UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
TESIS
PRESENTADO POR LA BACHILLER:
PAUCAR ORÉ, Fiorela Janett
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:
INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
Huancayo-Perú 2011
“EVALUACIÓN DE LA ESTABILIDAD DE LOS TANINOS DE EXTRACTOS DE TARA -Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze-
BAJO DIFERENTES CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO”
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
“EVALUACIÓN DE LA ESTABILIDAD DE LOS TANINOS DE EXTRACTOS DE TARA -Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze-
BAJO DIFERENTES CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO”
TESIS PARA OPTAR EL TITULO DE INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
JURADO EVALUADOR DE LA TESIS
PRESIDENTE JURADO
M. Sc. María Libia Gutierrez Gonzales Ing. Juan Ramos Gómez
JURADO JURADO
Mg. Sc.Hermes Amadeo Rosales Papa Mg. Sc.Norma Gamarra Mendoza
SECRETARIO Ing. José Luis Solis Rojas
3
PRESENTACIÓN
Decana de la Facultad de Ingeniería de Procesos: M. Sc. María Libia Gutierrez Gonzales
Sres. Miembros del Jurado:
Ing. Juan Ramos Gomez, M. Sc Hermes Amadeo Rosales Papa e Ing. M. Sc.
Norma Gamarra Mendoza.
Cumpliendo con las disposiciones de la Facultad de Ingeniería de Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional del Centro del Perú, expongo a consideración, el siguiente trabajo de Tesis titulado:
“EVALUACIÓN DE LA ESTABILIDAD DE LOS TANINOS DE EXTRACTOS DE TARA -Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze- BAJO
DIFERENTES CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO”
Que al ser evaluada me permitirá optar el Título Profesional de Ingeniera de Industrias Alimentarias.
Fiorela Janett Paucar Oré
Bachiller de Ingeniería en Industrias
Alimentarias
4
ASESOR:
M. Sc. Emilio Fredy Yábar Villanueva
5
DEDICATORIA
Esta tesis está dedicada a Dios, quien ha sido mi guía, me da la felicidad de vivir y siempre está presente en todo momento de mi vida.
A mis padres; a mi mamita por estar siempre a mi lado escuchándome, aconsejándome y a mi papi por siempre confiar en mí, dedico a ellos por su constante apoyo y amor incondicional, gracias por todas sus enseñanzas, ánimos, consejos son quienes me motivan hacer realidad mis logros profesionales. Los quiero!
A mi querido hermano Franns por tener siempre
la palabra justa y con mucho aliento para seguir
mis ideales. Te quiero mucho manito!
6
AGRADECIMIENTOS
Mis sinceros agradecimientos a mis patrocinadores Dr. David Campos Gutierrez por permitirme ingresar y ser parte del equipo de investigación IBT - UNALM para desarrollar este trabajo. Y Dra. Rosana Chirinos, por su constante orientación en toda la parte experimental y en todo el desarrollo de la tesis, por sus certeros consejos, sobre todo por mostrarme tanto interés, muchas gracias.
A mi asesor Ms. Sc. Fredy Yabar Villanueva quien me brindo las puertas y la oportunidad de realizar mi tesis fuera de la Universidad, siendo el nexo con el IBT- UNALM.
A los docentes miembros del jurado por su buena disposición en la corrección de la presente tesis. A los docentes de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la UNCP, que durante mi formación profesional me brindaron y supieron hacer llegar su experiencia y conocimiento.
A la CUD (Commmisión Universitaire pour le Dévelopment) de Bélgica quién a través del Proyecto PIC (Project Inyeruniversitaire Ciblé) 2009 – 2013 me brindó el apoyo financiero para la ejecución de la presente investigación.
7 INDICE GENERAL
RESUMEN 01
I. INTRODUCCIÓN 03
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 05
2.1. La Tara (Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze) 05
2.1.1. Origen 05
2.1.2. Características botánicas y taxonomía 05
2.1.3. Distribución geográfica 06
2.2. Los compuestos fenólicos 08
2.2.1. Clasificación de los compuestos fenólicos 09
2.3. Los taninos 12
2.3.1. Generalidades 12
2.3.2. Clasificación de los taninos 13
a. Taninos hidrolizables 14
a.1. Los galotaninos 15
a.2. Elagitaninos 17
b. Taninos condensados 17
2.3.3. Hidrólisis de los taninos 18
2.4. Los taninos de la tara 18
2.5. Los compuestos fenólicos antioxidantes 19
2.6. Factores que afectan la estabilidad de los antioxidantes fenólicos 20
2.6.1. pH 20
2.6.2. Temperatura 21
2.6.3. Oxígeno 21
III. MATERIALES Y MÉTODOS 22
3.1. Materia prima 22
3.2. Equipos e instrumentos analíticos 22
3.3. Reactivos 23
3.4. Material de vidrio 24
3.5. Otros 25
3.6. Métodos de análisis 25
3.6.1. Materia prima – Vainas de tara 25
a. Determinación de humedad y materia seca 25 3.6.2. Extractos de tara
8 a. Determinación de la capacidad antioxidante 26 b. Determinación de los compuestos fenólicos 26 c. Determinación de taninos hidrolizados del tipo
galotaninos 26
3.7. Metodología experimental 27
3.7.1. Obtención de la harina de tara 27
3.7.2. Obtención de los extractos de tara 28
3.8. Diseño del experimento 33
3.8.1. Evaluación del pH en la estabilidad de los extractos de tara 33 3.8.2. Evaluación de la presencia y ausencia de oxígeno en la
estabilidad de los extractos de tara 33
3.8.3. Evaluación de la temperatura en la estabilidad de los
extractos de tara 33
3.9. Análisis estadístico 34
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 36
4.1. Evaluación de la harina y de los extractos de tara 36 4.2. Evaluación de la estabilidad de los extractos de tara 38
4.2.1. Compuestos fenólicos 39
4.2.2. Capacidad antioxidante 49
4.2.3. Ácido gálico 61
V. CONCLUSIONES 72
VI. RECOMENDACIONES 74
VII. BIBLIOGRAFÍA 75
ANEXOS
9 INDICE DE CUADROS
Número Título Pág.
Cuadro 1 Especificaciones taxonómicas de la tara 07
Cuadro 2 Ocurrencia de las principales familias de los compuestos fenólicos.
09
Cuadro 3 Clases mayoritarias de compuestos fenólicos en plantas 11 Cuadro 4 Principales plantas que son fuentes de taninos 13
Cuadro 5 Diseño experimental 34
Cuadro 6 Caracterización de los extractos de tara liofilizados 36 Cuadro 7 Compuestos fenólicos (mg AGE/100 mL) del extracto entero de
tara bajo diferentes condiciones de almacenamiento
42
Cuadro 8 Compuestos fenólicos (mg AGE/100 mL) del extracto hidrolizado de tara bajo diferentes condiciones de almacenamiento
48
Cuadro 9 Capacidad antioxidante (µmol trolox/100 mL) del extracto entero de tara bajo diferentes condiciones de almacenamiento
53
Cuadro 10 Capacidad antioxidante (µmol trolox/100 mL) del extracto hidrolizado de tara bajo diferentes condiciones de almacenamiento
59
Cuadro 11 Ácido gálico (mg AGE/100 mL) del extracto entero de tara bajo diferentes condiciones de almacenamiento
64
Cuadro 12 Ácido gálico (mg AGE/100 mL) del extracto hidrolizado de tara bajo diferentes condiciones de almacenamiento
70
10 INDICE DE FIGURAS
Número Título Pág.
