Pruebas Antimicrobianas con Aspergillus Niger

En este estudio, se investiga el crecimiento de A. Niger en medio agar en presencia de los nanocompuestos con impregnación de agregados de plata.

El efecto antimicrobiano de los nanocompuestos mediante la prueba de difusión en agar se evaluó tomando en cuenta dos parámetros: a) crecimiento del hongo debajo y encima de la película y; b) la presencia de la zona de inhibición alrededor de la película.

86 En la Tabla 15 se resumen los resultados de la técnica de difusión en agar para los nanocompuestos elaborados mediante diferentes técnicas de impregnación de agregados de plata (inmersión, aspersión e impregnación por ultrasonido). En la mayoría de los nanocompuestos, no existe interferencia para el crecimiento del hongo.

Tabla 15. Respuesta de los nanocompuestos al Aspergillus Niger.

El signo (+) indica el crecimiento por debajo de la muestra; (++) indica el crecimiento encima de la muestra;

(inh) indica la presencia de una zona de inhibición significante alrededor de la muestra.

Por otro lado, en la Figura 41 (a,b,c) se observan los resultados de la técnica de difusión en agar para los nanocompuestos elaborados mediante el método de inmersión. De acuerdo a la figuras es difícil distinguir una zona de inhibición, además de que es difícil distinguir cuál nanocompuesto presenta una mejor respuesta antimicrobiana.

Lo mismo ocurre para los nanocompuestos con impregnación de agregados de plata por aspersión (Figura 41 d,e,f) e impregnación en ultrasonido (Figura 41 g,h,i). Más sin embargo, sí es posible concluir que los nanocompuestos PA6/Ag presentan efecto de inhibición, ya que la película de referencia fue completamente atacada por los microorganismos.

Muestra Aspergillus Niger

Película de referencia + , ++

Inmersión

Anhídrido Itacónico, 25ºC (M1-i) + Anhídrido Maleico, 25ºC (M2-i) + Anhídrido Itacónico, 60ºC (M3-i) +

Aspersión

Anhídrido Itacónico, 25ºC (M1-a) + Anhídrido Maleico, 25ºC (M2-a) + Anhídrido Itacónico, 60ºC (M3-a) +

Impregnación en ultrasonido Anhídrido Itacónico, 25ºC (M1-u) +

Anhídrido Maleico, 25ºC (M2-u) + Anhídrido Itacónico, 60ºC (M3-u) +

87 Por tanto, debido a que no es posible apreciar un efecto significativo en la inhibición para el hongo A. Niger en esta prueba cualitativa, se lleva a cabo una técnica de carácter cuantitativo para complementar los resultados y obtener valores más confiables

Figura 41. Imágenes fotográficas para las muestras con deposición de nanopartícula de plata por el método de inmersión (a,b,c), aspersión (d,e,f) e impregnación en ultrasonido (g,h,i) con Anhídrido Itacónico o Anhídrido Maleico como agente de acoplamiento: a,d,g) Anhídrido Itaconico (25ºC), b,e,h) Anhídrido

Maleico (25ºC), c,f,i) Anhídrido Itacónico (60ºC)

a b c

Película Referencia

d e f

g h i

Inmersión

Aspersión

Impregnación en ultrasonido

88 La técnica cuantitativa consiste en la propagación del hongo A. Niger en un medio de cultivo por agitación. Para llevar a cabo el análisis por esta técnica, la película de referencia (sin recubrimiento con plata) así como los nanocompuestos fueron incubados en una suspensión de A. Niger en un Caldo de Papa Dextrosa (CDP). El hongo se mantuvo en contacto con la muestra por 72 horas. Así, el porcentaje de inhibición se midió mediante método gravimétrico, usando la Ecuación 6 (sección 2.6.2.1).

3.4.6.1.1 Método por inmersión.

En la Figura 42 se observan los resultados del porcentaje de inhibición para los nanocompuestos elaborados por el método de inmersión.

Figura 42. Prueba cuantitativa para los nanocompuestos elaborados por el método de inmersión, con un porcentaje de inhibición de: 19.5% para M1-i (Anhídrido Itacónico 25º), 9.7 % para M2-i (Anhídrido

Maleico 25ºC) y 10.3 % para M3-i (Anhídrido Itacónico 60ºC).

