Las técnicas empleadas en la presente investigación fueron tomadas por observación indirecta debido a que no está en contacto con el fenómeno, pero se puede observar por medio de otros elementos y experimentación que supone una alteración controlada de las condiciones normales. Además, las técnicas son los procedimientos y actividades que nos permite obtener los datos necesarios para cumplir con nuestros objetivos (Hernández et al., 2016).
2.5.2. Preparación de la materia prima:
Para este estudio se utilizó los residuos obtenidos del proceso de escarificado en seco de los granos de quinua, estas fueron proveídas por la empresa Agroindustrial (Foods Perú Andinos S.R.L), figura 8, que fueron colectadas en bolsas de polietileno, selladas y etiquetadas y llevadas al laboratorio de manera inmediata.
Las muestras se secaron a una temperatura promedio de 35 °C durante 48 horas, según lo propuesto por (Shu et al., 2004), que utilizo FSC para extraer sapogeninas de Smilax china.
Para el diámetro de partícula se realizaron pruebas preliminares con diferentes tamaños de muestra (0,1 – 0,4 mm) y muestra sin tamizar, de los cuales el tamaño de partícula que más se ajustó al equipo de extracción SFE fue el de 0.4 mm aproximadamente, que fue reportado de manera similar al estudio de (Sun et al., 2010), en la optimización de extracción por FSC en saikosaponins de Bupleurum falcatum.
Figura 8
Escarificado homogéneo de quinua.
37 2.5.3. Extracción e hidrolisis de saponinas
Se realizaron extracciones con dióxido de carbono supercrítico del escarificado homogenizado de quinua. Se utilizó un equipo Spe-ed SFE basic (Applied Separations, Inc., Allentown, PA, United States) Figura 9, que permite rendimientos precisos y repetibles en modo dinámico en donde el CO2 supercrítico se presuriza en un recipiente de extracción sellado durante un período específico de tiempo. Este equipo consta de tres módulos: (1) El módulo del horno está equipado con recipientes internos de diferentes volúmenes (5 y 100 ml), la temperatura del recipiente extractor se controla con un termopar separado y es capaz de alcanzar temperaturas de hasta 150 °C. (2) El CO2 está presurizado por un módulo de bomba capaz de alcanzar hasta 10,000 psi (690 bar). Se necesita un cilindro de aire comprimido con una presión de suministro mínimo de 90 psi (6,2 bar) para impulsar la bomba. La presión de CO2 del recipiente de extracción que contiene la muestra se ajusta mediante una válvula manual. Las temperaturas de extracción y separación se consiguen con una camisa termostática. Las temperaturas de proceso son controladas por un aparato electrónico. (3) El módulo de control y recolección controla los caudales con las válvulas de micro medición.
El tiempo de extracción inicial se estableció cuando se alcanzó la presión de trabajo. A intervalos constantes los extractos se muestrearon manualmente usando viales de vidrio sellados con tapas y septos. El co-solvente se agregó a la muestra una vez alcanzado los parámetros establecidos para los análisis, se utilizó etanol puro como co-solvente, agregado por una bomba con diferentes flujos de inyección al sistema (ml min-1). En cada experimento se cargó 18 gramos del escarificado homogéneo en el vessel de extracción, donde se evaluaron las condiciones óptimas de extracción (presión, temperatura y flujo de co-solvente). El tiempo de extracción en todos los tratamientos fue de una hora, que fue establecido según pruebas preliminares.
Los extractos crudos obtenidos de todos los tratamientos fueron centrifugados a 3000 rpm con un equipo (Pro- Research/ by century scientific ltd), para separar los sólidos grasos del extracto, luego se concentró a reducida presión con un equipo (Buchi Vaccum Controller V850) a 500 mbar y 50°C. Una alícuota de 5 ml del concentrado crudo se hidrolizó con HCl 6 N a 110 °C durante 2 h según lo propuesto por (Aluwi et al., 2016; Medina-Meza et al., 2016) con algunas modificaciones. Los hidrolizados se enfriaron, y se neutralizó con NH4OH, y se
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centrifugaron a 3000 rpm durante 5 min. Las sapogeninas luego se extrajeron mediante partición liquido-liquido con acetato de etilo (3 x 5 mL). Las fracciones se combinaron y se filtró en Na2SO4 anhidro. Los extractos obtenidos se almacenaron a -20°C para los siguientes análisis. El caudal del CO2 supercrítico se controló mediante una válvula de micrometría y se fijó en 0,8 ml min-1.