Figura 1 Identificación de las zonas productoras de tara 07
Figura 2 Compuesto fenólico simple (Fenol) 10
Figura 3 Estructura química de los principales ácidos fenólicos 11
Figura 4 Estructura básica de un flavonoide 13
Figura 5 Clasificación de los taninos 14
Figura 6 Estructura química de los ácidos gálico y elágico 15 Figura 7 Estructura química de β-1,2,3,4,6-Pentagaloil-O-
DGlucopiranosa.
16
Figura 8 Estructura química de los enlaces depsídicos en los galotaninos 18
Figura 9 Galotaninos de la tara 18
Figura 10 Diagrama de flujo para la obtención de la harina de tara 28 Figura 11 Diagrama de flujo para la obtención del extracto de tara sin
hidrólisis
31
Figura 12 Diagrama de flujo para la obtención del extracto hidrolizado de Tara
32
Figura 13 Evolución del contenido de compuestos fenólicos en el extracto entero de tara sometido a condiciones de presencia (a) y ausencia de oxígeno (b) y a diferentes niveles de pH y temperatura durante 60 días de almacenamiento
43
Figura 14 Evolución del contenido de compuestos fenólicos en el extracto hidrolizado de tara sometido a condiciones de presencia (a) y ausencia de oxígeno (b) y a diferentes niveles de pH y temperatura durante 60 días de almacenamiento
48
Figura 15 Evolución del contenido de la capacidad antioxidante en el extracto entero de tara sometido a condiciones de presencia (a) y ausencia de oxígeno (b) y a diferentes niveles de pH y temperatura durante 60 días de almacenamiento
54
Figura 16 Evolución del contenido de la capacidad antioxidante en el extracto hidrolizado de tara sometido a condiciones de presencia (a) y ausencia de oxígeno (b) y a diferentes niveles de pH y temperatura durante 60 días de almacenamiento
60
Figura 17 Evolución del ácido gálico en el extracto entero de tara sometido a condiciones de presencia (a) y ausencia de oxígeno (b) y a diferentes niveles de pH y temperatura durante 60 días de
65
11 almacenamiento
Figura 18 Evolución del ácido gálico en el extracto hidrolizado de tara sometido a condiciones de presencia (a) y ausencia de oxígeno (b) y a diferentes niveles de pH y temperatura durante 60 días de almacenamiento
71
12 INDICE DE ANEXOS
Número Título
Anexo I Tiempo de reacción para análisis de la actividad antirradical medida por el método del ABTS
Anexo II Curvas estándar desarrolladas
A. Curva estándar desarrollada para la determinación de la capacidad antioxidante ABTS
B. Curva estándar desarrollada de compuestos fenólicos totales C. Curva estándar desarrollada del ácido gálico por el método de
rodhanina
Anexo III Fundamento para desarrollo del Diseño experimental A. Preparación del buffer citrato – fosfato
Anexo IV Análisis estadístico
A. Análisis de variancia de compuestos fenólicos B. Análisis de variancia de la capacidad antioxidante C. Análisis de variancia del ácido gálico
D. Análisis de variancia y de comparación múltiple
D.1. Extracto entero en ausencia de oxígeno a 4ºC y pH 3 D.2. Extracto entero en ausencia de oxígeno a 4ºC y pH 5 D.3. Extracto entero en ausencia de oxígeno a 4ºC y pH 7 D.4. Extracto entero en ausencia de oxígeno a 25ºC y pH 3 D.5. Extracto entero en ausencia de oxígeno a 25ºC y pH 5 D.6. Extracto entero en ausencia de oxígeno a 25ºC y pH 7 D.7. Extracto entero en presencia de oxígeno a 4ºC y pH 3 D.8. Extracto entero en presencia de oxígeno a 4ºC y pH 5 D.9. Extracto entero en presencia de oxígeno a 4ºC y pH 7 D.10. Extracto entero en presencia de oxígeno a 4ºC y pH 3 D.11. Extracto entero en presencia de oxígeno a 4ºC y pH 5 D.12. Extracto entero en presencia de oxígeno a 4ºC y pH 7 D.13. Extracto hidrolizado en ausencia de oxígeno a 4ºC y pH 3 D.14. Extracto hidrolizado en ausencia de oxígeno a 4ºC y pH 5 D.15. Extracto hidrolizado en ausencia de oxígeno a 4ºC y pH 7 D.16. Extracto hidrolizado en ausencia de oxígeno a 25ºC y pH 3 D.17. Extracto hidrolizado en ausencia de oxígeno a 25ºC y pH 5 D.18. Extracto hidrolizado en ausencia de oxígeno a 25ºC y pH 7 D.19. Extracto hidrolizado en presencia de oxígeno a 4ºC y pH 3
13 D.20. Extracto hidrolizado en presencia de oxígeno a 4ºC y pH 5 D.21. Extracto hidrolizado en presencia de oxígeno a 4ºC y pH 7 D.22. Extracto hidrolizado en presencia de oxígeno a 4ºC y pH 3 D.23. Extracto hidrolizado en presencia de oxígeno a 4ºC y pH 5 D.24. Extracto hidrolizado en presencia de oxígeno a 4ºC y pH 7 D.25. Extracto entero a 0 días de almacenamiento
D.26. Extracto entero a 20 días de almacenamiento D.27. Extracto entero a 40 días de almacenamiento D.28. Extracto entero a 60 días de almacenamiento D.29. Extracto hidrolizado a 0 días de almacenamiento D.30. Extracto hidrolizado a 20 días de almacenamiento D.31. Extracto hidrolizado a 40 días de almacenamiento D.32. Extracto hidrolizado a 60 días de almacenamiento Anexo V Reporte de los resultados obtenidos con sus repeticiones
1 RESUMEN
La presente investigación tuvo como finalidad evaluar la estabilidad de extractos fenólicos obtenidos a partir de la harina de tara - Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze - frente a las siguientes condiciones de almacenamiento: presencia y ausencia de oxígeno, temperaturas de 4 y 25°C y a diferentes niveles de pH: 3, 5 y 7, por un periodo de 60 días. Dos fueron los extractos de tara evaluados: un extracto obtenido por una extracción directa realizada en la harina de tara, el que fue denominado extracto sin hidrólisis (EE) y un extracto hidrolizado (EH9h) obtenido a partir del EE que fue sometido a hidrólisis química de 9 horas con H2SO4 a una concentración de 2N a 100 ºC. El EE presentó un alto contenido de galotaninos(
77.5%), mientras que el EH9h se caracterizó por su mayor contenido en ácido gálico (81.9%).En general se observó una disminución en el contenido de compuestos fenólicos y capacidad antioxidante durante el curso del almacenamiento para los dos extractos evaluados. Así al término de los 60 días de almacenamiento se encontró que el nivel pH de 7, la temperatura de 25°C y la presencia de oxígeno resultaron ser las condiciones que más influyeron en la pérdida de los compuestos fenólicos y capacidad antioxidante del EE y el EH9h, (48.0 y 77.9% y, 59.2 y 84.1% respectivamente) y la ausencia de oxígeno redujo considerablemente la degradación de estas características para ambos extractos.
El ácido gálico presentó tanto incrementos como disminuciones durante el desarrollo del almacenamiento para los EE y EH9h. A los 60 días de almacenamiento el EE presentó los mas altos incrementos en ácido gálico bajo las condiciones temperatura de 25ºC, pH 5 , tanto en ausencia como de presencia de oxígeno (232.2 y 457.7%); mientras que para la EH9h ello se dio bajo presencia de oxígeno, a la temperatura de 25ºC, a pH 3 (25.9%) y bajo la ausencia de oxígeno, temperatura de 4ºC y pH 5 (14.4%). Los decrementos del ácido gálico se presentaron bajo presencia
2 de oxígeno a pH de 7 y 25°C tanto como para el EE y el EH9h (35 y 93.1%
respectivamente).
