28 Figura 2: Gráfico de crecimiento de Trichoderma sp. en fermentación en estado sólido durante 28 días. 36 Figura 3: Crecimiento de Trichoderma sp. en fermentación en estado sólido con material lignocelulósico de espárrago más 5% de melaza de caña después de 14 días de incubación. 42 Figura 8: Representación gráfica de la viabilidad del bioformulado Trichoderma sp. cultivado en fermentación en estado sólido después de 30 días de conservación a 4°C.
Palabras clave: Trichoderma sp., fermentación en estado sólido (FES), residuos lignocelulósicos de espárragos, melaza de Saccharum officinarum, bioformulación líquida, Fusarium sp., actividad del agua (Aw).
INTRODUCCIÓN
- Realidad problemática
- Antecedentes
- Formulación del problema
- Importancia y justificación
- Hipótesis
- Objetivo
- Objetivo general
- Objetivos específicos
Un nuevo uso alternativo de los residuos lignocelulósicos de espárragos (Asparagus officinalis) es como medio de cultivo para la producción de Trichoderma sp. Esta investigación busca sustituir los pesticidas químicos por una bioformulación a base de Trichoderma sp. Determinar la proporción óptima de melaza y residuos lignocelulósicos de espárragos para su uso como sustrato en el proceso de fermentación de Trichoderma sp.
Determinar las condiciones óptimas de humedad y actividad hídrica que favorezcan el crecimiento de Trichoderma sp en el proceso de fermentación en estado sólido.
MARCO TEORICO
- Material lignocelulósico
- Melaza de caña de azúcar
- Trichoderma sp
- Fusarium sp
- Fermentación en estado sólido (FES)
- Bioformulación
- Actividad de agua (Aw)
Muchas especies de este género son agentes de control biológico con potencial útil contra diversas enfermedades (Martínez et al., 2013). Más de la mitad de las especies son parásitos de las plantas y entre ellos se encuentran algunos de los patógenos más graves del mundo agrícola. Varios teleomorfos se han asociado con especies de Fusarium, la mayoría de los teleomorfos son miembros de Hypocreales, ubicados en la clase Ascomycetes.
Gibberella es el género más comúnmente asociado con la mayoría de las especies de Fusarium (Samuels et al., 2001) e incluye patógenos vegetales como Gibberella zeae (F. graminearum), G. El género Albonectria está asociado con un pequeño número de especies de Fusarium, la más común. de los cuales el más importante es F. La fermentación en estado sólido es un proceso que involucra sólidos en ausencia parcial o total de agua libre; Sin embargo, el sustrato debe estar lo suficientemente húmedo para permitir que el microorganismo crezca y realice todos sus procesos metabólicos, además de servir como flujo de nutrientes y como soporte físico para el mismo.
Otro aspecto importante a considerar en la fermentación en estado sólido es la elección de los parámetros del proceso y su optimización. Dentro de los parámetros mencionados anteriormente, la selección de un sustrato adecuado es un factor clave en los procesos de fermentación en estado sólido. Para cultivos bacterianos la humedad del sustrato debe ser superior al 70%, pero para hongos filamentosos puede variar entre el 20% y el 70% (Raimbault, 1998).
De esta manera, los hongos filamentosos representan un grupo de microorganismos más utilizados en procesos de fermentación sólida, ya que su crecimiento en forma de micelio e hifas y su tolerancia a condiciones como baja actividad de agua y alta presión osmótica les confieren ventajas. sobre otros microorganismos en la colonización de sustratos sólidos y su uso como fuente de nutrientes (Krishna, 2005). La cantidad total de agua realmente disponible para uso microbiano se expresa como actividad del agua (Aw) (Atlas & Bartha, 2002).
MATERIALES Y MÉTODOS
- Material vegetal
- Microorganismos
- Diseño experimental
- Producción de Trichoderma sp. por fermentación en estado sólido
- Efecto de la bioformulación a base de Trichoderma sp. sobre el crecimiento de
- Obtención del inóculo
- Cuantificación del inoculo (expresada en conidios/mL)
- Cámara de fermentación
- Dimensiones de la cámara fermentativa
- Condiciones de fermentación
- Evaluación de la fermentación en estado sólido en el tiempo
- Determinación de azúcares reductores durante la fermentación
- Actividad del agua
- Determinación de la humedad
- Preparación de la fermentación en estado sólido
- Inoculación en la fermentación en estado sólido
- Evaluación del crecimiento
- Preparación de la bioformulación líquida
- Cuantificación de conidios en el bioformulado
- Evaluación de la viabilidad
- Efecto de la bioformulacion sobre el crecimiento de Fusarium sp
- Reactivación del monocultivo
- Preparación del medio de cultivo
- Efecto inhibitorio de la bioformulación frente a Fusarium sp
- Análisis estadístico
Se utilizó el diseño completamente al azar (DCA) de un solo factor, donde las concentraciones del 1% y 5% del bioformulado líquido a base de Trichoderma sp. Se compararon donde la variable de respuesta a observar fue la inhibición de Fusarium sp. La pérdida de peso de la muestra se determinó cuando se calentó en un horno bajo ciertas condiciones. En una placa previamente tarada se pesaron 5 g de muestra sólida de fermentación, luego de lo cual la placa con la muestra se colocó en la estufa de secado a 105°C durante 3 horas.
