Validación del método de extracción de compuestos

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Validación del método de extracción de compuestos

La metodología para determinar y cuantificar los OCs se obtuvo mediante años de investigación y desarrollo en el campo de la química analítica ambiental, teniendo como resultado un grupo de métodos que ayudan a detectar y así poder monitorear estos contaminantes. Una de las herramientas más importantes para este fin es la cromatografía de gases. Este procedimiento analítico es aplicado en diversas matrices, ya sea agua, aire, suelo y sedimento, suero, fluidos y tejidos de organismos. Los métodos más aceptados son aquellos desarrollados o aprobados por instituciones internacionales principalmente de E.U. como la Agencia de Protección al Ambiente (EPA por sus siglas en inglés), el Instituto Nacional para la Seguridad Ocupacional (NIOSH por sus siglas en inglés), la Asociación de Salud de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC por sus siglas en inglés) y la Asociación de Salud Pública Americana (APHA por sus siglas en inglés) (Miller-Pérez et al., 2009).

Uno de los objetivos básicos del análisis y monitoreo de contaminantes en el ambiente es la investigación del desarrollo de nuevos métodos para la identificación y cuantificación de estos compuestos, teniendo una tendencia hacia métodos que permitan una detección de concentraciones traza (ppm) de contaminantes en las muestras y en matrices complejas (Namiesnik y Zygmunt, 1999). En el presente estudio se analizaron 16 plaguicidas organoclorados (pOCs) y 12 bifenilos policlorados (PCBs) en tejidos de pez dorado Coryphaena hippurus. Para esto es importante considerar que la manera más apropiada para realizar un método analítico, en este caso la extracción de compuestos organoclorados (OCs), depende tanto de las propiedades fisicoquímicas de los

contaminantes (p. ej. polaridad, presión de vapor, solubilididad, punto de ebullición, etc.), como de las características de la muestra (p. ej. sólida, líquida, contenido de agua, contenido de lípidos, etc.). Por lo tanto, se seleccionaron métodos estandarizados para la extracción de este tipo de contaminantes; el método multiresiduos del Departamento de Alimentos y Agricultura de California (CDFA por sus siglas en inglés), y el método extracción acelerada con solventes (ASE por sus siglas en inglés). El método ASE, aunque es relativamente nuevo ya ha sido probado en una gran variedad de matrices como sedimentos (Björklund et al., 1999; Martínez et al., 2004; Josefsson et al., 2006), cereales (Carabias-Martínez et al., 2006) y biota (Martínez et al., 2004;

Fidalgo-Used et al., 2007; Boscher et al., 2010). Se han analizado una amplia variedad de contaminantes como PCBs (Björklund et al., 1999; Gómez-Ariza et al., 2002; Josefsson et al., 2006; Wiberg et al., 2007; Boscher et al., 2010), plaguicidas (Haib et al., 2003; Suchan et al., 2004), Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) (Jánská et al., 2004; Martínez et al., 2004; Tao et al., 2004;

Liguori et al., 2006), éteres difenil polibromados (PBDEs) (Johansson et al., 2006; Stapleton et al., 2006) y dioxinas (Saito et al., 2003; Kitamura et al., 2004) con el método 3545 aprobado por la US EPA (Björklund et al., 1999; Haib et al., 2003). Es válido hacer adaptaciones a cada método adecuándolo a las características de la muestra a analizar y a las propiedades del contaminante, esto siempre y cuando se compruebe que los datos obtenidos son confiables.

Es importante para la interpretación de datos de un monitoreo ambiental conocer las limitaciones de los métodos a utilizar, el nivel de confianza de los datos que estos métodos generan, así como también la capacidad del analista para minimizar errores. Todo en conjunto toma más relevancia cuando las concentraciones normalmente encontradas en la mayoría de las muestras de campo son a nivel traza. Namiesnik y Zygmunt (1999) mencionan que para que los resultados que se obtienen en el laboratorio sean confiables, es necesario llevar a cabo la calibración de los instrumentos de medición, así como también debe llevarse a cabo una validación del procedimiento analítico completo; esto

con base en parámetros de validación tales como selectividad, especificidad, exactitud, precisión, repetibilidad, reproducibilidad, límites de detección y cuantificación para cada compuesto, intervalo de medidas, linealidad, entre otros parámetros que sirven para indicar si el método utilizado es el adecuado (CENAM, 1998).