I. INTRODUCCION
Algunas de las causas más importantes que motiva a evaluar tecnologías alternativas para la industrialización de productos naturales en la industria de alimentos son: sus posibilidades económicas de exportación y la ventaja de poseer productos tradicionales y no tradicionales que por sus características especiales pueden constituir una fuente potencial de industrialización.
La tara -Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze- es una leguminosa nativa (Garro et al., 1997) de amplio uso en la medicina tradicional del Perú (Bussmann y Sharon, 2006; De-la-Cruz et al., 2007; PROMPERÚ, 2008). Estudios fitoquímicos han revelado que las vainas de la Caesalpinia spinosa son ricas en taninos del tipo galotaninos, los cuales han sido caracterizados en una reciente investigación (Clifford y Bouchet , 2007).
Los taninos son compuestos fenólicos de peso molecular relativamente alto (Hagerman, 1998). Dentro de éstos se encuentran a los galotaninos (taninos hidrolizables), los cuales pueden ser desdoblados en un poliol (ácido quínico) y varias unidades de ácido gálico mediante una hidrólisis ácida, alcalina o mediante enzimas hidrolíticas (tanasa). El ácido gálico y sus derivados poseen una pronunciada actividad antioxidante (Wang et al., 2007), también los galotaninos han demostrado poseer diversos efectos en sistemas biológicos actuando como potenciales queladores de metales, agentes precipitantes de proteínas y antioxidantes biológicos (Hagerman, 1998). La actividad antioxidante de los galotaninos a partir de diversas fuentes ha sido evaluada por diversos autores (Masaki et al., 1994; Zhao et al., 2005; Moore et al., 2005; Kosar et al., 2007; Wang et al., 2007; Tian et al., 2009). De otro lado, Lim y Murtijaya (2007) observaron que diferentes grados de hidrólisis de taninos resultan en
3 una variación de su actividad antioxidante, debido a que poseen estructuras químicas diferentes (Salminen et al., 2002). En un estudio realizado por Chambi (2008) se encontró que extractos de tara hidrolizados químicamente por 9 horas presentaron una alta capacidad antioxidante para evitar la oxidación del aceite de soya, del mismo modo Arbizu (2011) evaluó el mismo extracto de tara hidrolizado frente a la inhibición de la oxidación lipídica de carne de cerdo encontrando resultados positivos.
Los antioxidantes empleados para evitar la oxidación de los alimentos pueden ser: sintéticos y naturales. Entre los antioxidantes sintéticos se encuentran a los ésteres del ácido gálico, butil-hidroxitolueno (BHT), butil-hidroxianisol (BHA) y el terbutilhidroxiquinona (TBHQ). Sin embargo el uso de estos antioxidantes ha sido cuestionado debido a su potencial riesgo a la salud, ellos pueden ser responsables de cáncer y carcinogénesis. De otro lado Perchellet et al. (1992), han reportado resultados sobre la actividad antimutagénica y anti carcinógena de los fenoles y de los compuestos tánicos (antioxidantes) obtenidos a partir de plantas naturales, confirmando sus habilidades de inhibir los efectos bioquímicos y biológicos en la promoción de tumoraciones.
Dada la importancia que reciben los compuestos fenólicos como agentes antioxidantes el día de hoy, se hace necesario evaluar su estabilidad bajo diferentes condiciones de aplicación y almacenamiento, con la finalidad de obtener información sobre su posible uso en diferentes alimentos. Así, el objetivo principal de la presente investigación fue evaluar la estabilidad de los extractos de tara (sin hidrólisis e hidrolizado por 9 horas) bajo diferentes condiciones de pH, temperatura y presencia de oxígeno; así como también de caracterizar los extractos de tara.
4 II. REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1. La Tara -Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze- 2.1.1. Origen
La tara, según Lapa (2004), es conocida como «Taya», es una planta originaria del Perú utilizada desde la época prehispánica en la medicina folclórica o popular y en años recientes, como materia prima en el mercado mundial de hidrocoloides alimenticios.
La tara es producida en varias zonas del país, siendo cultivada en terrenos situados entre los 1000 y 2900 msnm, siendo sus principales productores los departamentos de: Cajamarca, La Libertad, Ayacucho, Huancavelica, Apurímac, Ancash y Huánuco, además de Junín (Lapa, 2004).
2.1.2. Características botánicas y taxonomía
Es un árbol pequeño, de dos a tres metros de altura. De fuste corto, cilíndrico y a veces tortuoso, y su tronco está provisto de una corteza gris espinosa, con ramillas densamente pobladas. En muchos casos las ramas se inician desde la base dando la impresión de varios tallos. La copa de la tara es irregular, aparasolada y poco densa, con ramas ascendentes (Lapa, 2004).
Sus hojas son en forma de plumas, parcadas ovoides y brillante ligeramente espinosa de color verde oscuro y miden 1.5 cm de largo. Sus flores son de color amarillo rojizo, dispuestos en racimos de 8 cm a 15 cm de largo. Sus frutos son vainas explanadas e indehiscentes de color naranja de 8 cm a 10 cm de largo y 2 cm de ancho aproximadamente de color naranja-rojizo (Villanueva, 2007), que contienen de 4
5 a 7 granos de semilla redondeada de 0.6 cm a 0.7 cm de diámetro y son de color pardo negruzco cuando están maduros (Lapa, 2004).
Su Inflorescencia se presenta con racimos terminales de 15 a 20 cm. de longitud de flores ubicadas en la mitad distal, flores hermafroditas, zigomorfas, cáliz irregular provisto de un sépalo muy largo de alrededor de 1 cm, con numerosos apéndices en el borde, cóncavo, corola con pétalos libres de color amarillento, dispuestas en racimos de 8 a 20 cm de largo, con pedúnculos pubescentes de 56 cm de largo, articulado debajo de un cáliz corto y tubular de 6 cm de longitud; los pétalos son aproximadamente dos veces más grandes que los estambres (Villanueva, 2007).
Cada árbol de Tara puede rendir un promedio de 20 kg a 40 kg de vaina cosechándolos dos veces al año. Generalmente, un árbol de Tara da frutos a los tres años; y si es silvestre, a los cuatro años. Su promedio de vida es de cien años y el área que ocupa cada árbol es de 10 m2 (Lapa, 2004).
En el Cuadro 1 podemos observar las especificaciones taxonómicas de la tara.
2.1.3. Distribución geográfica
El cultivo de la tara se distribuye entre los 4º y 32º S, abarcando diversas zonas áridas, en Venezuela, Colombia, Ecuador, Perú, Bolivia hasta el norte de Chile. En el Perú se distribuye en casi toda la costa, desde Piura hasta Tacna, y en algunos departamentos de la sierra como los valles interandinos de Ancash, Apurímac, Arequipa, Ayacucho, Cajamarca, Huancavelica, Huánuco y Junín (FAO, 1998), como se puede visualizar en la figura 1.
En la vertiente del Pacífico se halla en los flancos occidentales, valles, laderas, riberas de los ríos, y lomas entre los 800 y 2800 msnm; llegando en algunos casos como en los valles de Apurímac, hasta los 3150 msnm. De acuerdo al Mapa Forestal del Perú, la tara se encuentra ocupando el estrato del matorral arbustivo, en donde se asocia con especies como: Capparis prisca (Palillo), Salís humboldtiana (Sauce), Schinus molle (Molle), Puya sp., Acacia sp. y algunas gramíneas (Lapa, 2004). Las
6 características agroclimáticas especiales de algunos microclimas de la vertiente occidental de los andes y de los valles interandinos hace que les confiera al fruto uno de los más altos contenidos de taninos (Villanueva, 2007).