Esta metodología está extraída de un trabajo de investigación en la Planta Piloto de Ciencia y Tecnología de Alimentos de la Universidad de Zaragoza. Para evaluar la producción de conidios, se tomaron muestras de 1 g de cada recipiente de fermentación en estado sólido a lo largo del tiempo para determinar el número de conidios/mL mediante conteo en una cámara de Neubauer. La metodología consiste en colocar la muestra en 10 ml de solución al 0,1% entre 80 y mezclar con ayuda de un vortex durante 30 segundos con el fin de obtener una suspensión y realizar diluciones seriadas hasta obtener la dilución adecuada (10-3) para contar. conidias./ml. La purificación del producto se realizó separando el material sólido de la fermentación en estado sólido mediante filtración con el fin de obtener únicamente los conidios de Trichoderma sp.
Para obtener la primera dilución (10−1), se transfirieron 10 mL del bioformulado con una pipeta estéril a un Erlenmeyer con 90 mL de agua estéril y se agitó vigorosamente durante 1 min; Luego se procedió con la dilución (10-2), se tomó 1 mL de la dilución bioformulada (10-2) y se transfirió al tubo de dilución (10-3) con 9 mL de agua esterilizada y se agitó. Se tomó el tubo de dilución de la muestra a analizar y se agitó durante 30 segundos. La concentración de conidias por mL de producto se calculó multiplicando la suma del número de esporas contadas en los cinco cuadrados secundarios (S.C.), por el inverso de la dilución utilizada y por el factor ambiente, utilizando la siguiente fórmula.
Con una pipeta inoculamos una gota de la dilución (10-3) en el portaobjetos. Para evaluar el efecto inhibidor se realizó la técnica del medio envenenado sobre agar papa dextrosa, agregando dosis del 1% y 5% del bioformulado.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
- Caracterización de la cepa de Trichoderma sp. y Fusarium sp
- Evaluación de la fermentación en estado sólido
- Proceso de fermentación en estado sólido
- Cuantificación del inóculo (expresada en conidios/mL)
- Crecimiento en la fermentación en estado sólido
- Efecto del tipo de sustrato
- Condiciones de Aw y humedad en la fermentación en estado solido
- Evaluación del crecimiento en medio sólido
- Determinación de azúcares reductores en la FES
- Preparación de la bioformulación
- Cuantificación y viabilidad de conidios en el bioformulado
- Efecto inhibitorio de la bioformulación sobre el crecimiento de Fusarium sp. a los 12
La evaluación reflejó diferencias significativas entre el número de conidias/g de sustrato en los diferentes procesos de fermentación. Para la evaluación de la actividad del agua (Aw) en cada sistema de fermentación en estado sólido se tomó un promedio de 0,75. Para determinar los azúcares reductores del proceso de fermentación en estado sólido de cada tratamiento, se realizó la hidrólisis de sacarosa, luego se realizó la prueba DNS para determinar la cantidad de melaza al inicio y al final de la fermentación, esto se realizó para mostrar cómo la melaza disminuye a medida que la moho Trichoderma sp.
A partir de esta concentración obtenida se inició la preparación del bioformulado de fermentaciones sólidas, cabe destacar que la mayor formación de conidios se logró a las 72 horas, los bioformulados se almacenaron a una temperatura de 4°C para determinar su crecimiento y viabilidad. Para obtener una bioformulación líquida de Trichoderma sp, preparamos una suspensión de elementos nutricionales a base de melaza de caña y levadura de cerveza, que favoreció su reproducción, rápida esporulación y supervivencia del antagonista (Cuadro 7). El procedimiento de extracción de la suspensión de esporas consistió esencialmente en agregar una solución al 0,5% v/v de Tween 80 para eliminar los conidios de los recipientes de vidrio.
