Proteasa Vmax (μM min-1)a KM (μM)a kcat/KM (μM-1 min-1) Eficiència catalítica relativa (%)
SK#1 0.174 ± 0.003 14.04 ± 0.800 17.10 ± 0.98 90.4
recHIV-1PR 0.150 ± 0.010 10.94 ± 1.020 18.91 ± 1.23 100
a Els valors de Vmax i KM per cada proteasa foren determinats realitzant l’assaig de caracterització cinètica, amb el substrat DABCYL-γ-Abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-EDANS (Bachem, Suïssa), en 0.1 M acetat sòdic, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% DMSO, 1 mg/ml BSA, pH 4.7, en un volum final de 120 µl, incubant a 30 ºC de temperatura. Les concentracions del substrat es determinaren entre 0 i 130 µM, i la concentració de la proteasa, a 1.45 µM. La proteasa comercial recHIV1-PR era de Bachem (Suïssa).
Efecte de la correcció de l'Inner Filter Effect
[S] (M)
0 20 40 60 80 100 120 140
Vo (u.Fl./min)
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Correcció Inner Filter Effect 3,5
[S] (M)
0 20 40 60 80 100 120 140
% Fluorescència detectada
0 20 40 60 80 100
A B
- 113 -
Figura 27.Comparativa de la caracterització cinètica de les proteases SK#1 i recHIV-1 PR.
L’assaig de caracterització cinètica es realitzà en les condicions detallades al peu de la Taula 12. A) Ajust de les dades corregides a l’equació de Michaelis-Menten. B) Ajust de les dades corregides a la linealització de Lineweaver- Burk o dobles recíprocs.
5.2. PRODUCCIÓ I CARACTERITZACIÓ DELS ZIMÒGENS BASATS EN ONC
5.2.1. Disseny, producció i activació del zimogen ONCYP
Seguint el mateix procediment que Raines i col·laboradors [360], es dissenyaren zimògens basats en ONC que fossin enzimàticament actius només quan es dóna l’acció hidrolítica específica de la proteasa del virus de la SIDA. Per a la obtenció dels zimògens, s’uniren els extrems N- i C- terminals originals de la proteïna nativa amb una seqüència aminoacídica que contenia una diana per la proteasa HIV-1 PR. D’aquesta manera, l’enzim no seria capaç de ser catalític mentre el linker es troba intacte. Es crearen nous N- i C- terminals mitjançant permutació circular. S’escollí l’ONC perquè és una proteïna que ha estat molt estudiada, i que presenta un elevat grau de citotoxicitat. A més, és altament estable, i internalitza eficientment a les cèl·lules. Aquestes qualitats la fan una proteïna interessant per a la construcció de zimògens. En el moment de dissenyar els zimògens d’ONC, es van tenir en compte tres característiques que poden influir a l'activitat, a l'estabilitat general i a la citotoxicitat de l’enzim.
En primer lloc, reflexionàrem que en afegir la seqüència linker als zimògens s’aconseguiria, a la vegada, fer que el zimogen perdés activitat (bloqueig del centre actiu) i que s’activés per la HIV1-PR (seqüència específica). Però en el cas de les variants d’ONC, i d'acord amb l'estratègia de disseny, la seqüència que connecta els extrems amino i carboxil natius impedia que es pogués dur a terme la ciclació espontània del residu de glutamina N-terminal (Gln1) de l’ONC
Ajust a Michaelis-Menten
[S] (M)
0 20 40 60 80 100 120 140
V (M min-1)
-0,02 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20
SK#1 recHIV-1 recHIV-1 fitted curve SK#1 fitted curve
Linealització per Lineweaver-Burk
1/[S] (M-1)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
1/V (min M-1)
0 20 40 60 80
SK#1 recHIV-1 SK#1 regression recHIV-1 regression
B
A
- 114 -
que genera un piroglutàmic (Pyr1), essencial per l’activitat ribonucleasa d’aquest enzim [93, 96]. Per aquest motiu, es va reemplaçar el residu Gln1 per un residu de serina (Ser1). Està descrit que aquesta substitució a l’N-terminal de l’ONC era la que conservava la major eficiència catalítica i major citotoxicitat d’entre les opcions que van ser estudiades [95, 96, 106], postulant que el grup hidroxil d’un residu de Ser o Tyr podia assumir el rol de l’oxigen del carbonil del Pyr1 original, permetent igualment la formació d’una xarxa de ponts d’hidrogen a l’N-terminal [112].