Cuadro 1. Especificaciones taxonómicas de la tara NOMBRE
CIENTÍFICO Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze1
NOMBRE COMÚN1,2
“Tara”, “taylin”, “taya”, “talla”, “chalchalagua” (Perú); "divi divi de tierra fría", "guarango", "cuica", "serrano", "tara" (Colombia);
“vinillo", "guarango", “campeche" (Ecuador); "tara" (Bolivia, Chile, Venezuela), "Acacia amarilla", Dividivi de los Andes" (Europa);
Spiny holdback.
SINÓNIMOS BOTÁNICOS2
- Caesalpinia tinctoria (HBK) Bentham ex Reiche - Poinciana spinosa Molina
- Caesalpinia pectinata Cavanilles - Coulteria tinctoria HBK
- Taya spinosa (Molina) Britt y Rose - Caesalpinia stipulata (Sandwith) J.F.
FAMILIA2 Caesalpinaceae (Leguminosae: Caesalpinoideae): Árboles y arbustos de hojas alternas simples o compuestas, pinnadas o bipinnadas, estipuladas. Flores irregulares, normalmente 5 pétalos unidos en la base y 10 estambres. Fruto generalmente en legumbre.
ETIMOLOGÍA3 Caesalpinia, en honor de Andrea Caesalpini (1524-1603), botánico y filósofo italiano. Spinosa, del latín Spinosus-a-um, con espinas.
Tara proviene del aimara y significa “Achatada” o “Aplanada”, por la forma de la semilla
Fuente: (1) Lapa (2004), (2) Villanueva (2007) y (3) PROMPERÚ (2008).
7 Figura 1. Identificación de las zonas productoras de tara
Fuente: Lapa (2004), Villanueva (2007) y PROMPERÚ (2008).
2.2. Los compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos o polifenoles constituyen un amplio grupo de sustancias químicas, considerados metabolitos secundarios de las plantas, con diferentes estructuras químicas y actividad, englobando más de 8 000 compuestos distintos. La forma más frecuente es la de polímeros o lignina insoluble. Químicamente los compuestos fenólicos son sustancias químicas que poseen un anillo aromático, un anillo benceno, con uno o más grupos hidroxilos incluyendo funcionales. Se presentan en las plantas en forma conjugada con uno o más residuos de azúcar unidos a los grupos hidroxilos, aunque en algunos casos se pueden producir uniones directas entre la molécula de azúcar y un carbono aromático (Martínez-Valverde et al., 2000). En el Cuadro 2, se presenta a los compuestos fenólicos asociados a algunas especies vegetales donde se presentan en abundancia.
Leyenda:
02 Ancash 03 Apurímac 04 Arequipa 05 Ayacucho 06 Cajamarca 09 Huancavelica 10 Huánuco 11 Ica 12 Junín 13 La Libertad 14 Lambayeque 16 Lima
19 Moquegua 21 Piura 24 Tacna
8 Kahkönen et al. (1999), indican que los compuestos fenólicos son comúnmente encontrados en plantas comestibles y no comestibles y ellos tienen múltiples efectos biológicos y actividad antioxidante. Los extractos crudos de frutas, hierbas, vegetales, cereales y otros tejidos de plantas ricos en fenoles son cada vez más de interés en la industria de alimentos dado las propiedades antioxidantes que presentan.
Cuadro 2. Ocurrencia de las principales familias de los compuestos fenólicos
Familia Clase Fuente alimentaria
Ácidos fenólicos
Ácidos hidroxicinnamicos
Arvejas, zanahoria, cereales, cerezas, frutas cítricas, granos oleaginosos, ciruelas, tomates.
Ácidos hidroxibenzoicos
Cereales, granos oleaginosos.
Flavonoides
Antocianinas Cereales, uvas, fresas.
Flavan-3-ols Manzanas, uvas, cebollas.
Flavanonoles Uvas.
Flavanonas Frutas cítricas
Flavanoles Manzanas, poros, cebollas, olivas, tomates, pimientos.
Flavonas Frutas cítricas, perejil, culantro, espinaca.
Isoflavona Soya.
Taninos Condensados Manzana, uva, peras, ciruelas.
Hidrolizables Granadas, frambuesa.
Estilbenos Uvas.
Lignanos Lino, sésamo, trigo.
Fuente: Nijveldt et al. (2001) y (Naczk y Shahidi (2006)
2.2.1. Clasificación de los compuestos fenólicos
La expresión “compuestos fenólicos” embarga un considerable rango de sustancias que poseen un anillo aromático con uno o varios niveles de hidroxilación o metoxilación. Sus estructuras tienen un rango desde moléculas fenólicas simples como el fenol (figura 2) hasta polímeros complejos de alto peso molecular (Balasundram et al., 2006), como las proantocianinas (Santos y Scalbert, 2000).
9
HO
Figura 2. Compuesto fenólico simple (Fenol) Fuente: Balasundram et al. (2006)
Estos compuestos se dividen, en su mayoría, en tres grandes grupos basado en su estructura y tamaño, éstos son: los ácidos fenólicos, los flavonoides y los taninos. Los ácidos fenólicos son derivados de los ácidos benzoico y cinámico (Marinova y Yanishlieva, 2003) (figura 3); los flavonoides son compuestos de bajo peso molecular que comparten un esqueleto común de difenilpiranos (C6-C3-C6), compuesto por dos anillos de fenilos (A y B) ligados a través de un anillo C de pirano (heterocíclico), los que se observan en la figura 4 (Martínez et al., 2002).
COOH R1
R2
R3
COOH
R4
R3
R2 R1
Ácidos benzoicos Ácidos cinámicos
Ácido R1 R2 R3 Ácido R1 R2 R3 R4
Gálico OH OH OH Ferúlico H H OH OCH3
Protocatecuico H OH OH p - cumárico
H H OH H
Vaníllico H OH OCH3 Caféico H H OH OH
Siríngico OCH3 OH OCH3 Sinápico H OCH3 OH OCH3
Figura 3. Estructura química de los principales ácidos fenólicos Fuente: Marinova y Yanishlieva (2003)
10 La mayoría de las clases más amplias de compuestos fenólicos son listados en el Cuadro 3, de acuerdo con el número de carbonos presentes en su estructura (Harborne, 1980).
O
A B
C
Figura 4. Estructura básica de un flavonoide Fuente: Martínez et al. (2002)
Cuadro 3. Clases mayoritarias de compuestos fenólicos en plantas
Número de átomos de carbono
Estructura básica
Clase Ejemplos
6 C6 Fenoles simples
Benzoquinonas
Catecol, hidroquinona, 2,6- dimetilhidroxoquinona 7 C6-C1 Ácidos fenólicos Àcido gálico, salicílico
8 C6-C2 Acetofenonas
Derivados de la tirosina
Ácidos fenilacéticos
3-Acetyl-6-methoxybenzaldehido Tirosol
p-Hidroxifenilacetico
9 C6-C3 Ácidos
hidroxicinámicos Fenilpropenos Cumarinas Isocumarinas Cromones
Ácido cafeico, ácido ferúlico Mirecitina, eugenol
Umbeliferona, aesculetin Eugenin
10 C6-C4 Naftoquinonas Juglone, plumbagin
13 C6-C1-C6 Xantonas Magniferin
14 C6-C2-C6 Estilbenos
Antroquinonas
Resveratrol Emodin
15 C6-C3-C6 Flavonoides
Isoflavonoides
Quercetina Genistein
18 (C6-C3)2 Lignanos
Neolignanos
Pinoresinol
30 (C6-C3-C6)2 Biflavonoides Amentoflavona
N (C6-C3)n
(C6)n (C6-C3-C6)n
Ligninas Taninos
Fuente: Harborne (1980)
11 Muchas de las funciones biológicas, como la antimutagenecidad, función anticancerígena y el antienvejecimiento entre otras, tienen su origen en la capacidad antioxidante atribuida a los polifenoles (Martinez – Valverde et al., 2000). Las investigaciones recientes en cuanto a los compuestos fenólicos se han focalizado en sus características benéficas como propiedades bioactivas. Ellos protegen a las plantas en contra del daño oxidativo y contribuyen a la actividad antioxidante. Se conoce que los compuestos fenólicos poseen actividad antioxidante, antibacterial, antiviral, antimutagénica y carcinogénicas (Moure et al., 2001).