Posteriormente se realizó una colada fina con una gasa y se ajustó la cantidad de bioformulado a 0,5 litros, a partir del bioformulado obtenido se trabajó con los procesos de placas “envenenadas” con una concentración del 1% y 5% del bioformulado. Volumen de medio de cultivo de agar patata dextrosa. El número de conidias disminuyó con el tiempo en las bioformulaciones, pero se puede observar que la bioformulación con mayor conservación y formación de esporas se obtiene mediante el proceso FES a las 72 horas. Lo que nos permitió ver si a las 24 horas la bioformulación aún era viable en el tiempo, el proceso consistió en agregar una gota de agar agua al 3% y una gota de dilución (10−3) de la bioformulación.
Como se puede observar, el número de germinaciones aumentó con el tiempo, pero se observó que desde los días 28 al 30, el número de conidios/mL del bioformulado (figura 8) disminuyó. Por lo tanto, podemos indicar que la bioformulación inhibe el crecimiento micelial de Fusarium sp.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Efecto de la cepa ecuatoriana Trichoderma harzianum Rifai como antagonista de Mycosphaerella fijiensis Morelet en condiciones de cultivo en casa. Evaluación de melaza de caña como sustrato para la producción de Saccharomyces Cerevisiae Otalora [proyecto de posgrado], Pontificia Universidad Javeriana. http://fernandocomerciointernacional.blogspot.com/2012/07/la-provincial-de-casma-en-la-region.ht. Disponible en: https://1library.co/document/dzx5drwq-evaluacion-melaza-cana-sustrato-produccion-saccharomyces-cerevisiae.html.
Determinación de la estabilidad y viabilidad de Trichoderma Harzianum Rifai en cinco sustratos utilizados para la preparación de un biofungicida en formulación líquida. Disponible en: http://www.sodiaf.org.do/congreso2013/memoria/orales/06.pdf Hernández, Alexander, Jiménez, María, Arcia, Asdrúbal, Ulacio, Dilcia, & Méndez, Naileth. Martínez Benedicto, Jesús Pérez, danay Infante, Yanisia Duarte, Martha Moreno (2013) Antagonismo de aislados de Trichoderma spp.
Difundir la importancia del consumo de espárragos en el Perú para su mayor comercialización. Aprovechamiento de residuos agroindustriales, cascarilla de arroz (Oriza sativa) y residuos de papa (Solanum tuberosum) para la producción de Trichoderma spp. Eficiencia de crecimiento del hongo trichoderma harzianum rifai para la producción de bioplaguicidas a partir de residuos agroindustriales.
Caracterización de las melazas utilizadas en el proceso de fermentación de la destilería San Martín - Industria de Licores del Valle. Evaluación de la capacidad antagonista "in vivo" del aislamiento de Trichoderma Spp contra el hongo fitopatógeno Rhizoctonia Solani, [Tesis de pregrado].
ANEXOS
Métodos experimentales
Procedimiento para la determinación de azucares reductores en la fermentación
Medida inicial: Muestra al inicio de la fermentación Medida final: Muestra al final de la fermentación. 1g de sustrato: Número de conidias de Trichoderma sp. en 1 g de sustrato N°50 g de sustrato: Número de conidias de Trichoderma sp. en 50 g de sustrato. Como se muestra arriba, la bioformulación se preparó con diferentes concentraciones de adyuvantes que ayudarían a preservar la bioformulación.
Fuente: Trabajo propio Tabla 24: Porcentaje de inhibición del bioformulado contra el crecimiento del micelio. La gráfica de valores nos muestra las diferencias significativas en el crecimiento del micelio respecto a la concentración del bioformulado. La varianza es homogénea en cada nivel, en cada tratamiento realizado entre la bioformulación y el crecimiento micelial la varianza no es significativa.
Evaluación de la actividad de agua en cada sistema FES
Para determinar la humedad en cada sistema de fermentación en estado sólido se
Evaluación de crecimiento: Para determinar los datos se siguió los parámetros y
Crecimiento de Trichoderma sp. en la fermentación en estado sólido
Desarrollo de la bioformulación a partir de Trichoderma sp
Análisis estadístico
La prueba de Tukey nos mostró que existen valores significativos, es decir, no todos los tratamientos realizados son iguales, son estadísticamente diferentes. Fuente: Statistica 10 La prueba de Tukey nos mostró que todos los valores son significativos, es decir, no existe igualdad en ningún tratamiento realizado, son estadísticamente diferentes.
Evidencias del trabajo realizado