En segon lloc, l’ONC presenta un enllaç disulfur C87/C104, que lliga el carboxil terminal Cys104 a una cadena- central (Figura 5A), segrestant-lo allunyat de l’N-terminal [93]. L'anàlisi de l'estructura cristal·logràfica de l’ONC (1ONC, [93]) revela que la distància entre els residus terminals amino i carboxil és 18.18 Å, que podria ser abastat per tan sols 5 residus (suposant una periodicitat de l’esquelet polipeptídic de 3.8 Å) en una conformació totalment desplegada.
Els estudis de modelatge, però, suggeriren que era necessari un linker amb una seqüència mínima de 14 aminoàcids o més per tal de connectar els extrems amino i carboxil natius i codificar per la seqüència diana de la proteasa HIV-1 PR sense pertorbar l'estructura global, evitant alhora la unió del substrat.
Els nous residus N-i C- terminals seleccionats Arg73/Ser72 es van escollir basant-nos en l’accessibilitat al solvent que presenten aquests residus al loop 4-5 de l’ONC, zona que es situa a la perifèria i la qual s’havia demostrat prèviament que era capaç d’acomodar una substitució Ser72Cys, utilitzada en el marcatge fluorescent de l’ONC per a seguir la seva internalització cel·lular [142]. A més, aquestes posicions són les homòlogues a les que van permetre l’obtenció del zimogen més efectiu de la RNasa A a l’estudi de Plainkum i col·laboradors [360]. Aquests residus són llunyans del centre actiu i no presenten cap rol en la catàlisi ribonucleolítica [47, 64]. Cal afegir també que a alguns homòlegs de l’ONC aquest loop és més llarg, com a la Proteïna Catiònica d’Eosinòfil (ECP) [407]. Aquest fet, junt amb la observació d’elevada flexibilitat a aquest loop, fa pensar que aquesta zona és altament tolerant a les modificacions. En contrast, dos dels altres loops exposats al solvent, que connecten les dues últimes cadenes-β o la segona i tercera a l’ONC salvatge, sovint contenen residus de prolina en cis a proteïnes homologues com la RNasa A i són molt menys tolerants a mutacions. Finalment, gràcies als ponts disulfur 19-68 i 30-75 de l’ONC, els nous extrems N- i C- terminals no natius dels zimògens segueixen quedant ancorats al cos de la proteïna malgrat l’eliminació de l’enllaç peptídic entre els residus 72 i 73. A la Figura 28B es mostra el modelat estructural preliminar d’un dels zimògens d’ONC (ONCFLG), remarcant els extrems N- i C- terminals de nova creació (Arg73/Ser72) i amb un linker de 16 residus formant una hèlix-α i unint els terminals natius, comparat amb l’estructura de l’ONC salvatge (A), i la seva seqüència aminoacídica (C).