2.3. Los taninos 2.3.1. Generalidades
Hagerman y Butter (1978) mencionan que en los últimos años el estudio cromatográfico de los taninos ha ayudado a descubrir su heterogeneidad en extractos procedente de diferentes fuentes, y también en algunos casos ha permitido comprobar la presencia en estas fuentes de pequeñas cantidades de fenoles simples. Este último descubrimiento de gran importancia, ha contribuido a consolidar la teoría que indica que los taninos están formados por simples fenoles, los cuales al polimerizarse dan lugar a compuestos distintos y complicados.
Según Haslam y Lilley, (1988); Bhat et al. (1998) y Cannas (2002) los taninos son compuestos hidrosolubles de origen vegetal, cuyo peso molecular varía de 500 a más de 20000 u.m.a. y presentan la capacidad de precipitar proteínas. Hagerman (1988) menciona que los taninos son compuestos fenólicos de peso molecular relativamente alto que poseen grupos hidroxilos y carbonilos los cuales les permiten formar complejos con proteínas y otras macromoléculas (Halvorson y Gonzales, 2007).
Dentro de este grupo de se encuentran a los galotaninos que pertenecen a la familia de los taninos hidrolizables, los que pueden ser desdoblados en un poliol y ácido gálico mediante una hidrólisis ácida, alcalina o enzimática (tanasas). El ácido gálico y sus derivados poseen una pronunciada actividad antioxidante (Sohi et al., 2003; Lu et
12 al., 2006; Wang et al., 2007). Los taninos están presentes en diferentes plantas tal como se presenta en el Cuadro 4.
Cuadro 4. Principales plantas que son fuentes de taninos
Familia Género Especie (nombre vulgar)
Anacardiáceas Rhus Zumaque
Sinopsis Quebracho
Betulaceas Betuna Abedules
Combretaceas Laguncularia Mirabolano
Coriaceas Coriacia Roldo o emborrachacabras
Fagaceas Castanea Castañas
Quercus Robles, Valonea, Encina, Alcornoque.
Leguminosa Acacia Mimosa y otros
Cassia
Robinea Falsas acacias
Caesalpinea Tara, Divi-divi, Algarrobina
Myrtaceas Eucalyptus
Pinaceas Pinus,Abies,Picea,Tsuga, Sequeia.
Rhizophoraceas Ceritos
Rhizopora Mangoyo
Saliaceas Saliz Sauces
Fuente: Cacho (1974)
2.3.2. Clasificación de los taninos
Basado en su estructura molecular, los taninos son divididos en dos grupos: los taninos hidrolizables y los condensados, siendo esta clasificación la más actualizada y acertada (Singh et al., 2001) ver en la figura 5.
13 Figura 5. Clasificación de los taninos
Fuentes: OmniChem (2007)1; Isaza (2007)2 y Carretero (2000)3
a. Taninos hidrolizables
Estos taninos son también llamados gálicos o pirogálicos. Son derivados del ácido gálico (ácido 3, 4, 5-trihidroxil benzoico). El ácido gálico se encuentra esterificado a un poliol central y los grupos galiol están esterificados o ligados por oxidación para rendir más taninos hidrolizables (Hagerman, 2002), donde los radicales hidroxilo pueden estar parcialmente o totalmente esterificados con grupos fenólicos para formar taninos hidrolizables más complejos.
Estos taninos, como su denominación indica, se hidrolizan con facilidad tanto por ácidos y álcalis como por vía enzimática y son generalmente de formación patológica. Se localizan en algunas dicotiledóneas, especialmente en Fagaceae, Anacardiaceae y Leguminosae. Se encuentran en este grupo a los taninos gálicos o galotaninos, estos presentan al ácido gálico esterificados con un poliol (generalmente la glucosa) y esta estructura base a la vez se encuentra ligada a varias moléculas de
Taninos
Taninos Hidrolizables1 Taninos Condensados (Catequinas o proantocianidinas)1
Galotaninos (base ácido gálico)
Elagitaninos (base ácido elágico)
Base glucosa (Agallas, Sumac) Base ácido
Quínico
Geraniin2
Nogal3
Quebracho
Semillas y piel de uva
14 ácido gálico. También se encuentra a los taninos elágicos, o elagitaninos, que también presentan esterificaciones pero en este caso con el ácido hexahidroxidifénico. En la Figura 6 se presentan a las estructuras del ácido gálico y elágico (Siccha, 1993).
O
O
HO OH
HO
OH O
O
Ácido elágico
COOH HO
HO HO
Ácido gálico
Figura 6. Estructura química de los ácidos gálico y elágico Fuente: García (2005)
Las vainas de tara contienen taninos hidrolizables (del tipo galotaninos) en un rango de 40% a 60% dependiendo de las condiciones ecológicas en las que vegeta, la hidrólisis de estos taninos conduce a la separación del ácido gálico; asimismo se ha aislado al galato de etilo y cuatro galatos del ácido quínico correspondiendo a los ésteres metílicos de 4,5-di-O-galoilquínico y de 3,4,5-tri-O-galoilquínico, y a los ácidos 3,4-di-O- galoilquínico y 3,4,5-tri-O-galoilquínico (Siccha, 1993).
a.1. Los galotaninos
Los taninos hidrolizables más simples, los galotaninos, son simples ésteres digaloílicos de glucosa (poligaliol de glucosa). El típico galotanino es la pentagaloilglucosa (PGG) (β-1,2,3,4,6-Pentagaloil-O-DGlucopiranosa). El PGG tiene 5 enlaces ésteres idénticos que comprende grupos alifáticos hidroxilo en un centro de glucosa (figura 7) (Hagerman, 2002).
15
O
O O
O OH
OH OH O
OH OH
OH O
O
O
O OH
OH OH
O
OH OH HO
O
OH HO OH
Figura 7. Estructura química de β-1,2,3,4,6-Pentagaloil-O-DGlucopiranosa.
Fuente: Hagerman (2002)
Los ácidos gálicos se pueden unir a la pentagaloilglucosa, por medio de enlaces depsídicos, los que pueden ser enlaces meta- o para-depsídicos (Figura 8), involucrando el grupo hidroxilo del ácido gálico en lugar del grupo hidroxilo alifático. La hidrólisis de los galotaninos rinde al ácido gálico y el poliol central. Se puede usar un ácido fuerte y calor para romper los enlaces éster y depsídicos del galotanino. Para muchos galotaninos, el poliol central es la glucosa, sin embargo otros polioles centrales en los galotaninos incluyen al glucitol, hamamelosa (derivada de la ribosa), ácido sikimico, ácido quínico (este es el caso del galotanino de la tara) y quercitol (Hagerman, 2002).
Los galotaninos pueden obtenerse de las agallas que se forman en las ramas de diferentes especies de Quercus (por ejemplo, Q. infectoria y Q. linnaeí) y también comprenden a los taninos del Alepo. Pueden obtenerse también a partir de hojas de diversas especies de zumaque (por ejemplo, Rhus coriaria, R. glabra y R. typhina);
éstos comprenden al zumaque de América y de Sicilia. Otra fuente de galotaninos hidrolizables la constituyen las vainas de tara (Caesalpinia spinosa) (FAO y OMS, 1970).