Existen diversas maneras de llevar a cabo la validación de un método, dependiendo de los objetivos de cada laboratorio o del tipo de análisis que se quiere realizar. Por ejemplo, la validación ISO 5725 indica que los análisis cuantitativos se pueden validar mediante repetibilidad y reproducibilidad, mientras que la ISO 16140 de la Organización Internacional para la Estandarización (ISO por sus siglas en inglés) especifica que para análisis cualitativos es importante utilizar métodos de referencia con fines comparativos.

La validación de acuerdo al Comité de Codex Alimentario para Residuos de Plaguicidas (CCPR, por sus siglas en inglés) basa su validación y verificación de métodos en las propuestas y recomendaciones de la consulta AOAC/FAO/IAEA de 1999, las cuales están realizadas sobre distintas validaciones internas de un laboratorio adaptadas a necesidades específicas (Gowik, 2009). El analista debe decidir hasta qué grado de validación quiere llegar, cuáles parámetros de validación debe aplicar, esto dependiendo de los propósitos de la validación, ya sea que esté realizando la validación para la optimización de un método, extensión de un método, adaptación de un nuevo método ya estandarizado en otro laboratorio o, como en el presente estudio, la comparación de dos métodos analíticos para evaluar su eficiencia de extracción de compuestos OCs.

En la Guía de Laboratorio para la Validación de Métodos y Temas Relacionados (CENAM, 1998) se define validación de un método como el ―proceso de definir una necesidad analítica y confirmar que el método en cuestión tiene capacidades de desempeño consistentes con las que requiere la aplicación‖. En la actualidad, existen muchísimas aplicaciones para los métodos analíticos, que van desde la determinación de concentraciones de componentes en un

producto comercial, hasta el monitoreo de contaminantes ambientales. Detrás de cada análisis es necesario realizar una toma de decisiones acertada que permita tener confianza en los datos generados por el método analítico. La generación de información utilizando métodos analíticos implica un costo económico elevado; si esta información no es confiable, no tiene mucho valor y, por lo tanto, no puede ser usada para la toma de decisiones (CENAM, 1998).

En este estudio se utilizaron los parámetros de validación especificados en el Centro Nacional de Metrología (CENAM) para comparar las técnicas, CDFA (Lee et al., 1991) y ASE (Método EPA 3545A, 2007), utilizando músculo de C.

hippurus para conocer en términos de eficiencia cuál de los dos métodos es el adecuado para la extracción de compuestos organoclorados.

La validación se llevó a cabo utilizando una solución estándar que contenía una mezcla de 16 plaguicidas organoclorados, sin tomar en cuenta los PCBs. Esto debido a que al principio se inició con los PCBs y se observó que de siete PCBs en cuatro no se tenía linealidad, además que se obtenían amplias variaciones en las recuperaciones (Anexo III). Sundberg et al. (2006) indican que la presencia de solvente, al momento de la fortificación, puede interferir con la extracción de los compuestos (principalmente PCBs) y hace la recomendación de que la fortificación de la matriz se lleve a cabo sin solvente, es decir, añadiendo la solución estándar en el material que contendrá la muestra, evaporarlo a sequedad dejando los analitos en la superficie del material para que al añadir la muestra sean incorporados a ella. En este estudio no se consideró hacer la fortificación de esta manera porque no se tenía la información al momento de hacer los análisis para validación.

La selectividad de los métodos ASE y CDFA fue verificada mediante el procesamiento de las muestras y su análisis por cromatografía de gases donde se identificaron todos los compuestos de interés contenidos en la muestra fortificada con la mezcla de estándares de pOCs. El nivel de interferencia se

evaluó analizando muestras control conocidas como ―blanco‖ y las muestras fortificadas con solución estándares de compuestos OCs. En cuanto a picos no identificados, no se presentó ninguna interferencia de coelución, correspondiendo el tiempo de retención de los estándares con el de los analitos de interés. Las condiciones cromatográficas (definidas en la sección de metodología) seleccionadas permitieron una correcta separación de cada compuesto.