- 115 -
Considerant tots els motius esmentats, es va construir el plasmidi pONCYP, que dirigia la producció de l’ONC permutada, ONCYP, afegint una metionina extra precedint l’Arg73 de l’N- terminal del zimogen i amb el residu Ser72 com a nou carboxil terminal (en la numeració del zimogen seria la Ser118). Al zimogen ONCYP, els extrems natius Cys104 i Ser1 estan connectats per la seqüència aminoacídica C104GSGSQNY*PIVQSAGS1, de 14 residus, que vam anomenar de tipologia YP (Taula 8). Aquesta seqüència conté la diana natural MA/CA de la poliproteïna Pr55Gag específica (Taula 3) de la proteasa HIV-1 PR (subratllada en la seqüència), la qual és tallada a l’enllaç peptídic Tyr*Pro [270, 383, 384]. En aquest cas, i segons la classificació de substrats de les aspartil-proteases descrita prèviament [282, 283], es tracta d’un substrat de tipus 1, amb un aminoàcid aromàtic en posició P1 i un residu de Pro a P1’. Molts estudis cinètics de caracterització d’aquesta proteasa s’han centrat en aquesta seqüència diana, que també és la mateixa que trobem a l’octapèptid del substrat DABCYL-EDANS utilitzat en l’assaig de caracterització cinètica de la proteasa SK#1 d’aquest treball (Taula 12). Els residus que flanquegen la seqüència de reconeixement de la proteasa es van seleccionar pel fet de presentar cadenes laterals flexibles petites o polars (glicina, alanina o serina), aconseguint així la longitud necessària per unir els extrems de la proteïna permutada alhora que es proporcionava flexibilitat i solubilitat a aquesta.
Després d’expressar el zimogen ONCYP en E. coli BL21(DE3) en forma de cossos d’inclusió, se’l sotmeté a un procés de replegament oxidatiu in vitro i es va purificar obtenint un elevat rendiment, de més de 25 mg/L de cultiu. La puresa i homogeneïtat de la mostra es va confirmar per SDS-PAGE i es comprovà la massa molecular per espectrometria de masses MALDI-TOF (Taula 13).
Un zimogen de ribonucleasa ha de ser activat eficientment per la proteasa activadora. Es va assajar l'activació in vitro del zimogen ONCYP amb la proteasa SK#1 de producció pròpia utilitzant diferents relacions molars zimogen:proteasa i agafant mostres al llarg del temps després de l’addició de la proteasa. En l’anàlisi per SDS-PAGE en condicions reductores, l’aparició de dos fragments resultants del processament, de 9 i 4 kDa, permeté fer un seguiment de l’activació. Incubant el zimogen ONCYP sense la proteasa overnight a 37 ºC no s’observà hidròlisi espontània, així com tampoc en resultà de la incubació conjunta de la proteasa HIV-1 PR amb la proteïna salvatge ONC (dades no mostrades). Com es pot observar a la Figura 29, l’activació del zimogen ONCYP però, deixava de progressar després d’unes 4 hores des de l’addició de la proteasa. Fins i tot utilitzant una relació molar de 1:5 ZIM:PR i incubacions més llargues (fins a 30 hores) no resultà en una major activació, aconseguint tan sols un 10% de la forma activada. Es va hipotetitzar que aquest connector, malgrat satisfer els requeriments estèrics com es pot deduir de l’elevat rendiment de proteïna correctament plegada obtingut en la purificació, impedia d’alguna forma l’accessibilitat de la proteasa.
- 116 -
Figura 28. Comparativa estructural dels zimògens d’ONC amb l’ONC salvatge.
A) Estructura tridimensional d’ONC (1ONC) [93]. Es mostra el residu Pyr1 en barres roges. B) Modelat estructural de la variant ONCFLG, generat utilitzant el servidor de modelatge per homologia SWISS-MODEL i minimitzant l’energia amb la implementació GROMOS 96 de Swiss-Pdb Viewer [385]. Els terminals amino i carboxil no natius (Arg73/Ser72), creats per permutació circular, i els residus que constitueixen l’enllaç a processar (Phe40-Leu41) es representen amb barres roges. El segment d’unió dels N- i C- terminals originals es mostra en taronja. Ambdues figures s’han generat mitjançant PyMOL (http://pymol.sourceforge.net/). C) Alineament de les seqüències aminoacídiques de l’ONC salvatge i el zimogen ONCFLG, mostrant esquemàticament l’estructura secundària de l’ONC. Es mostra la seqüència en els mateixos colors dels elements d’estructura secundària, en blau pels fulls-β i en vermell per les hèlixs-α. Els residus que composen el connector FLG, unint la Ser49 i Cys32 (Glu1 i Cys104 en l’ONC), es ressalten en negreta i subratllats.
