Tm = 81.5 + 0.41 · (%GC) − 675 / N − %desaparellament
On Tm = temperatura de fusió, %GC és el percentatge de bases G o C del total, N és el nombre de nucleòtids totals de l’oligonucleòtid, i %desaparellament és el percentatge de nucleòtids que no hibriden amb la seqüència patró.
El protocol de QuikChangeTM recomana que els oligonucleòtids tinguin una Tm per sobre de 70 ºC (s’ha aproximat a 78 ºC sempre que fos possible), per tal de poder ajustar la temperatura d’hibridació de la PCR. Els oligonucleòtids han estat subministrats, de manera liofilitzada, per Roche Diagnostics S.L. (Roche Molecular Biochemicals, Alemanya). Aquests liofilitzats s’han resuspès amb 200 μl d'aigua mil·liQ, s’ha determinat la seva concentració espectrofotomètricament, i s’han preparat alíquotes de cada oligonucleòtid a la concentració de treball per a cada metodologia.
4.2.3.9. Seqüenciació de DNA
Per a validar els clons obtinguts en aquest treball s’ha fet mitjançant la seqüenciació del DNA de les construccions. S’ha seguit l’anomenat mètode del didesoxiribonucleòtid, emprant el kit comercial ABI PRISM® dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, EUA), el qual utilitza l’enzim AmpliTaq® DNA polymerase. La tècnica es basa en reaccions de seqüenciació cíclica, sintetitzant una cadena complementària a la cadena motlle, per part de la polimerasa, fins que s’incorpora un didesoxiribonucleòtid marcat fluorescentment (ddNTP) al qual li manca el grup OH en 3’ de la ribosa, de manera que s’atura la síntesi. Com que la variant de la polimerasa AmpliTaq® DNA polymerase, de Thermus aquaticus, no presenta activitat correctora 3’→5’, s’evita que elimini aquests didesoxiribonucleòtids (ddNTPs) que s’incorporen a la cadena. D’aquesta manera es van generant fragments de diferents mides aleatòriament, els quals són posteriorment separats segons la longitud i identificats mitjançant un seqüenciador automàtic que detecta la presència dels fluoròfors. Hi ha quatre tipus de ddNTP, un per cada nucleòtid, els quals porten incorporat un fluoròfor diferent, per facilitar la seva identificació.
Per portar a terme aquesta tècnica, cal obtenir prèviament gran quantitat del fragment de DNA a seqüenciar. Les còpies del DNA s’aconsegueixen utilitzant la reacció en cadena de la polimerasa PCR amb encebadors en direcció 5’ i 3’ als extrems de la zona d’interès. En vectors de al sèrie pET, com els utilitzats en aquest treball, podem emprar els primers universals T7term i T7prom, els quals són complementaris a les regions del promotor i finalitzador dels
- 73 -
gens clonats. Llavors, un cop amplificat el fragment de DNA a seqüenciar, es realitza una segona PCR amb els ddNTPs i l’enzim AmpliTaq® DNA polimerase. Sovint podem realitzar la segona PCR directament a partir de minipreps si aquestes contenen una quantitat elevada de DNA. A continuació es detallen les condicions per a dur a terme la primera i la segona PCR.
Primera PCR (amplificació de l’insert).
Barreja de reacció
DeepVent Buffer (x10) 10 μl dNTPs 10 mM (0.2 mM final) 2 μl dsDNA motlle (~50 ng) 5 μl
T7Prom (5 pmol/μl) 5 μl
T7Term (5 pmol/μl) 5 μl
Aigua mil·liQ estèril 73 μl
DeepVent DNA Polimerasa (1 U) 0.5 μl Programa (Termociclador)
Desnaturalització inicial 2 min a 94ºC
Desnaturalització 1 min 15 s a 94ºC
Hibridació 1 min a 50ºC x 30 cicles
Extensió 1 min 15 s a 72ºC
Extensió final 5 min a 72ºC
Final Indefinidament a 4ºC
El DNA amplificat es precipita i es purifica a partir d’un gel d’agarosa. El DNA s’elueix en 40 μl d’aigua mil·liQ estèril escalfada prèviament a 65ºC.
Reacció de seqüenciació (PCR asimètrica o 2a PCR). S’ha utilitzat el kit comercial ABI PRISM®
dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), com a motlle el dsDNA obtingut en la primera PCR i com a encebador T7Prom o T7Term.
Barreja de reacció
dsDNA motlle 5.5 μl
Encebador (T7term / T7prom, 5pmol/μl) 0.5 μl
Ready Mix 4 μl
La Ready Mix és subministrat per la casa comercial i conté ddNTPs, dNTPs, Tris-HCl (pH 9.0), MgCl2 i la polimerasa AmpliTaq DNA.
