MAESTRO EN CIENCIAS DE LA FLORICULTURA

TABLA DE SIGNIFICADOS DE LA CONCENTRACIÓN DE CIANIDINA DURANTE LA FASE DE ELONGACIÓN CELULAR EN CAPULLOS FLORES DE PLANTAS INOCULADAS. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la infección por el vector EuMV-YP:∆AV1:f3´h sobre la expresión del gen f3´h y la acumulación de antocianinas en plantas de crisantemo (D. grandiflorum Tzvelev) var.

Marco Teórico

Introducción
Antecedentes

Importancia de la floricultura en México
Descripción del Crisantemo
Cambios de la coloración de las flores por mejoramiento genético
Genes involucrados en la coloración de las flores de crisantemo
Silenciamiento de genes inducidos por virus (VIGS)
Descripción de Euphorbia Mosaic Virus (EuMV)
Aislamiento y caracterización de EuMV-YP

Justificación
Hipótesis
Objetivos

Objetivo general
Objetivos específicos

Estrategia experimental

La acumulación de este pigmento se ha asociado con la mayoría de las flores de color púrpura, violeta y azul (Noda et al., 2013). Gentiana (Gentiana triflora) De azul a blanco (Nakatsuka et al., 2010) Phalaenelopsis (Phalaenopsis sp) De rosa a rosa claro (Chen et al., 2011).

Cuantificación y detección de antocianinas en botones florales de crisantemo

Introducción
Materiales y métodos

Material vegetal
Preparación de botones florales para la extracción
Extracción de antocianinas en lígulas liofilizadas
Análisis por HPLC
Análisis estadísticos

Resultados y discusión

Curva de calibración
Establecimiento del método de extracción de cianidina en lígulas liofilizadas

Conclusión

El caudal de la fase móvil fue de 0,5 ml/min y el volumen de inyección fue de 10 µl. Se realizó un diseño factorial 4x2x2 (tabla II.1), el cual estuvo conformado por X1: Disolvente, X2: Inhibición de la enzima Polifenol Oxidasa (PPO) y X3: Hidrólisis. Según el análisis estadístico realizado, la mezcla de solventes y la hidrólisis tienen un efecto significativo sobre la cantidad de cianidina determinada por HPLC, en contraste, la desactivación de la enzima PPO no afecta la cantidad de cianidina extraída.

El resultado de la interacción de los factores sobre la concentración de cianidina se puede observar en las gráficas de efectos principales (Figura II.3), donde el efecto de la interacción entre activación y solvente (Figura Desactivación de la enzima (PPO) mediante procesamiento a Las altas temperaturas durante períodos cortos pueden prevenir la oxidación catalizada por la PPO, sin embargo, la resistencia al calor de la PPO depende de la especie y cultivar de la planta de la que se extrae (Jaiswal et al., 2010). Desactivación de la enzima (PPO) resultó en una mayor concentración de antocianinas al interactuar con el tratamiento hidrolítico y el solvente MAA. Concluimos que el solvente MAA logró un mayor efecto en la extracción de cianidina cuando se realizó la hidrólisis y desactivación de la enzima PPO a 100 °C durante 10 s. en 100 mg de lígulas liofilizadas (Figura II.3), con un nivel de confianza del 95% y un valor p <0,05.

De acuerdo a las gráficas de medias LSD obtenidas en el análisis estadístico, se puede observar que no existen diferencias estadísticamente significativas en el tratamiento de activación respecto a las medias obtenidas en los tratamientos del tipo de solvente e hidrólisis, donde se observa que sí existen diferencias estadísticas. diferencias (Fig. II 4). El método que permitió la extracción con mayor concentración de antocianinas en botones florales y lígulas liofilizadas de crisantemo fue el método que combinó la extracción con el solvente Metanol-agua-ácido fórmico (70:28:2 v/v/v) desactivación. de la enzima PPO a 100°C durante 10 s e hidrólisis en 100 mg B.S.

Análisis in silico del gen f3`h de crisantemo

Introducción
Materiales y métodos

Obtención del material vegetal
Extracción de ARN
Síntesis de cDNA
Condiciones de amplificación por PCR
Análisis in silico de las secuencia del gen f3´h y Actina

Resultados y discusión

Extracción de ARN
Amplificación de los genes f3´h y Actina
Análisis in silico de la secuencia del gen f3´h
Análisis in silico de la secuencia del gen de actina

Conclusión

La integridad del ARN extraído se verificó mediante electroforesis, en un gel de agarosa al 1% compuesto por 1X TAE (Tris, Ácido Acético y EDTA) y 0,05 mg/ml de Bromuro de Etidio, al que se le agregaron 5 µL de la muestra. ARN. Luego se descargó de la base de datos NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) para compararlo y alinearlo con las secuencias informadas del gen f3'h y actina. El ADNc sintetizado a partir de ARN de crisantemo se utilizó como plantilla para amplificar el gen f3'h y la actina.