5.2.2. Optimització de l’eficiència d’activació. Disseny, producció i activació de noves variants de zimògens d’ONC: -YPs i -FLs
Amb l'objectiu d’aconseguir un zimogen que fos activat de manera més eficient per la proteasa, es van dissenyar nous linkers basant-nos en dos principis: i) augmentar la flexibilitat i la longitud del connector per tal d’afavorir l'accessibilitat de la proteasa, i ii) augmentar l’afinitat de la proteasa pel linker, utilitzant una seqüència de reconeixement diferent.
C
A B
- 117 -
Per aconseguir l’objectiu a través de l’elongació de la seqüència, es va afegir un residu addicional de Gly a un dels dos costats del lloc de tall de la seqüència YP (zimògens ONCYPG1 i ONCYPG2, amb seqüències connectores de 15 residus) o a tots dos (zimogen ONCYPGG, amb linker de 16 residus) (Taula 8). Per tal d’encarar el segon punt, es va utilitzar una altra tipologia de seqüència, GSGIF*LETSL, que vam anomenar FL. El reconeixement de les seqüències per part de l’aspartil-proteasa HIV-1 PR és divers i l’especificitat en la digestió és controlada per interaccions complexes entre com a mínim sis aminoàcids al voltant del lloc de tall. Al treball de Beck i col·laboradors [280], es va observar que la seqüència Ac-GSGIF*LETSL-NH2 era processada 60 vegades més eficientment que la YP, i essent la més eficient de tota una llibreria de pèptids de fags, escanejada per seleccionar nous substrats per la proteasa HIV-1 PR.
Aquesta seqüència es basa en substrats de tipus 2 de les aspartil-proteases, pel fet de presentar dos residus hidrofòbics a les posicions P1 i P1’. Com que amb el connector de 14 residus provat inicialment s’havia obtingut una activació pobra, els zimògens ONCFL i ONCFLG es van dissenyar amb una longitud de 15 i 16 residus de linker, respectivament. A la Taula 8, es pot observar que ONCFLG conté una Gly addicional al costat amino de l’enllaç peptídic que serà hidrolitzat.
De forma similar a l’obtingut inicialment pel zimogen ONCYP, els nous zimògens d’ONC es produïren amb un rendiment final d’uns 30-40 mg/L de cultiu en funció de la variant. L’anàlisi per espectrometria de masses MALDI-TOF dels zimògens purificats confirmà la massa molecular de cada zimogen (Taula 13).
S’assajà l’eficiència de tall d’aquests nous zimògens d’ONC per la proteasa SK#1 i, com es mostra a la Figura 29, després de 30 hores d’incubació a una relació ZIM:PR de 5:1, l’activació dels zimògens ONCYPG1, ONCYPG2 i ONCYPGG va resultar ser de 38%, 32% i 43%, respectivament. Així doncs, l’elongació de la seqüència resultava en un increment de la reacció de catàlisi per part de la proteasa de 3-4 vegades en relació al zimogen original ONCYP. A diferència d’aquesta primera tipologia de seqüència, els zimògens tipus FL (ONCFL i ONCFLG) eren totalment processats a temps curts d’incubació i utilitzant una relació molar ZIM:PR de solament 100:1. Aquests resultats indiquen que els linkers basats en la seqüència aminoacídica nova GSGIF*LETSL són digerits de forma molt més eficient per part de la proteasa que els basats en la seqüència SQNY*PIVQ. Atesos els resultats, per a les activacions posteriors dels zimògens, necessàries en la caracterització de zimògens i RNases escindides, es considerà oportuna la relació molar zimogen:proteasa de 50:1 i incubant la solució tota la nit a 37 ºC en la majoria de casos, exceptuant els zimògens ONCFL, que es deixaren solament durant 5 hores.
- 118 -