16
O
OH OH HO
O OH
OH O
GOG = Ester digaloil Enlace para-depsídico O
OH OH O
O
OH OH OH
GOG = Ester digaloil Enlace meta-depsídico
Figura 8. Estructura química de los enlaces depsídicos en los galotaninos Fuente: Hagerman (2002)
Las agallas de roble son formaciones patológicas, excrecencias que se originan por la puesta de huevos de un insecto (Cynips gallae tinctoriae) sobre los brotes jóvenes de los robles. El insecto se desarrolla en el interior provocando una proliferación celular que da lugar a la agalla y sale practicando un orificio en la agalla madura. En su composición química como componente mayoritario destacan los taninos hidrolizables (50- 70% en Q. infectoria). Las agallas de roble constituyen una droga clásica, conocida y utilizada desde la antigüedad, de ellas se obtiene el tanino oficinal, llamado también ácido tánico o tanino al éter (Carretero, 2000).
Los galotaninos poseen los pesos moleculares de todos estos isómeros son iguales, pero las propiedades químicas (como la susceptibilidad para hidrolizar y el proceso cromatográfico de separación), y las propiedades bioquímicas (como la habilidad para precipitar proteínas) son dependientes de su estructura (Hagerman, 2002).
a.2. Elagitaninos
Los elagitaninos son simples ésteres del ácido hexahidroxidifenico (AHDP).
Llamados taninos complejos, más o menos modificados, resultan de la unión de un derivado fenilcrománico sobre un éster de glucosa con el ácido hexahidroxidifénico
17 (Carretero, 2000), el mismo que se forma por acoplamiento oxidativo de dos moléculas de ácido gálico (Hagerman, 2002).
b. Taninos condensados
Son más abundantes en el reino vegetal que los taninos hidrolizables. Son oligómeros o polímeros de unidades flavonoides, unidas por ligaciones carbono- carbono; estas estructuras no contienen residuos de carbohidratos (Cannas, 2002;
Hagerman, 2002). Se conocen también como no hidrolizables, ya que se hidrolizan con dificultad y, por el contrario, el tratamiento con calor y ácidos minerales origina polímeros de alto peso molecular (flobáfenos). Este tipo de taninos se producen en el metabolismo normal de los vegetales por lo que se consideran fisiológicos y se encuentran ampliamente repartidos en el reino vegetal (Harborne, 1980). Inicialmente fueron llamadas leucoantocianinas, ellos existen como oligómeros solubles, con 2 a 6 núcleos fenólicos del tipo flavan-3-ol, o como polímeros insolubles (Isaza, 2007).
2.3.3. Hidrólisis de los taninos
En los galotaninos, los enlaces depsídicos son más fácilmente hidrolizables que los enlaces éster entre el ácido quínico o glucosa y el ácido gálico. Así puede ocurrir una metanólisis en un medio débilmente acidulado y en presencia de metanol, rompiéndose los enlaces depsídicos pero no los enlaces éster.
Sin embargo un tratamiento con un ácido fuerte y calentamiento puede producir hidrólisis de ambos enlaces, convirtiendo los galotaninos en ácido gálico y su correspondiente poliol (azúcar o ácido quínico) (Lu et al., 2008) para llegar a hidrolizar toda la molécula de los galotaninos por una hidrólisis ácida es necesario tener condiciones de concentración de ácidos fuertes como 2 N, lo que es reportado por (Hagerman,1988) y la hidrólisis se lleva a cabo por 26 horas.
18 2.4. Los taninos de la tara
Las vainas de esta especie tienen una cantidad importante de taninos hidrolizables derivados del ácido gálico (Garro et al., 1997). Fennema (1993) describe al ácido gálico como un ácido fenólico que manifiesta una considerable actividad antioxidante. El ácido gálico es un polvo blanco amarillento, soluble en alcohol etílico, alcohol metílico, acetato de etilo y agua, y es insoluble en cloroformo y benceno.
Cristaliza en metanol formando cristales en forma de agujas. Los galotaninos de las vainas de tara (figura 9) tienen el peso molecular comparable al de los galotaninos de alepo, entre 900 y 955 Da (Fusi et al., 1997).
COOH HO
R1O
OR1 OR2
O
OH OH OH C
O
O OH OH
C O
OH OH OH C
R1 =
R2 =
n = 0, 1, 2 n tara
Ácido quínico R1 = R2 = H
Figura 9.Galotaninos de la tara Fuente: Garro et al. (1997)
Los taninos de las vainas de tara se componen esencialmente de los ésteres polidigaloílicos del ácido quínico (FAO, 1970). La estructura de los galotaninos de la tara fue detallada por Clifford y Bouchet (2007), en su trabajo se muestra que los galotaninos aislados fueron reconocidos como: ácido 4-galoil-5-(digaloil)quínico, ácido 5-galoil-4-(digaloil)quínico, ácido 3-(digaloil)-4,5-digaloilquínico, ácido 4-(digaloil)-3,5- digaloilquínico, ácido 5-(digaloil)-3,4-digaloilquínico, y ácido 1,3,4-trigaloilquínico.
19 Asimismo reportan como galotaninos de la tara al ácido 1,3-digaloilquínico y ácido 1,3,4-trigaloilquínico de naturaleza comparativamente hidrófila.
Los taninos de la tara pueden ser divididos en tres grupos: a) ácidos mono-, di-, tri- y tetra-galoilquínico, que no tienen enlaces depsídicos; b) despidos relacionados a la estructura 3,4,5-trigaloil, considerados como los mayores componentes de los taninos de tara y c) depsidos relacionados al ácido 1,3,4,5-tetragaloilquínico (Clifford y Bouchet, 2007, citados por Chambi, 2009). Las galoacilaciones o acilaciones de los galotaninos pueden ser de 10 hasta 11 residuos galoílo, caracterizados por la presencia de uno o más enlaces m-digaloil depsídicos; en el caso de la tara, se indica que se ha encontrado entre 5 y 8 residuos galoilo.
2.5. Los compuestos fenólicos antioxidantes
La oxidación puede inhibirse por varios métodos que incluyen impedir el acceso al oxígeno, el uso de temperaturas más bajas, la reducción de la presión de oxígeno y un empaquetado adecuado. Otro método de protección contra la oxidación es el uso de aditivos específicos que inhiben la reacción; la denominación correcta de estas sustancias es inhibidores de la oxidación, pero en la actualidad se les denomina principalmente antioxidantes (Pokorny, 2005). Los antioxidantes son sustancias que pueden retrasar el comienzo o reducir la velocidad de oxidación de las sustancias autooxidables. Existen cientos de compuestos, naturales y sintéticos, con propiedades antioxidantes; los principales antioxidantes liposolubles de naturaleza orgánica ordinariamente utilizados en los alimentos son los fenoles, monohídricos o polihídricos, con diversos sustituyentes en el anillo (Fennema, 2000).
Lekha y Lonsane (1997) y Basurto (2002) mencionan que la importancia industrial del ácido gálico radica en el amplio campo donde puede aplicarse, por ejemplo, es utilizado como antioxidante en la industria del aceite por contener el ácido gálico que evita la oxidación del aceite .
20 Los antioxidantes fenólicos pueden actuar como secuestrantes de los radicales, como quelantes de metales entre otros. Los productos intermediarios formados por la acción de los compuestos fenólicos son relativamente estables debido a la resonancia del anillo aromático. Kaur et al. (2002) indica que la actividad antioxidante de los compuestos fenólicos está dado principalmente por sus propiedades de oxido- reducción que les permite actuar como agentes reductores mediante la donación de un hidrógeno, quitando el oxígeno singulete y quelando metales. Esto les confiere una gran capacidad de captar radicales libres causantes del estrés oxidativo.
