2.8 1.8 0.8 1.4 2.3 0.7 2.9 2 0.8
6 4.7 1.3 0.4 4.3 1.9 0.4 6.6 1.6 0.5
9 6.8 0.7 0 5.9 1.5 0 7.42 0.8 0
12 7.6 0.5 0 7.4 1.3 0 7.83 0.6 0
62 Anexo 7: Análisis estadístico
Producción de Trichoderma sp. por fermentación en estado sólido.
Tabla 25: Diseño Experimental AxB; el Factor A y B con 3 niveles cada uno
Grados
de libertad
Conidios/g sustrato SS
Conidios/g sustrato
MS
Conidios/g sustrato F
Conidios/g sustrato p Efecto
Intercepción 1 1.93E+23 1.93E+23 26419.28 0.000000
Tiempo FES 2 1.27E+20 6.36E+19 8.73 0.002240
Razón Mel/Lig 2 8.91E+19 4.46E+19 6.12 0.009401
Tiempo FES * Razón Mel/Lig 4 1.56E+19 3.92E+18 0.54 0.709967
Error 18 1.31E+20 7.29E+18
Total 26 3.63E+20
Fuente: Statistica 10.
Figura 14: Grafica de la variable dependiente (conidios/g) vs la variable independiente
(tiempo).
63
Figura 15: Grafica de la variable dependiente (conidios/g) vs la variable independiente (razón)
Tabla 26: Prueba de Tukey
La prueba de Tukey nos mostró que hay valores significativos, es decir no todos los tratamientos realizados tienen semejanza, son diferentes estadísticamente.
Efecto de la bioformulación a base de Trichoderma sp. sobre el crecimiento de Fusarium sp.
Tabla 27: Diseño completamente al azar (DCA) de un solo factor
Grados de libertad cm SS cm MS cm F cm p Efecto
Intercepción 1 7.07E+01 7.07E+01 897.9446 0.000000
% 2 1.05E+02 5.25E+01 666.0698 0.000000
Error 6 4.73E-01 7.88E-02
Total 8 1.05E+02
Fuente: Statistica 10.
64
Figura 16: Gráfica de la variable dependiente (centímetro micelial) vs la variable independiente (porcentaje de la bioformulación).
La gráfica de valores donde nos muestra las diferencias significativas que hay en el crecimiento micelial con respecto a la concentración de la bioformulación.
Tabla 28: Test de homogeneidad de las varianzas Prueba F-
max
Prueba C/
cochran
Chi
cuadrado df p
cm 0.804063 -0.558698 1 1.000000
La varianza es homogénea en cada nivel, en cada tratamiento realizado entre la bioformulación y el crecimiento micelial la varianza es no significativa.
Tabla 29: Prueba de Tukey
Numero % (1) 7.6100 (2) 80000 (3) 0.0000
1 0 0.000227 0.000227
2 1 0.000227 0.030136
3 5 0.000227 0.030136
Fuente: Statistica 10 La prueba de Tukey nos mostró que todos los valores son significativos, es decir no hay semejanza en ningún tratamiento realizado, son diferentes estadísticamente.
65 Anexo 8: Evidencias del trabajo realizado
Figura 17: Cepas de Trichoderma sp. (izquierda) y Fusarium sp. (derecha).
Figura 18: A) Proceso de triturado en el mortero el material lignocelulósico la peladilla de espárrago. B-C) Distribución y autoclavado del material lignocelulósico (peladilla de espárrago) según el peso correspondiente en la fermentación en estado sólido.
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Figura 19; Crecimiento de Trichoderma sp. en la fermentación en estado sólido después de 14 días a incubación de 30°C.
Figura 20: Análisis de Aw al primer y último día.
Figura 21: Discos de Fusarium sp. en placas con medio PDA con 1 mL de la bioformulación al 1 y 5 %.
a b