La linealidad fue evaluada con base a 5 concentraciones (5 réplicas) de la solución estándar de la mezcla de los pOCs con la cual se fortificó el músculo del pez. Con estos resultados se obtuvieron las curvas de calibración y mediante el ajuste al modelo lineal se obtuvieron los coeficientes de determinación (R²), correlación (r) y correlación cuadrada (r²) los cuales indican el mejor ajuste de las concentraciones respecto a la línea de calibración. Según la Conferencia Internacional de Armonización la r de la regresión lineal debe encontrarse entre 0.98 y 1 (ICH, 1996).

Para el método ASE, todos los pOCs presentaron r>0.98, excepto el HCH-γ (r=0.943), mientras que para el método CDFA sólo el 37 % de los compuestos tuvieron un r>0.98 (HCH-γ, HCH-δ, heptacloro epóxido, endrín, Endosulfán-β y p,p´-DDT) (Tabla 6).

En cuanto al R², para el método ASE, los pOCs que presentaron R²>0.99 fueron aldrín, Endosulfán-α, Endosulfán-β, endrín, ppDDD, ppDDT, endosulfán sulfato y endrín aldehído. (8 de 16 = 50%). El otro 50% tuvieron un intervalo de 0.88<R²<0.98. En relación al método CDFA el HCH-γ fue el único compuesto que tuvo un R²>0.99 (0.9995). En las Figuras 10 a la 14 se presentan las gráficas de linealidad para cada uno de los pOCs.

Tabla 6. Coeficientes de correlación (r) y coeficientes de correlación al cuadrado (r²) del método multiresiduos para plaguicidas del Departamento de Alimentos y Agricultura de California (CDFA) (Lee et al., 1991) y del método extracción acelerada con solventes (ASE) (Método EPA 3545A, 2007).

ASE CDFA

r r² r r²

HCH-α 0.98 0.9604 0.972 0.9447

HCH-β 0.98 0.9604 0.978 0.9564

HCH-γ 0.943 0.8892 1 1

HCH-δ 0.987 0.9741 0.989 0.9781

Heptacloro 0.988 0.9761 0.72 0.5184

Heptacloro epóxido 0.992 0.9840 0.989 0.9781

Aldrín 0.998 0.9960 0.911 0.8299

Dieldrín 0.995 0.9900 0.972 0.9447

Endrín 0.998 0.9960 0.989 0.9781

Endrín aldehído 0.999 0.9980 0.947 0.8968

Endosulfán-α 0.996 0.9920 0.857 0.7344

Endosulfán-β 0.996 0.9920 0.986 0.9721

Endosulfán sulfato 0.998 0.9960 0.972 0.9447

p,p´-DDD 0.999 0.9980 0.665 0.4422

p,p´-DDE 0.982 0.9643 0.961 0.9235

p,p´-DDT 0.998 0.9960 0.989 0.9781

Tabla 7. Coeficientes de determinación (R²) y límites de detección y cuantificación para pOCs del método multiresiduos para plaguicidas del Departamento de Alimentos y Agricultura de California (CDFA) (Lee et al., 1991) y del método extracción acelerada con solventes (ASE) (Método EPA 3545A, 2007).