Figura 9
Equipo de extracción de fluidos supercríticos, (Fuente propia)
2.5.4. Contenido de saponinas totales:
El contenido de saponinas totales se determinó por espectrofotometría UV- vis según el método propuestos por (Aluwi et al., 2016; Medina-Meza et al., 2016), que se muestra en la figura 10. Se colocó el extracto de sapogenina (250 μL) en un tubo centrifuga de 2 mL, con 1000 μL de la mezcla de los reactivos (ácido acético glacial / ácido sulfúrico 1:1 v/v) para el desarrollo del color, se agito vigorosamente con un vortex (30 segundos) y luego se calentó a 60 °C por un periodo de 30 minutos, durante este tiempo se desarrolló el color purpura, después se enfrió en agua helada. La absorbancia se midió a 527 nm. El ácido acético glacial se usó como blanco. El contenido de saponinas totales se obtuvo comparando con una curva estándar de ácido oleanólico puro (100 μg/ml a 1000 μg/ml) y los resultados se expresaron en mg/ml de ácido oleanólico equivalente.
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Figura 10
Conjunto de procedimientos para determinar las saponinas de quinua.
2.5.5. Cuantificación de la sapogeninas por cromatografía de gases:
La cuantificación de las saponinas totales se realizó de manera indirecta teniendo como referencia al ácido oleanólico que es el componente que se encuentra en mayor proporción en la quinua, para lo cual se utilizó el método propuesto por (Caligiani et al., 2013; Medina-Meza et al., 2016; Rada, Castellano, Perona, & Guinda, 2015) con algunas modificaciones. Se tomó una alícuota del
Escarificado de quinua
Extracción por fluidos supercríticos
Hidrolisis
HCL 6N a 110 ºC 2 horas
Neutralización
NH4OH
Partición liquido/ liquido Acetato de etilo
Filtración
Saponinas totales Cromatografía
Reacción de color
Espectroscopia UV-Vis
Derivatización
Cromatografía gases
Concentrado a baja presión
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extracto final, que fue secado bajo una corriente de nitrógeno. Luego para derivatizar las saponinas extraídas, se añadió 100 μL de piridina anhidra, 100 μL de bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA), al extracto seco se le calentó a 70
°C durante 1 hora. La solución derivada (2 μL) se inyecto en un equipo de cromatografía de gases Agilent 6890N GC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), equipado con una columna capilar RESTEK Rxi-5HT (30 m x 0.25 mmid;
0.25 μm). Se usó el modo Splitless y la temperatura del inyector se ajustó a 290
°C. Se utilizó helio como gas portador a un flujo de 1.4 ml / min. Las temperaturas del inyector y del detector se fijaron a 350 °C, mientras que la temperatura del horno se programó de 160 a 220 °C a 15 °C/min, de 220 a 290 °C a 10 °C/min, durante 7 min, a partir de 290 a 330 °C a 8 °C/min. El tiempo total de ejecución fue de 20 minutos. Para la cuantificación del ácido oleanólico de la muestra optima, se realizó una curva de calibración del ácido oleanólico utilizando una curva estándar basada en el estándar del ácido de oleanólico puro, la identificación se realizó mediante la integración del área cromatográfica total después de verificar la pureza del espectro.
2.5.6. Capacidad antioxidante método ABTS:
Se determinó según lo propuesto por (Kuskoski, Asuero, García-Parilla, Troncoso, & Fett, 2004; Nenadis, Wang, Tsimidou, & Zhang, 2004; Olszowy &
Dawidowicz, 2017; Re et al., 1999), en donde el radical ABTS•+ se obtiene tras la reacción del ABTS (7 mM) con persulfato potásico (K2S2O8) 2,45 mM concentración final, y se diluye con etanol hasta que el valor de la absorbancia a 754 nm (longitud de onda máxima) sea igual a 0.7 (± 0,1). A 980 μL de la dilución del radical ABTS•+
generado se le determino la absorbancia a 754 nm a temperatura ambiente, se añade 20 μL de la muestra y se mide de nuevo la absorbancia a 754 nm pasado 1 minuto. La absorbancia se midió de forma continua transcurridos 7 minutos. Como referencia se toma al Trolox, que se preparó a concentraciones de 0-15 μM (concentración final) en etanol, bajo las mismas condiciones. Los resultados se expresan en TEAC, (actividad antioxidante equivalente a Trolox).
2.5.7. Capacidad antioxidante método DPPH:
Se determinó según lo propuesto por (Brand-Williams, Cuvelier, & Berset, 1995; Lucas-Abellan, Mercader-Ros, Zafrilla, Gabaldon, & Nunez-Delicado, 2011).
La solución madre se preparó disolviendo 24 mg de DPPH con 100 mL en MeOH, y luego se almacenó a -20 °C en la oscuridad hasta los análisis posteriores. La
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solución de trabajo se obtuvo diluyendo 10 mL de solución madre con 45 mL de MeOH, para obtener una absorbancia de 1,1 (± 0.1) unidades a 515 nm. La capacidad antioxidante se expresó como equivalentes de Trolox μM. Se utilizó una curva de calibración en un rango de concentración de 0-5 μM.