Aquests canvis alteren la capacitat catalítica de la proteïna, donant lloc a la seva forma activa (si són induïdes per molècules activadores) o inactiva (si són inhibidors). La capacitat d'una RNasa per escapar de la unió al RI és de gran importància per a la seva citotoxicitat [82].
Propietats de les RNases pancreàtiques estudiades a aquest treball
L'estructura tridimensional de la proteasa (figura 13) es va predir mitjançant modelatge molecular [272] i es va confirmar per cristal·lització i difracció de raigs X (3HVP [274]). En el cas de l'ONC, es pensava que aprofitava la seva estabilitat i citotoxicitat natural, així com la seva alta capacitat d'interiorització en cèl·lules eucariotes. Es va realitzar mitjançant la coexpressió d'un gen de proteasa amb una extensió N-terminal de 8 residus d'aminoàcids (figura 16).
En aquest treball, es van escollir ONC i HP-RNasa per a la creació de zimògens a partir de la seva permutació circular. En el cas de l'ONC, l'objectiu era aprofitar la seva alta estabilitat i citotoxicitat natural.
Seqüències naturals reconegudes per la HIV-1 PR als precursors poliproteínics del HIV-1
Punts d’estudi actuals per a l’assoliment de la cura funcional de la SIDA
L'anàlisi de l'efecte d'intensificar la teràpia HAART durant la inversió de la latència podria reduir la seva amenaça. L'enzim salvatge tenia el seu gen RNasa fusionat a un fragment que codificava un pèptid que contenia l'objectiu d'una proteasa específica. L'activació dels zimògens de la RNasa per part de la proteasa PR del VIH-1 aconsegueix una estratègia basada en la funció d'un enzim viral per induir toxicitat en lloc de la seva inhibició.
El gen de la proteasa del VIH té un 20% de codons de baixa freqüència d'ús en procariotes.
Característiques generals de les línies cel·lulars utilitzades
Freqüències i percentatge de codons de baix ús en procariotes del gen de la proteasa PR del VIH-1. Els zimògens ONC escapen de l'inhibidor de la ribonucleasa de la mateixa manera que l'ONC.
Coeficients d’extinció molar (280 nm) pel càlcul de concentració de les proteïnes estudiades
Factors de correcció de l’IFE per a les diferents concentracions de substrat
Les diferents construccions es van produir i es van purificar, donant lloc a zimògens ONC i HP-RNasa que podrien ser activats específicament per la proteasa PR del VIH-1. Es van utilitzar tres tipus de seqüències d'unió reconegudes específicament per la proteasa PR del VIH-1 per bloquejar el lloc actiu dels zimògens (taula 8). D'una banda, seqüències del tipus YP, SQNY*PIVQ (on l'asterisc indica el punt d'escissió), reconegudes i digerides de forma natural per la proteasa PR del VIH-1.
I, finalment, es va dissenyar una variant de les seqüències FL, anomenada tipus FL2, IF * LETSGIF * LET, que representa dos llocs d'escissió per la proteasa PR del VIH-1.
Llistat dels zimògens produïts en aquest treball
Els fragments així amplificats es van clonar en vectors d'expressió de la sèrie pET. La producció de zimògens HGN i la variant PM5 parental es va realitzar seguint un protocol descrit anteriorment per a HP-RNasa [173, 215]. Com es pot veure a la figura 29, l'activació del zimogen ONCYP va deixar de progressar aproximadament 4 hores després de l'addició de la proteasa.
Així, el fet que l'ONC de tipus salvatge escapi de l'IR és una de les raons de la seva gran citotoxicitat [82, 113]. Per tant, les diferències en els rendiments d'activació entre les variants YP i FL dels zimògens de la RNasa ONC i HP poden estar relacionades amb les obtingudes pels diferents substrats de la proteasa PR del VIH-1 en l'estudi de Beck et al .-contributors [280] . La causa de les variacions en l'eficiència de les seqüències d'aminoàcids sembla ser la diferent afinitat de la proteasa PR del VIH-1.
Oligonucleòtids utilitzats en la construcció dels vectors d’expressió de les proteïnes d’estudi
Freqüències de codons de baixa utilització en procariotes del gen de la proteasa HIV-1 PR
Massa molecular teòrica i obtinguda per la proteasa SK#1 de l’estudi
En analitzar el procés de purificació de la proteasa per SDS-PAGE (Figura 25), es va observar que l'etapa de diàlisi, tot i estar associada a una pèrdua substancial de la proteasa en la fracció insoluble (com es veu als carrils A7 i B5), també va constituir un pas important de purificació (al carril A6 la proteasa és gairebé pura). En el cromatograma de cromatografia d'intercanvi catiònic en Mono-STM (figura 24), es va observar l'aparició de dos màxims d'absorció principals a 170 mM i a 250 mM de NaCl, respectivament. Analitzant el contingut dels pics amb MALDI-TOF, vam trobar una proteïna majoritària d'aproximadament 7 kDa heterogènia al pic 1, probablement productes de l'autoprocessament de la proteasa, i va ser al pic 2 que vam localitzar la proteasa SK#1 madura i on el prosegment N-terminal està escindit.