2.6. Factores que afectan la estabilidad de los antioxidantes fenólicos
La estabilidad de los compuestos fenólicos antioxidantes, tal es el caso de los taninos hidrolizables, deriva de considerar que los antioxidantes sufren cambios químicos en el almacenamiento y que sus soluciones llegan incluso a cristalizar lo que ocasiona una reducción de su poder. Bajo ciertas condiciones de pH, temperatura, nivel oxigeno se puede ver alterada su integridad y eficacia antioxidante.
2.6.1. pH
En general, los antioxidantes fenólicos tienen más carácter ácido que básico, por lo que son más compatibles en productos con pH menor de 7 (Badui, 1999; citado por Fernández, 2006). Los polifenoles son sensibles al pH y son en gran parte inestables en medio alcalino (Chethan, 2007).
2.6.2. Temperatura
Los taninos hidrolizables presentes en los extractos iniciales de kernels fueron degradados por altas temperaturas, causando incremento de los no taninos, contenido de fenólicos y ácido gálico, y consecuentemente incremento en la actividad antioxidante por el tratamiento térmico (Sveto et al., 2007).
Según Sosa (1982) citado por Fernández (2006) indica que los taninos pueden sufrir reacciones de oxidación, hidrólisis, polimerización, condensación o
21 descomposición y estas reacciones se aceleran con la elevación de la temperatura.
Igualmente Cacho (1974) afirma que todo tanino (incluido el de la tara) tiene en su constitución molecular grupos hidroxilo que les da el carácter fenólico y como tales son fácilmente oxidables bajo acciones de calentamiento especialmente cuando tienen hidroxilos en posición orto y para, también menciona que los productos tánicos son termolábiles y por lo tanto se producen degradaciones y oxidaciones.
2.6.3. Oxígeno
Yague (1969) citado por Cacho (1974) comprobó que los taninos cuando poseen la acidez natural no tienen gran tendencia a absorber oxígeno. También menciona que la absorción del oxígeno por el tanino se debe al carácter fenólico del mismo, siendo independiente del pH hasta tanto este no alcanza valores próximos a 9. Además se ha comprobado que los taninos, cuando tienen una acidez entre pH de 3 a 4, no absorben gran cantidad de oxígeno (Cacho, 1974).
22 III. MATERIALES Y MÉTODOS
El desarrollo experimental del presente estudio se realizó en el Instituto de Biotecnología, área de Biotecnología Industrial de la Universidad Nacional Agraria la Molina (IBT-UNALM).
3.1. Materia prima
Se trabajó con vainas de tara -Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze- en estado fresco procedentes del departamento de Junín, localidad de Viques. Las vainas de tara fueron secadas a 40ºC, llegando a alcanzar un 3 % de humedad, luego gueron pulverizadas, pasadas por una malla de 18 mesh y almacenadas a -20 ºC.
3.2. Equipos e instrumentos analíticos
Agitador de muestras - Heidolph Polymax 2040
Agitador magnético - Ceramic midi Polimax 2010 Ika
Balanza analítica (precisión 0,0001 g) - Ohaus Adventurer
Balanza analítica (precisión 0,00001 g) - Scientech
Balanza electrónica (precisión 0,1g) (Determinador de Humedad)- Portatil Sartorius
Baño maría - GFL
Bomba de vacío - Vacuumbrand
Campana extractora de gases
Centrífuga - Heltich Zentrifugen
Cocina eléctrica - TEBA
Congeladora horizontal - Electrolux H3000 Skin
Congeladora -80 ºC - Shin Deep Freezer
Destilador de agua - GFL 2001/4
Dispensador - Dinpensette Brand 1- 10 ml
23
Equipo para la purificación de agua - MilliQ Millipore
Espectrofotómetros -Génesis 20 y Génesis 10 UV Thermo
Estufa al vacío - Vwr
Estufa - Memmert
Estufa - Fravill
Liofilizador -Labconco
Licuadora - Osterizer USA
Potenciómetro 410 - Aplus Termoorion
Refrigeradoras - LG y GCA Corporation
Rotavapor - Laborota 4000 Heidolph
Selladora - Sealer KF – 3004
Ultrasonido - Ultrasonic Cleaners 3510 Brandson
Vortex - Mixer Wizard y Classic Velp
3.3. Reactivos
ABTS 2,2 Azino-bis (3 ethyl benzo - thializone-6-sulfonic acid) diamonnium salt 98% - Sigma Aldrich
Acetato de etilo - Fisher Scientific
Acetona - Fisher Scientific
Ácido cítrico monohidratado - Fermont
Ácido gálico - Sigma Aldrich
Ácido sulfúrico - Fermont
Agua destilada
Carbonato de sodio - Mallinckrodt
Etanol 96 % - Merck
Etil acetato - Merck
Folin Ciocalteau 2N - Sigma Aldrich
24
Fosfato disódico - Merck
Hidróxido de potasio - Mallinckrodt
Metanol 99,8% - Sigma Aldrich
Nitrógeno gaseoso - AGA
Persulfato de potasio - Mallin ckrodt
Rodanina (2-thio-4-ketothi azolidine) - Sigma Aldrich
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl chroman-2-carboxylic acid) - Sigma Aldrich
3.4. Material de vidrio
Balones de 250, 500 y 1000 mL
Baguetas
Campana de secado
Embudo de vidrio
Fiolas de 5, 10, 25, 50,100, 250, 500 y 1000 mL
Frascos ámbar de 10, 40, 100 y 500 mL
Matraces de 250,500 y 1000 mL
Matraz esmerilado 250 mL
Microbureta de 5 mL
Pera de decantación 500 mL
Pipetas de 5 , 10 mL
Placas petri
Probetas de 25, 50,100 y 500 mL
Termómetro Boeco Germany -10 a 250ºC
Tubos de ensayo de 5, 7, 15 con tapa
Tubos de ensayo de 25 mL
Tubos falcón de 15 y 50 mL
25
Vasos de precipitado de 10, 50, 100, 250 y 500 mL
3.5. Otros
Cronómetro
Filtros milipore 0,22 m
Gradillas
Jeringas
Magneto
Micropipetas Transperpette de 5 - 50,20-200 y 100 -1000 L con tips
Papeles filtro
Papel aluminio
Parafilm M Laboratory film
Picetas
Pinzas
Soporte universal
3.6. Métodos de análisis
Los métodos de análisis empleados en la presente investigación fueron:
3.6.1. Materia prima – Vainas de tara
a. Determinación de humedad y materia seca
Se empleó el método gravimétrico reportado por la A.O.A.C. (1990), se determinó la pérdida de peso de la muestra al colocarse en una estufa al vacío a 70ºC por un tiempo de 17 horas, hasta obtener un peso constante. El contenido de humedad es expresado en porcentaje.
26 3.6.2. Extractos de tara
a. Determinación de la capacidad antioxidante
Esta característica fue determinada por el método del ABTS propuesto por Arnao (2001). Los extractos de la tara fueron puestos a reaccionar con una solución del radical ABTS, donde el decrecimiento de la absorbancia a 734 nm en función al tiempo fue evaluado. Cuando la absorbancia llegó a ser constante se dio por finalizada la reacción (El tiempo de reacción utilizada para los extractos de tara fue calculada y se presenta en el Anexo I). La capacidad antioxidante fue calculada como µmol Trolox equivalente (TE)/g o 100 mL a partir de una curva estándar desarrollada con trolox (Anexo II).
b. Determinación de los compuestos fenólicos
Se utilizó el método recomendado por Singleton y Rossi (1956). Este método se basa en la reacción cromófora del extracto de la tara con el reactivo Folin- Ciocalteu, la cual fue determinada espectrofotométricamente a una longitud de onda de 755 nm. Para los cálculos se empleó una curva estándar de ácido gálico (Anexo II) y los resultados fueron reportados como mg de ácido gálico equivalente (AGE)/ g o 100 mL.
c. Determinación de taninos hidrolizados del tipo galotaninos
Esta prueba se hizo en los extractos de tara iniciales con fines de caracterización. Los galotaninos se determinaron por el método de la rodanina propuesto por Inoue y Hagerman (1988). Este método se basa en la cuantificación del ácido gálico liberado a partir de los galotaninos bajo condiciones de hidrólisis ácida controlada para que el producto posteriormente reaccione con la rodanina y el conjunto sea detectado a una longitud de onda de 520 nm. Para los cálculos se empleó una curva estándar de ácido gálico (Anexo II). Los resultados fueron expresados como ácido gálico equivalente (AGE) /g o 100 mL.