R² ASE CDFA

ASE CDFA LOD* LOQ* LOD* LOQ*

HCH-α 0.9611 0.9449 0.042 0.127 0.022 0.067

HCH-β 0.9605 0.9564 0.019 0.056 0.035 0.106

HCH-γ 0.8892 0.9995 0.014 0.043 0.119 0.360

HCH-δ 0.9746 0.9777 0.006 0.019 0.180 0.545

Heptacloro 0.9763 0.5177 0.016 0.048 0.076 0.231

Heptacloro epóxido 0.9834 0.9774 0.010 0.031 0.301 0.912

Aldrín 0.9966 0.8304 0.021 0.062 0.094 0.283

Dieldrín 0.9892 0.9442 0.037 0.112 0.389 1.180

Endrín 0.9961 0.9782 0.034 0.102 0.169 0.511

Endrín aldehído 0.9983 0.8967 0.072 0.218 0.480 1.454

Endosulfán-α 0.9918 0.7348 0.024 0.074 0.157 0.474

Endosulfán-β 0.9928 0.9724 0.031 0.094 0.188 0.568

Endosulfán sulfato 0.9961 0.9442 0.087 0.264 0.378 1.144

p,p´-DDD 0.9989 0.4428 0.040 0.121 0.406 1.230

p,p´-DDE 0.9638 0.9228 0.039 0.117 0.628 1.904

p,p´-DDT 0.9968 0.9791 0.071 0.215 0.620 1.878

* µg/Kg de tejido húmedo; LOD Límite de detección; LOQ límite de cuantificación; análisis realizado con diferentes niveles de concentración de estándar (mezcla comercial 48858-U SUPELCO Analytical) 0.05, 0.01875, 0.0125, 0.00625 y 0.00315 ml/g de tejido húmedo (n= 15 ASE; n=25 CDFA).

Fig. 10 Comparación de la linealidad de los métodos ASE y CDFA para los compuestos HCHs en músculo de Coryphaena hippurus (n ASE = 15) (n CDFA = 25). HCH-α y γ con diferencias significativas entre ASE y CDFA (p<0.001). HCH-β y δ sin diferencias significativas (p>0.05).

Fig. 11 Comparación de la linealidad de los métodos ASE y CDFA para los compuestos heptacloro y heptacloro epóxido en músculo de Coryphaena hippurus (n ASE = 15) (n CDFA = 25). Heptacloro con diferencias significativas entre los métodos ASE y CDFA (p<0.001). Heptacloro epóxido sin diferencias significativas (p>0.05).

Fig.12 Comparación de la linealidad de los métodos ASE y CDFA para los compuestos Drines en músculo de Coryphaena hippurus (n ASE = 15) (n CDFA = 25). Compuestos Drines con diferencias significativas de la linealidad entre ASE y CDFA (p<0.005).

Fig. 13 Comparación de la linealidad de los métodos ASE y CDFA para los compuestos Endosulfán-α, Endosulfán-β y endosulfán sulfato en músculo de Coryphaena hippurus (n ASE = 15) (n CDFA = 25). Endosulfán-β y endosulfán sulfato con diferencias significativas entre ASE y CDFA (p<0.001). Endosulfán-α sin diferencias significativas (p>0.05).

Fig. 14 Comparación de la linealidad de los métodos ASE y CDFA para el DDT y sus metabolitos en músculo de Coryphaena hippurus (n ASE = 15) (n CDFA = 25).

Compuestos p,p´-DDT y p,p´-DDE con diferencias significativas entre ASE y CDFA (p<0.005). p,p´-DDD sin diferencias significativas (p>0.05).

Siempre que se hace la validación de un método es necesario establecer un límite de detección (LOD), principalmente cuando se evalúan concentraciones de compuestos muy bajas o a nivel de trazas. La finalidad de esto es conocer el valor de concentración más bajo del compuesto que puede detectarse confiablemente en nuestro equipo. De esta manera, algunas organizaciones como la ISO lo define como la ―concentración neta mínima detectable‖

(EURACHEM Guide, 1998), mientras que la IUPAC lo refiere como el ―valor verdadero mínimo detectable‖. El LOD para cada compuesto es dependiente de la matriz y del método de extracción (CENAM, 1998). En la Tabla 7 se presentan los datos del LOD para cada compuesto por cada método de extracción aplicado a la extracción de pOCs en músculo de pez Coryphaena hippurus. Como se puede observar, para el método ASE el LOD varió de 0.006 a 0.087 µg/kg de tejido para todos los plaguicidas analizados, mientras que para el Método CDFA el LOD se estimó entre 0.022 y 0.628 µg/kg de tejido para los plaguicidas extraídos.