Las secuencias obtenidas se enviaron a la base de datos NCBI para su registro con los números KT892061 y KT892062, respectivamente. Las secuencias obtenidas se compararon en la base de datos NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), los resultados mostraron una alta similitud de la secuencia f3'h encontrada en este trabajo (DgF3 KT892061) con las reportadas previamente. (cuadro III.2); Encontrando un 98% de similitud con la accesión GU249554, confirmando que la secuencia KT892061 corresponde al gen f3'h. La secuencia f3´h (KT892061) también se comparó con 33 secuencias de genes ortólogos informadas por el NCBI; entre ellos, ocho son más similares, como puede verse en el cladograma de la fig.

46 Figura IV.7 Cladograma construido a partir de 33 secuencias reportadas al NCBI y la secuencia KT892061. La secuencia obtenida del fragmento parcial del gen f3'h presentó una similitud del 98% con otras secuencias reportadas de f3'h en crisantemo en las bases de datos del NCBI.

Correlación entre la concentración de antocianinas y la acumulación de transcritos

Materiales y Métodos

Material vegetal
Cálculo del contenido de antocianinas en base seca
Extracción de antocianinas en botones florales
Análisis de PCR-tiempo real (PCR-tr)

Se utilizaron yemas florales congeladas en diferentes estados de desarrollo, las cuales se trituraron y posteriormente se agregó 1 ml de metanol-agua-ácido fórmico (70:28:2 v/v/v). Después de centrifugar a 10.000 rpm durante 10 minutos, las muestras se filtraron con una membrana de nailon Millipore de 0,22 µm. El contenido de cianidina se analizó mediante HPLC como se describe en la sección II.2.4.

A partir del ADNc, obtenido según lo descrito en el apartado III.2.3, se realizó la amplificación de un fragmento del gen f3'h, con los oligos F3'hFn (5'CTAGCAGGCCGCCAAATTC-3') y F3'hRn (5' GAATTGGCGGCCTGCTA- 3' ), utilizando el kit Luminaris HiGreen qPCR Master Mix (Thermo Scientific No. K0991) y ADN polimerasa Platinium taq (Invitrogen. Para verificar que se realiza una amplificación de un solo fragmento en cada reacción, se obtuvo una curva de fusión.

Resultados y discusión

Extracción de antocianinas en lígulas liofilizadas y botones florales
Optimización de condiciones de amplificación por PCR para determinar la expresión

La acumulación de cianidinas se relacionó con la expresión del gen f3'h (Zhang et al., 2015), este gen codifica la enzima f3'h, que cataliza la hidroxilación en la posición 3'. El primer paso para el análisis de la expresión génica es la optimización de la amplificación mediante PCR en tiempo real (tr-PCR). Por el contrario, la cantidad insuficiente de ADNc no permitirá detectar la baja expresión del gen, ya que sólo una proporción del ADNc corresponde a la expresión del gen f3'h.

Una vez establecidas las condiciones para el análisis de expresión del gen f3'h, se evaluó el nivel de expresión del gen en cada etapa de desarrollo, para ello se recolectaron yemas florales en diferentes etapas de desarrollo y se congelaron en nitrógeno líquido para su posterior extracción. ARN, que se utilizó como base para la síntesis de ADNc. La carga de ADNc en cada mezcla de amplificación se normalizó para la cuantificación de la expresión del gen de actina (gen de referencia). 58 Figura V.7 Gráfico promedio que muestra la expresión del gen f3'h en las diferentes etapas de desarrollo floral (EDF).

Ensayos de matrices múltiples para la expresión del gen f3´h por etapa de desarrollo del botón floral. El patrón de cambios en la acumulación de cianidina y la expresión del gen f3'h coinciden en que la mayor proporción fue durante la etapa AC. Para determinar la relación de la expresión del gen f3'h con la acumulación de cianidina se determinó una correlación Se realizó un estudio de análisis, donde se demostró que existe una relación estadísticamente significativa entre la concentración de Cianidina y la expresión del gen f3'h durante las diferentes etapas establecidas del desarrollo floral.