La seqüència utilitzada en el pèptid de substrat és la mateixa que la seqüència natural de reconeixement i digestió de la proteasa MA/CA.
Paràmetres cinètics de la proteasa SK#1 pròpia comparada amb la comercial recHIV1-PR
Per obtenir els zimògens, els extrems N- i C-terminals originals de la proteïna nativa es van unir amb una seqüència d'aminoàcids que contenia un objectiu per a la proteasa PR del VIH-1. L'activació in vitro del zimogen ONCYP amb proteasa SK#1 de producció pròpia es va provar mitjançant diferents proporcions molars de zimogen:proteasa i mostreig al llarg del temps després de l'addició de proteasa. Es va plantejar la hipòtesi que aquest compost, tot i satisfer els requisits estèrics com es pot deduir de l'alt rendiment de proteïna correctament plegada obtinguda en la purificació, impedia d'alguna manera l'accessibilitat de la proteasa.
Per aconseguir l'objectiu mitjançant l'extensió de la seqüència, es va afegir un residu Gly addicional a banda i banda del lloc de tall de la seqüència YP (zimògens ONCYPG1 i ONCYPG2, amb seqüències d'enllaç de 15 residus) o a tots dos (zimogen ONCYPGG, amb enllaçador de 16 residus) Taula 8).
Llistat de les masses moleculars teòriques i obtingudes per les variants i zimògens d’ONC
Per a tots els gels, el carril M correspon a marcadors de massa molecular: 15, 10 i 4 kDa. B) Representació gràfica del processament de diferents zimògens al llarg del temps. Quantificació de l'activació per densitometria, a partir dels gels SDS-PAGE anteriors, utilitzant el quimioluminòmetre FluorChem® SP Imaging System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA).
Anàlisi de l’estabilitat i funcionalitat dels zimògens d’ONC
Internalització del zimogen ONCFLG-S120C conjugat al fluoròfor Alexa Fluor® 488 C5-maleimida (Molecular Probes, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) en cèl·lules Jurkat cultivades. Per demostrar realment si els zimògens eren funcionals o no, es va realitzar un estudi de citotoxicitat dels zimògens ONC amb activació in vivo. Citotoxicitat dels zimògens ONCYPG1 i ONCFLG en cèl·lules HEK293T, de les formes intactes, sense transfecció (No Transf) i activades in vivo (Transf, amb transfecció amb el vector pNL4.3ΔEnvGFP [393]), en comparació amb ONC.
Aquest zimogen va ser escollit com a model de zimogen ONC perquè mostrava la millor activació de la proteasa.
Estadística estructural de les 20 millors estructures NMR del zimogen ONCFLG
A nivell general, comparant l'estructura del zimogen ONCFLG amb la de l'ONC (Figura 35), podem observar una lleugera obertura de la molècula entre els lòbuls V1 i V2, fent més gran la fissura central. Es poden veure diferències marcades comparant l'ordre dels residus responsables de la catàlisi ONCFLG en relació amb els residus equivalents a l'estructura cristal·logràfica de raigs X d'ONC (1ONC) [93] o el complex ONC-d (AUGA) (2I5S) [70] ] (Figura 36A). Els valors Δδ es van obtenir a partir de la diferència entre els valors δ del zimogen ONCFLG intacte (BMRB núm. 17973) i el clivat (Δδ= δintact - δactivat).
Els protons HN de la segona hèlix també estan desprotegits, fet que també es va descriure per a ONC i variants de tipus salvatge [112].
Llistat de les masses moleculars teòriques i obtingudes per les variants d’HP-RNasa
Creació del nou zimogen HGNFL-R31ER91D i anàlisi de la capacitat d'evasió del RI Després de constatar la inhibició dels zimogens HGN per part del RI, es va considerar oportú crear un zimogen final que pogués escapar de l'associació amb l'inhibidor. Aquestes substitucions van ser seleccionades com a grup de recerca. havia documentat anteriorment la capacitat d'evasió de RI del mutant HP-RNasa anomenat PE3 (R31ER91A), conferint-li una citotoxicitat moderada a les cèl·lules K562 [203]. Amb aquestes condicions, s'esperava aconseguir un augment de l'eficiència catalítica de la RNasa madura respecte al precursor, mantenint una baixa activitat basal.