- 74 - Programa (Termociclador)
Desnaturalització inicial 2 min a 96ºC
Desnaturalització 30 s a 96ºC
Hibridació 15 s 50ºC x 25 cicles
Extensió 4 min a 60ºC
Final Indefinidament a 4ºC
Precipitació de la reacció de seqüenciació. Utilitzant el T7 Term i el T7 Prom per separat com a encebadors s’aconsegueix la seqüenciació de cada una de les cadenes, un inicia pel promotor i l’altre pel final del gen, la qual cosa permet seqüenciar-ne la seva totalitat. Els diferents fragments marcats amb ddNTPs es precipiten afegint al producte de la reacció 0.1 volums d’acetat de sodi 3 M pH 5.2 i 3 volums d’etanol absolut. Es vorteja suaument i es deixa 15 min a temperatura ambient. Transferir a un Eppendorf. Centrifugar 15 min a 15000 rpm, aspirar el sobrenedant, afegir-hi 250 μl d’etanol 70% fred i vortejar suaument. Centrifugar 5 min a 15000 rpm, aspirar el sobrenedant i assecar 15 min a l’estufa a 37 ºC. Resuspendre amb 10 μl de formamida, vortejar suaument i deixar 10 min a temperatura ambient, fent un pols de centrífuga posterior per recollir tot el volum. A aquest treball s’ha realitzat el pas final de seqüenciació d’àcids nucleics als Serveis Tècnics de Recerca de la Universitat de Girona.
4.2.3.10. Obtenció de Cèl·lules Competents d’E. coli
Posar 10 ml de medi LB a una ampolla de 75 ml o a un tub Falcon, i inocular-hi la soca desitjada d’E. coli procedent del socari, partint del glicerinat. Incubar durant tota la nit a 37 ºC i 180 rpm.
L’endemà, reinocular a una dilució 1/100 a partir del cultiu de nit (100 μl de cultiu de nit en 10 ml de medi) i incubar a 37 ºC i 180 rpm fins a assolir una D.O.550 de 0.6 – 0.7 (aproximadament 2 h). Aliquotar en tubs Eppendorf o transferir a un tub Falcon de manera estèril. Centrifugar a 4000 rpm a 4ºC durant 10 min. Descartar el sobrenedant de manera estèril. Resuspendre el sediment amb el mateix volum de CaCl2 100 mM fred i estèril. Incubar en gel durant un mínim de 30 min. Centrifugar novament a 4000 rpm a 4 ºC durant 10 min. Descartar el sobrenedant de manera estèril. Resuspendre el sediment amb 1/10 del volum de CaCl2 100 mM fred i estèril. Si s’escau, aliquotar el volum en tubs Eppendorf de 100 μl. A partir d’aquí es poden transformar les cèl·lules competents o emmagatzemar-les a -80 ºC. En cas de guardar-les, en el pas final s’ha d’utilitzar una solució de CaCl2 100 mM amb glicerol per obtenir-ne una concentració final del 15%.
- 75 - 4.2.3.11. Transformació de cèl·lules competents d’E. coli
Afegir estèrilment, a cada alíquota de 100 μl de cèl·lules competents, 2 μl de DNA plasmídic si prové de minipreps o 10 μl de DNA si prové de la reacció amb DpnI posterior al QuikChangeTM o d’un lligament (un màxim de 50 ng de DNA a un volum que no sobrepassi 1/10 del volum de la fracció o alíquota). Agitar suaument, colpejant amb un dit, per tal d’homogeneïtzar la solució. Incubar en gel durant 1-2 h (mínim 20 min) i efectuar un xoc tèrmic posant els tubs Eppendorf al bany a 42 ºC durant 1-2 min. Incubar els tubs en gel durant 10 min. Realitzar una recuperació fenotípica, afegint 300 μl (transformants de minipreps) o 600 μl (transformants de QuikChangeTM i lligaments) de medi LB líquid a cada tub Eppendorf. Incubar a 37 ºC en agitació suau durant 1 h. Centrifugar 1 min a 12000 rpm, eliminar el volum de medi necessari fins un volum final de 200 μl i fer una sembra en plaques d’agar LB suplementades amb l’antibiòtic pel qual el vector que s’està manipulant proporcioni resistència (marcador de selecció). Incubar les plaques en una estufa a 37 ºC O/N, fins que s’observin les colònies transformants (12-15 h).
4.2.4. ANÀLISI I CARACTERITZACIÓ PROTEICA 4.2.4.1. Anàlisi de l’expressió de proteïnes en E. coli
Per tal d’analitzar la producció de proteïna recombinant durant la inducció, es prenen mostres d’1 ml de cultiu en el moment anterior a la inducció i al finalitzar el temps d’inducció. Les mostres se centrifuguen a 12000xg durant 1 min, s’elimina el sobrenedant per aspiració i es resuspèn el sediment cel·lular en 100 μl de tampó d’aplicació de proteïnes x1 amb β- mercaptoetanol. L’anàlisi de l’expressió es duu a terme electroforèticament, utilitzant gels de poliacrilamida SDS tenyits amb blau de Coomassie i/o revelats mitjançant el mètode western.
4.2.4.2. Determinació de la Massa Molecular (Mm)
La massa molecular de les proteïnes recombinants estudiades a aquest treball s’ha comprovat per espectrometria de masses MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time- Of-Flight) en un equip Bruker-Biflex al Servei de Proteòmica de la Unitat CientíficoTècnica de Suport (UCTS) de l’Institut de Recerca de l’Hospital Universitari Vall d’Hebron, Barcelona (per les proteases SK#1 i recHIV-1PR) i un Ultraflex-TOF de Bruker Daltonics, dels Serveis Tècnics de Recerca del Parc Científic i Tecnològic de la Universitat de Girona (pels zimògens de RNases).
- 76 - 4.2.4.3. Determinació de la Quantitat de Proteïna
Mètode espectrofotomètric. A partir de l’absorbància a 280 nm d’una mostra proteica, es calculà la seva concentració segons la llei de Lambert-Beer (Equació 3).