El límite de cuantificación (LOQ) es un valor indicativo que expresa la concentración más baja que aún puede ser medida con exactitud y precisión (CENAM, 1998). Este parámetro siempre debe de ser determinado experimentalmente sobre la matriz (Brettell y Lester, 2004) y es calculado de la concentración del analito que corresponde a 10 veces la señal de ruido o 3 veces el LOD (Zhang et al., 2007).

En general por el método ASE se obtuvieron los valores más bajos de LOD y LOQ, y de acuerdo al promedio global, el LOD y LOQ del método CDFA son 300% más altos que los límites del ASE, lo que indica que el método ASE es más sensible para la detección de pOCs en tejido de pez.

La precisión se obtuvo calculando el C.V. de las réplicas (5) empleadas en la fortificación del músculo del pez. En el método ASE el coeficiente de variación evaluado estuvo en un intervalo de 1.64% - 19.22% mientras que por el método CDFA el intervalo fue más amplio (19.38% - 59.34%), lo cual indica que el método ASE es más preciso.

La exactitud se calculó por medio de los porcentajes de recuperación, tomando en cuenta las concentraciones nominales empleadas en la fortificación del tejido. En la Figura 15 se muestran los porcentajes de recuperación de los pOCs con los dos métodos de extracción empleados. Las recuperaciones de los pOCs obtenidas por el método ASE estuvieron en un intervalo de 91.78% a 115.51%, excepto el HCH-γ (56.62%). En contraste, las recuperaciones evaluadas por el método CDFA estuvieron en un intervalo entre 43.55% a 109.38%. El método de la EPA 8081B (2000) un intervalo de exactitud confiable para plaguicidas organoclorados es de 75% - 120%, esto lo cumplen solo 5 compuestos en el método CDFA, mientras que por el método ASE todos los compuestos están dentro del intervalo, por lo tanto se puede considerar a este último como más exacto.

De acuerdo a las concentraciones que se esperan encontrar en muestras de campo y tomando en cuenta que esos son niveles traza, se realizó la

fortificación de 5 réplicas de cada nivel de concentración lineal 0.05, 0.01875, 0.0125, 0.00625 y 0.00315 ml/g de tejido húmedo en donde la recuperación de cada uno de los pOCs fue evaluada. Como se puede ver en la Figura 15, las recuperaciones de los OCs para el método CDFA se encontraron dentro de un intervalo de 43.55% y 109.38%, cumpliendo con el intervalo de exactitud de 80% a 120% sólo en cinco compuestos (HCH-γ, HCH delta, dieldrín, Heptacloro y heptacloro epóxido). Las recuperaciones de todos los pOCs para el método ASE estuvieron entre 91.78% y 115.51%, excepto para el compuesto HCH-γ, que tuvo una recuperación de 56.62%. Haciendo la comparación de métodos, se obtiene que el método ASE fue el que obtuvo un mayor número de compuestos (15 pOCs) que cumplieron con el intervalo especificado, por lo tanto, el método ASE es más exacto que el método CDFA. En cuanto a precisión, el C.V. del Método ASE se encontró entre 1.64 % y 19.22 %, mientras que para el método CDFA el intervalo fue más amplio, teniendo valores de 19.38 % a 59.34 %, lo que indica que el método ASE es más preciso que el método CDFA.

En un estudio realizado en muestras de sedimento (Björklund et al.,1999), se probó la efectividad del método ASE de acuerdo al método 3545 de la Agencia de Protección al Ambiente (EPA), obteniendo una buena extracción de compuestos. Ellos mencionan que el tamaño de la partícula afecta la eficiencia de extracción, por ello en el presente trabajo se procuró que todos los tejidos estuvieran debidamente triturados y homogéneos al momento de preparar la muestra con la tierra diatomea para la extracción. Los datos obtenidos por Björklund et al. (1999) muestran que la extracción de fluidos presurizada, ASE, es eficiente en cuanto a la extracción de analitos fuertemente enlazados con la matriz. La efectividad del método ASE para obtener recuperaciones comparables a las del método Soxhlet motivó que este procedimiento fuera aceptado por la EPA como método de extracción de compuestos orgánicos (Björklund et al., 1999; Haib et al., 2003), como el método 3545 Extracción de fluido presurizado (PFE por sus siglas en inglés).