Así, es posible observar que el nanocompuesto en presencia del anhídrido itacónico como agente de acoplamiento y con una dispersión de agregados de plata a 25ºC (M1-i), presenta el valor más alto en el porcentaje de inhibición (19.5%). De acuerdo a los resultados obtenidos en la liberación de los iones de plata (Figura 35), el nanocompuesto M1-a (anhídrido itacónico, 25ºC) libera una mayor concentración de iones de plata en 72 horas (3 días) que los otros dos nanocompuestos elaborados con la misma técnica. Por tanto,

Película de Referencia M1-i M2-i M3-i

0 20 40 60 80 100 120 140

160 _{9.7 % 10.3 %}

19.5 %

Biomasa (mg/ml)

Muestras

89 esta es la razón por la que se observa un alto valor en el porcentaje de inhibición para este nanocompuesto.

3.4.6.1.2 Método por aspersión.

En la Figura 43, se muestran los resultados en las pruebas antimicrobianas para los nanocompuestos con impregnación de agregados de plata por el método de aspersión.

Figura 43. Prueba cuantitativa para los nanocompuestos elaborados por el método de aspersión, con un porcentaje de inhibición de: 35.7 % para M1-a (Anhídrido Itacónico 25º), 19.6 % para M2-a (Anhídrido

Maleico 25ºC) y 23.0% para M3-a (Anhídrido Itacónico 60ºC).

Así, la muestra con anhídrido itacónico a 25ºC (M1-a) presenta el valor más alto en porcentaje de inhibición, siendo de 35.7% con una liberación de iones de plata de 0.022 ppm para el día 3 (72 horas de incubación del medio de cultivo). Para el nanocompuesto con anhídrido maleico a 25ºC (M2-a) se obtiene un 19.6 % de inhibición con una liberación de iones de plata de 0.0033 ppm. Por último, para el nancompuesto con anhídrido itacónico a 60ºC (M3-a) se alcanza un porcentaje de inhibición de 23.0% con una liberación de iones de plata de 0.014 ppm (para el día 3). Así, es posible observar la relación entre la concentración de iones de plata liberados y el porcentaje de inhibición por tanto, a mayor liberación de iones se tendrá un alto porcentaje de inhibición.

Película de Referencia M1-a M2-a M3-a

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

23.0 % 19.6 %

35.7 %

Biomasa (mg/ml)

Muestras

90 Por otro lado, se observan valores altos en los porcentajes de inhibición para los nanocompuestos elaborados por aspersión (Figura 43) que para los elaborados por inmersión (Figura 42) y la razón puede deberse a que las gotitas formadas al esprear la solución coloidal en el substrato encapsulan una mayor cantidad de aglomerados de plata, originando que los iones de plata se liberen en los primeros días.

3.4.6.1.3 Método por ultrasonido.

Por último, las propiedades antimicrobianas para los nanocompuestos elaborados por impregnación en ultrasonido se muestran en la Figura 44.

Figura 44. Prueba cuantitativa para las muestras con deposición de plata por el método de impregnación en ultrasonido, con un porcentaje de inhibición de: 28.3 % para M1-u (Anhídrido Itacónico 25º), 21.3 %

para M2-u (Anhídrido Maleico 25ºC) y 14.0 % para M3-u (Anhídrido Itacónico 60ºC).

Para la muestra con anhídrido itacónico a 25ºC (M1-u) se observa un porcentaje de 28.3%

de inhibición, de 21.3 % para la muestra con anhídrido maleico a 25ºC (M2-u) y por último, de 14.0 % para la muestra con anhídrido itacónico a 60ºC (M3-u).Dichos valores de inhibición están relacionado con la concentración de iones de plata (Figura 39). Es decir, los nanocompuestos que presentan un bajo valor de inhibición es debido a la baja concentración del agente biocida liberado en el medio.

Película de Referencia M1-u M2-u M3-u

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

14.0 % 21.3 %

28.3 %

Biomasa (mg/ml)

Muestras

91 Por tanto, es posible concluir que el método de difusión en agar (cualitativo) no es una técnica cuyos resultados presentados sean definitivos, ya que aunque no se observa una zona de inhibición alrededor de la muestra, sí presentan porcentajes de inhibición al realizar las pruebas por un método cuantitativo (medio de cultivo líquido). Además, fue posible observar la estrecha relación que existe entre la concentración de iones de plata liberados del nanocompuesto y los porcentajes de inhibición. Es decir, a mayor liberación de iones mayor es la inhibición antimicrobiana. Por otro lado, en los tres métodos de impregnación de agregados de plata (inmersión, aspersión e impregnación en ultrasonido) al usar anhídrido itacónico con una dispersión de los agregados de plata a 25ºC, se obtenían valores altos en los porcentajes de inhibición, lo cual está relacionado a la cantidad de agregados de plata impregnados en el substrato y al tamaño de los mismos.