A continuació, es va analitzar la capacitat d'evasió de RI del zimogen HGNFL-R31ER91D, una característica per a la qual aquest mutant va ser dissenyat específicament.
Anàlisi de l’estabilitat i funcionalitat dels zimògens d’HP-RNasa
Càlcul de la Tm dels oligos en mutació dirigida
Com que la variant de l'ADN polimerasa AmpliTaq®, de Thermus aquaticus, no té activitat de correcció 3'→5', s'impedeix eliminar aquests didesoxiribonucleòtids (ddNTPs) incorporats a la cadena. Les còpies d'ADN s'obtenen mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa PCR amb cebadors en la direcció 5' i 3' als extrems de la regió d'interès. Per a aquest treball, el pas final de seqüenciació d'àcids nucleics es va realitzar als Serveis Tècnics d'Investigació de la Universitat de Girona.
Afegiu de manera estèril, a cada alíquota de 100 µl de cèl·lules competents, 2 µl d'ADN plasmidi si procedeix de minipreps o 10 µl d'ADN si és de reacció o lligament DpnI post-QuikChangeTM (màxim 50 ng d'ADN a un volum no superior a 1/10 del volum del fracció o alíquota).
Càlcul de la concentració proteica per espectrofotometria
Els oligonucleòtids utilitzats en la PCR per amplificar el gen de la proteasa eren 5HIV_NdeI i 3HIV_SalI i es detallen a la Taula 9. Per a la producció de proteasa PR del VIH-1, la soca RosettaTM2(DE3) amb el vector d'expressió de proteasa pSK#1 [376]. L'elució de proteasa es va realitzar mitjançant un gradient de sal de 0-400 mM de NaCl en 15 min.
En blau: els tres punts comuns d'autohidròlisi de la proteasa Leu5-Trp6, Leu33-Glu34 i Leu63-Ile64.
Correcció de l’Efecte d’Apantallament Intern (IFE)
La fluorescència final detectada correspon a la fluorescència del producte format PIVQ-EDANS, que es troba a la mateixa concentració que el substrat inicial, permetent la conversió d'unitats de fluorescència a unitats de concentració. Finalment, després de corregir l'efecte IFE i convertir les unitats de V a μM min-1, les dades es van ajustar a l'equació 5 de Michaelis-Menten i es van calcular parells inversos o Lineweaver-Burk.
Equació de Michaelis-Menten
Per al modelatge dels zimògens HP-RNasa, el fitxer pdb d'una variant d'HP-RNasa es va obtenir del Databank (codi pdb 1DZA), anomenat PM7 [172]. El producte d'amplificació es va digerir amb els enzims de restricció NdeI i BamHI i el fragment resultant es va subclonar al vector pET22b(+), obtenint el vector pONC_BamHI. La construcció de les variants de l'HP-RNasa i dels zimògens es va dur a terme de manera similar a la de les variants ONC, per permutació circular.
El producte d'amplificació es va purificar i es va digerir amb enzims de restricció NdeI i SalI i es va subclonar en pET22b(+) obtenint el vector pHGN-HPL.
Càlcul de k cat /K M
Es va analitzar l'efecte de dues de les variants de zimogen ONC activables per la proteasa del VIH-1 en cèl·lules infectades en cultiu, que es van dur a terme al Laboratori de Retrovirologia de la Fundació irsiCaixa, a l'Hospital Germans Trias i Pujol (Badalona). juntament amb el Dr. Es va considerar adequat utilitzar aquesta soca per millorar l'expressió, a causa de l'alt percentatge (20%) d'aquest tipus de codó en el gen de la proteasa (Taula 10). Al mateix temps, és la zona més dinàmica de la proteïna, tant indicada pels desplaçaments químics (Figura 39A) com pels valors RMSD (Taula 15) i les mesures dels NOE heteronuclears (Figura 40) de l'estudi de RMN.
Comparant el zimogen amb ONC (1ONC [93]) i el complex ONC-d (AUGA) (2I5S [70]), també es van observar canvis en l'orientació dels residus responsables de la catàlisi (Figura 36), especialment en el catalitzador P1. subunitat. En comparació, la permutació circular de l'HP-RNasa redueix la Tm uns 14 ºC, que és el doble de la reducció d'estabilitat causada pels zimògens ONC, una proteïna molt més termoestable (Tm 87 ºC). L'activació in vitro de zimògens utilitzant la proteasa SK#1 varia entre el 10 i el 100% depenent de la seqüència d'aminoàcids i la longitud del connector del zimogen.