Fig. 15 Comparación de la recuperación (%) y coeficiente de variación (%) de la extracción de pOCs en músculo de pez por los métodos ASE y CDFA

En comparación a los métodos tradicionales, el método ASE disminuye el volumen de solvente requerido para la extracción y agiliza el proceso de extracción al calentar el solvente orgánico más allá de su punto de ebullición, pero manteniéndolo en forma líquida mediante presión alta (Fidalgo-Used et al., 2007). Otros parámetros que son de importancia fundamental para la extracción óptima de los analitos, son la temperatura, el tiempo que depende del número de ciclos estáticos de extracción y la mezcla de solventes (Suchan et al., 2004).

Por ejemplo, para aumentar la recuperación del HCH-γ es necesario optimizar las condiciones de extracción, ya sea cambiando la mezcla de solventes orgánicos utilizada en la extracción, cambiando las condiciones de temperatura y/o presión o simplemente aumentando el número de ciclos. La mezcla de solventes adquiere especial importancia ya que los compuestos son extraídos de acuerdo a su polaridad. Así, la mezcla acetona/hexano (1:1 v/v) tiene una polaridad de 2.7, mientras que otros solventes que también se utilizan para la extracción de OCs tiene diferentes polaridades, como el diclorometano con 3.4, la mezcla hexano/acetona (4:1, v/v) de 1.08 y el hexano de 0.0. Suchan et al.

(2004) mencionan que los solventes orgánicos comúnmente utilizados para la extracción de PCBs y pOCs, tanto en muestras abióticas como bióticas son hexano, tolueno, y las mezclas hexano-diclorometano 1:1 (V/V) y hexano- acetona 1:1 (V/V). Además, Suchan et al. (2004) comprobaron que la eficiencia del método ASE es igual que la del Soxhlet en cuanto a compuestos altamente clorados como lo son algunos congéneres de PCBs (No. 101, 118, 138, 153, 180) y p,p-DDE, p,p-DDD y p,p-DDT.

En otros estudios con ASE como en el de Haib et al. (2003), que analizaron pOCs en tabaco, se obtuvieron recuperaciones para el HCH-γ de 99%, 105% y 116%, utilizando acetona como solvente de extracción y las condiciones del equipo fueron 100°C, 10 MPa con 3 ciclos de extracción. Sin embargo, en una matriz completamente diferente. Saito et al (2004) analizaron pOCs en diferentes tejidos (corazón, riñón, hígado y tejido adiposo), utilizando como solvente de extracción la mezcla de diclorometano/acetona (1:1), a 100°C y 1500 psi. Estos autores realizaron dos extracciones por cada muestra, aun así, obtuvieron una baja recuperación para el HCH-γ (63.4% en el hígado) por lo que estas condiciones tampoco favorecen la recuperación del compuesto. Por su parte, Suchan et al. (2004) realizaron una prueba con la mezclas de solventes hexano/diclorometano (1:1) y hexano/acetona (4:1) utilizando músculo de pez; con ambas mezclas se obtuvo un buen porcentaje de eficiencia relativa de la extracción para todos los pOCs incluyendo el compuesto HCH-γ, bajo condiciones de 100°C, 10 MPa y realizando dos ciclos de extracción. Estos autores mencionan que existen diferencias significativas entre la extracción con un solo ciclo y con dos ciclos, por lo que recomiendan aumentar el número de ciclos a tres para obtener la mayor recuperación para todos los compuestos.

Varias razones justifican que en la actualidad se desarrollen técnicas modernas como ASE, para dejar de lado técnicas clásicas como el Soxhlet. Entre estas podemos citar: a) La reducción de solventes, ya que la gran cantidad de solventes orgánicos que se consumen en una técnica como lo es el Soxhlet

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