Pruebas antimicrobianas

La realización de los ensayos antimicrobianos tanto de nanopartículas como de nanocompuestos se llevó a cabo mediante el método ASTM D2149: Standard Test Method for Determining the Antimicrobial Activity of Immobilized Antimicrobial Agents Under Dynamic Contact Conditions [238]; probando dos bacterias diferentes: la bacteria gram positiva denominada S. aureus y la bacteria gram negativa P. aeruginosa. Enseguida se detalla la metodología desarrollada en estas pruebas antimicrobianas.

Preparación de la suspensión bacteriana. Para la activación y crecimiento del inóculo se utilizó un medio nutritivo de peptona de gelatina y extracto de carne con un pH final de 6.9±0.2 (caldo nutritivo). Dentro de un tubo de vidrio para cultivo con taparosca de 15 mL (diámetro y longitud de 16x125 mm, respectivamente), se adicionaron 2 mL de caldo nutritivo previamente preparado y, enseguida se agregaron 100 µL del inóculo bacteriano (mantenido anteriormente en estado liofilizado). Subsecuentemente, el frasco con la mezcla de bacterias y nutrientes se introdujo en una incubadora de agitación marca MRC modelo LOM 500, la cual

fue ajustada a una temperatura de 37 ºC y operada a una velocidad de agitación de 140 rpm, para mantener la muestra bajo estas condiciones durante un periodo de tiempo de 16 a 18 horas (el tiempo es dependiente de la curva de crecimiento máximo de la bacteria).

Después de activar el microorganismo y favorecer su nivel de crecimiento máximo, se prosiguió a la preparación de la solución de bacterias a la concentración final para su aplicación. Este procedimiento inició a través de la incorporación de 15 µL del inóculo activado y crecido previamente en 5 mL de una solución amortiguadora denominada solución Ringer, dentro de un tubo de vidrio para cultivo de 15 mL. La determinación de la concentración de las bacterias se midió en un espectrofotómetro de UV-Vis marca Spectronic modelo GENESIS 20. En el equipo se usó una longitud de onda igual a 600 nm y se registró una absorbancia de 0.02, la cual indicó el nivel de crecimiento máximo de la bacteria presentando una concentración de 1x10⁷ unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL). Posteriormente, dentro de otro tubo de cultivo de vidrio se depositaron 4.9 mL de la solución Ringer y 100 µL del inóculo concentrado (1x10⁷ UFC/mL), para obtener una solución con una concentración de 1x10⁶ UFC/mL. Enseguida se tomó 1 mL de ésta solución y 9 mL de la solución Ringer en otro tubo para cultivo, y así obtener la solución final de bacterias a utilizar a una concentración de 1x10⁵ UFC/mL.

Preparación de las soluciones de nanopartículas y de los nanocompuestos de Nylon 6 y PA. Con el objetivo de evaluar la actividad antimicrobiana de las nanopartículas de cobre metálico contra dos tipos distintos de bacterias, se prepararon cinco soluciones con concentraciones de 100, 200, 400, 800 y 1,600 ppm con concentraciones en peso iguales a 0.01, 0.02, 0.05, 0.08 y 0.16%, respectivamente. En la preparación de las soluciones ya mencionadas bajo sus diferentes concentraciones, se tomó como base una solución principal con una concentración de 3,200 ppm o 0.32% en peso de nanopartículas (que no fue incluida en el ensayo). La preparación de ésta solución se realizó agregando 64 mg de nanopartículas dentro de un matraz de vidrio de 50 mL y adicionando 20 mL de agua desionizada. Una vez que se hizo la mezcla, se procedió a sonificar la solución por medio de un equipo de ultrasonido marca Branson modelo 102CE a una potencia de 200 W y una amplitud de 50%

dispersas y estables por un tiempo determinado. Finalizado el proceso anterior, se prosiguió con la preparación en serie de las cinco soluciones desde una concentración de 1,600 a 100 ppm. Cabe mencionar que para cada una de las soluciones se emplearon vasos de precipitado de 50 mL, así como una solución amortiguadora denominada solución Ringer con 1% del agente dispersante Tween 80. La función de éste agente fue mantener a las nanopartículas lo más dispersas posible.

Para la preparación de los nanocompuestos de Nylon 6/nPCu se hicieron películas con una geometría circular con un diámetro de 20 mm y un espesor igual a 250 µm. Los compuestos de Nylon 6 considerados para este procedimiento mantuvieron una concentración en peso de nanopartículas de cobre metálico iguales a 100, 500, 1,000 y 5,000 ppm equivalentes a un contenido en peso de 0.01, 0.05, 0.10 y 0.50%, respectivamente.

Adicionalmente, también se prepararon películas de Nylon 6 puro que fue utilizado como estándar de comparación. Para ello se utilizó un equipo conocido como Universal Film Maker (UFM) con placas de calentamiento de la marca Thermo Spectra-Tech modelo 0019-030, en el cual se fundieron y prensaron gránulos de los compuestos para lograr las dimensiones finales de la película obtenida. En el caso particular de la preparación de la muestra de los compuestos de PA/nPCu, se cortaron películas de un espesor igual a 300 µm con la misma geometría que las correspondientes a las de los compuestos de Nylon.