27 3.7. Metodología experimental
El presente estudio constó de tres partes principales las cuales se describen a continuación:
3.7.1. Obtención de la harina de tara
Para obtener la harina de tara se siguió el siguiente procedimiento (Figura 10):
a. Recepción de la materia prima: Se recepcionó la tara en bolsas de polietileno de doble densidad, además se controló el peso.
b. Selección: Permitió seleccionar las vainas de tara que presentaron las mejores condiciones, es decir aquellas que no presenten daños físicos ni algún material extraño. En esta operación se tomó una muestra para determinar la humedad de la tara fresca.
c. Desvainado: Se procedió a separar las semillas de la vaina de tara de forma manual.
d. Secado: Después de obtener las vainas de la tara (cáscara), estas se llevaron a secar a 55º C por un tiempo de 18 a 20 h aproximadamente hasta alcanzar un nivel de humedad de 4 % aproximadamente.
e. Molienda: Una vez secada las vainas de tara se procedió a moler las misma utilizando en este caso una licuadora.
f. Tamizado: Se efectuó el tamizado con la finalidad de obtener una harina de tara con un tamaño de partículas homogéneo, menores a la abertura de un tamiz con mesh 18. Una vez obtenido la harina se guardó en bolsas de polietileno de doble densidad extrayéndole el aire y se almacenó en una congeladora a -20ºC.
28
RECEPCIÓN DE TARA
SELECCIÓN
DESVAINADO
SECADO DE LA CÁSCARA
MOLIENDA
TAMIZADO
VAINAS DE TARA
HARINA DE TARA
SEMILLAS
*Sin daño físico ni material extraño
*Manual (extracción de las semillas)
*A 55ºC por 24 horas
*Malla de 18 mesh
Figura 10. Diagrama de flujo para la obtención de la harina de tara
3.7.2. Obtención de los extractos de tara
A partir de la harina de tara obtenida anteriormente se procedió a obtener los extractos, método utilizado por Chambi (2009) y Bravo (2010) en estudios realizados previos a esta investigación. Los extractos obtenidos fueron denominados de la siguiente forma: extracto entero sin hidrolizar (EE) y un extracto hidrolizado por vía ácida por un tiempo de 9 h (EH9h), la razón por la cual trabajar con un extracto de tara
29 hidrolizado por 9 h (~ 90% hidrólisis) fue porque en un trabajo previo se determinó que estos extractos hidrolizados presentaron una alta capacidad antioxidante en comparación a un extracto sin hidrólisis, e inclusive un extracto de tara hidrolizado por 26 horas (100% de hidrólisis) presentaba valores similares de capacidad antioxidante respecto al de 9 hora de hidrólisis (Chambi, 2009).
Para la obtención del extracto de tara entero e hidrolizado se siguió el procedimiento descrito por Chambi (2009) el cual se describe a continuación (Figura 11 y 12 respectivamente):
a. Extracción: La harina de tara fue sometida a una extracción con acetona al 80%
(Tian et al., 2009) bajo la relación materia prima: solvente: 1/100 (p/v); la extracción fue realizada por un tiempo de 20 horas a 4 ºC.
b. Centrifugación: Fue realizada a una velocidad de 4000 rpm durante 15 min a temperatura ambiente, el sobrenadante obtenido fue separado y sometido a una concentración.
c. Concentración: La concentración se realizó en un rota vapor bajo vacío a 37 ºC, con la finalidad de llegar a eliminar el contenido total de la acetona.
d. Clarificación: El concentrado fue sometido a temperaturas por debajo de 4 ºC por 24 horas con la finalidad de eliminar partículas finas en suspensión.
e. Centrifugación: Fue realizada a una velocidad de 4000 rpm por 10 min a temperatura ambiente. El extracto acuoso obtenido fue denominado extracto entero sin hidrolizar (EE).
f. Separación líquido-líquido: El EE fue sometido a un fraccionamiento líquido- líquido con acetato de etilo, obteniéndose dos fases: una fase acuosa y una fase etil acetato. En la fracción acetato de etilo quedan una gran proporción de los compuestos fenólicos, taninos y ácido gálico (Gonzales, 2004). Para esta operación se utilizó la relación 1:2 (v/v) extracto /acetato de etilo, respectivamente y fue realizada dos veces.
30 g. Concentración: El acetato de etilo fue removido por evaporación al vacío a 37 ºC
hasta sequedad.Luego los sólidos extraídos fueron recuperados en agua milliQ.
h. Liofilización: Los extractos suspendidos en agua fueron llevados a congelación por 4 horas a -80ºC y luego a liofilización iniciándose a 250x10-3 BAR controlando que llegue a estabilizarse a -50 ºC por 15 horas, para obtenerlos bajo la forma de polvo y realizar las pruebas posteriores de estabilidad. A los extractos liofilizados se les determinó el contenido de compuestos fenólicos, capacidad antioxidante, contenido de taninos hidrolizables y ácido gálico, los dos últimos con fines de caracterización.
Para la obtención del extracto de tara hidrolizado se siguió el mismo procedimiento descrito arriba sólo que se reincorporó el proceso de hidrólisis (Figura 12), el cual fue desarrollado de la siguiente forma:
Hidrólisis: Para obtener el extracto hidrolizado (EH9h), el EE fue sometido a una hidrólisis ácida utilizando H2SO4 a una concentración de 2N a100 ºC. Para la hidrólisis, el EE fue llevado a una concentración 20 mg AGE/mL (Kenneth y Hagerman, 1987).
La hidrólisis se realizó por un tiempo de 9 horas donde se logra llegar a un grado de hidrólisis cercana al 100% (Chambi, 2009). Luego de esta etapa se continúo de la misma forma que para el extracto sin hidrólisis, el diagrama de flujo se presenta en la figura 12.
Una vez obtenidos los extractos entero (EE) e hidrolizado por 9 horas (EH9h) se procedió a liofilizarlos, para luego ser convertidos a extractos a los que les determinó el contenido de ácido gálico, galotaninos, capacidad antioxidante y compuestos fenólicos.
31
CENTRIFUGACIÓN
CONCENTRACIÓN
CLARIFICACIÓN
CENTRIGUGACIÓN
HARINA DE TARA
EXTRACCIÓN EXTRACCIÓN
CONCENTRACIÓN
DISOLUCIÓN
LIOFILIZACIÓN MP/SOL: 1/100
4ºC x 24 h
4000 RPMx 15 min
37ºC x 40 min
4ºCx 24h
4000 RPM x 15 min
SOL: ETIL ACETATO EE/SOL:½ x 24 h
37ºC hasta sequedad
Agua miliq
Precongelamiento x 4h a - 80ºC Liofilización x 15 h
EXTRACTO SIN HIDRÓLISIS DE TARA
LIOFILIZADO
CARACTERIZACIÓN
COMPUESTOS FENÓLICOS CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
GALOTANINOS ACIDO GÁLICO
SEPARACIÓN LÍQUIDO/
LÍQUIDO
Purificación del Extracto Entero
Figura 11. Diagrama de flujo para la obtención del extracto de tara sin hidrólisis