Procedimiento para determinar la actividad antimicrobiana. Los ensayos antimicrobianos se realizaron probando en primer lugar la bacteria gram positiva denominada S. aureus y, posteriormente, empleando la gram negativa conocida como P. aeruginosa. En cada ensayo por separado se utilizó una solución de bacterias previamente preparada a una concentración de 1x10⁵ UFC/mL, las distintas soluciones de nanopartículas de cobre metálico, las diferentes películas de los nanocompuestos de Nylon 6/nPCu así como las de Nylon 6 puro, películas de compuestos de PA/nPCu, pintura sin partículas y, adicionalmente, una solución Ringer libre del agente dispersante Tween 80. Es necesario mencionar que todas las pruebas se hicieron por triplicado.

En primera instancia, se preparó un control positivo donde únicamente se sembraron bacterias. Para llevar a cabo esta parte y empleando un tubo cónico de plástico de 10 mL, se depositaron 1 mL de una solución Ringer y posteriormente 1 mL de la solución de bacterias bajo una concentración de 1x10⁵ UFC/mL. Inmediatamente después la disolución se agitó en un equipo Vortex durante un tiempo máximo de 2 a 3 segundos. De ésta mezcla se tomaron 100 µL y se adicionaron en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL (tubo eppendorf) provisto de 900 µL de la solución Ringer. De igual manera que en el paso anterior, la mezcla se agitó de 2 a 3 segundos. Posteriormente, se tomaron 100 µL y se depositaron en una caja Petri de poliestireno estéril, previamente preparada con un medio de agar nutritivo. La siembra de la solución se realizó con aplicadores estériles de algodón extendiendo uniformemente. Esta caja se rotuló como tiempo de contacto de 0 horas. Todo el procedimiento anterior se realizó exactamente de la misma manera para cada una de las soluciones de nanopartículas bajo sus distintas concentraciones, resaltando que la única diferencia es que en lugar de adicionar 1 mL de solución Ringer a 1 mL de solución de bacterias, se incorporó 1 mL de la solución de nanopartículas en cada una de sus concentraciones. Enseguida, tanto el tubo del control como los tubos con las mezclas de soluciones de nanopartículas y las bacterias se colocaron en una incubadora, manteniendo una agitación de 140 rpm a una temperatura de 37 ºC. Asimismo, las cajas Petri sembradas se introdujeron en la incubadora a la misma temperatura durante un intervalo de tiempo de 18 a 24 horas. Después de este tiempo se sacaron las cajas Petri de la incubadora y se realizó el conteo de las colonias presentes en el agar nutritivo de las mismas.

El procedimiento anterior se repitió a las 2, 4 y 6 horas de contacto.

Para el caso de las pruebas antimicrobianas de los nanocompuestos, éstas se llevaron a cabo de la misma manera que las efectuadas con las nanopartículas, sólo que aquí la película del nanocompuesto se adicionó directamente en la solución de bacterias. Un dato muy importante que debe tomarse en cuenta para el reporte final de la concentración mínima bactericida (CMB) de las nanopartículas de cobre puras al probarse contra las bacterias S.

aureus y P. aeruginosa, es que durante la prueba la concentración de las nanopartículas en cada una de las soluciones se diluyó a la mitad porque se agregaron un mL de solución Ringer y un mL de nanopartículas. Las nuevas concentraciones de nanopartículas en las soluciones

El cálculo de la actividad antimicrobiana de las nanopartículas solas y dentro de la matriz polimérica de Nylon 6 y PA en los compuestos, fue posible teniendo como punto de partida la información de las UFC/mL presentes en el agar nutritivo de las caja Petri, correspondiente a cada uno de los estándares de comparación en sus diferentes tiempos de contacto. En ese sentido, se tienen cuatro datos importantes pertenecientes a los tiempos de contacto de 0, 2, 4 y 6 horas. Adicionalmente, para la determinación fue imprescindible contar con las UFC/mL en las cajas Petri de cada una de las muestras. La determinación de la actividad antimicrobiana se llevó a cabo en base a la Ecuación 6.1:

 %  𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑  𝑎𝑛𝑡𝑖𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑏𝑖𝑎𝑛𝑎  =  

𝑈𝐹𝐶𝑚𝐿  𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝑈𝐹𝐶

𝑚𝐿  𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

𝑈𝐹𝐶𝑚𝐿  𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 ∗100      (6.1)

donde UFC/mL control corresponde a las colonias que crecieron en el agar nutritivo de las

cajas en cada tiempo de contacto (0, 2, 4 y 6 horas), y UFC/mL muestra es atribuido a las colonias presentes en las cajas Petri de cada una de las muestras de la mezcla de bacterias con nanopartículas, o en su caso, de los nanocompuestos en contacto con las bacterias para cada uno de los tiempos de análisis.