Conclusión

Infección de plantas de crisantemo mediante pEuMV-YP:∆AV1:f3´h

Introducción

Materiales y métodos

Obtención del vector
Inoculación por bombardeo
Extracción de ADN en hojas de crisantemo
Detección del ADN viral mediante PCR
PCR tiempo real (PCR-tr)
Detección de la expresión del gen f3´h en botones florales de plantas inoculadas

62 clonación: Sph_I, Sma_I, Pst_I y EcoR_V y un fragmento del gen f3'h de crisantemo previamente clonado en el vector pGem T Easy, que se extrajo de este vector mediante digestión con EcoRI y se ligó en el vector pBluescrip KS, previamente digerido con EcoRI produjo el plásmido pBluescrip:f3'h, el cual se digirió con EcoRV y PstI para liberar el fragmento f3'h, este fragmento se clonó en pEuMV-YP:∆AV1 previamente digerido con EcoR_V y Pst_I. Con lo cual se obtuvo el vector VIGS pEuMV-YP:∆AV1:f3´h. Esquema de las construcciones del vector VIGS (C) Componente A del virus del mosaico de Euphorbia-Península de Yucatán modificado al vector VIGS (pEuMV-YP:∆AV1:f3´h); (D) Esquema de pEuMV-YP:∆AV1:f3h, en amarillo está la parte donde se ubica la inserción del gen f3'h. E) Esquema de pEuMV-YP:∆AV1:chll. La inoculación se realizó con diferentes constructos del vector utilizando 25 plantas de aprox. 10 cm de altura de Crisantemo (D. grandiflora) var.

Se tomaron 100 ng del ADN total, extraído de plantas inoculadas con las construcciones descritas en la Tabla 1. Utilizando el par de oligonucleótidos 5'-GACACCAGGACACCAGCAAT-3' y 5'-TTTGGGAACATCGCACTGAG-3' dirigidos contra el gen AC1 en EuMV-YP y AV494: 5'-oligonucleótidos. Las bandas amplificadas en el gel de agarosa se purificaron utilizando el kit "PureLink ® quick gel Extraction" según la metodología recomendada por el proveedor (Invitrogen).

Para confirmar la infección de los diferentes vectores, se realizó la amplificación de un fragmento del gen AC1 localizado en el componente A mediante PCR en tiempo real (tr-PCR) utilizando el kit comercial Luminaris HiGreen qPCR Master Mix (No. K0991), con un volumen final de 10 µL por reacción según las instrucciones del fabricante (Invitrogen) utilizando 100 ng de ADN de cada planta inoculada mediante bombardeo. La extracción de ARN, la síntesis de ADNc y las condiciones de amplificación para tr-PCR se realizaron en yemas florales durante la fase de Elongación Celular (CA) en plantas inoculadas según la metodología establecida en el capítulo 4.

Extracción de Cianidina, cuantificación y análisis mediante HPLC en botones florales de

Análisis estadísticos

Resultados y discusión

Bombardeo de crisantemo con construcciones VIGS
Detección de la infección por métodos moleculares PCR
Secuenciación
Diagnóstico por PCR tiempo real (PCR-tr) para EuMV-YP
Detección de la expresión del gen f3´h en botones florales de plantas inoculadas
Análisis estadístico de la expresión del gen f3´h
Cuantificación de Cianidina en plantas inoculadas con VIG´s

Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de amplificación por PCR de las muestras de ADN de las plantas inoculadas. La parte inferior de la imagen (Fig. V.B) muestra las bandas aisladas y purificadas a partir de amplificaciones de las muestras. La parte inferior de la imagen muestra el producto de amplificación génica de las bandas aisladas en un gel de agarosa al 1%.

Producto de la amplificación tr-PCR en gel de agarosa al 1% de plantas inoculadas con diferentes constructos: A-Mg-quelatasa (pEuMVYP:∆AV1:chlI). Parcelas de la detección del gen AC1 incluido en el vector EuMV-YP a partir de diferentes muestras de ADN en plantas inoculadas con diferentes constructos mediante tr-PCR. 77 La determinación del nivel de expresión del gen f3`h de la extensión celular EDF "AC" en plantas inoculadas se realizó mediante tr-PCR.

Cuantificación relativa (RQ) mediante tr-PCR de la expresión de los niveles de transcrito del gen f3`h, en plantas inoculadas con diferentes vectores durante la fase de elongación de las células "AC" en comparación con los niveles de transcrito del gen Actina utilizado como una referencia, como se ve en el gráfico de la Fig. Gráfica de promedios de concentración de cianidina obtenidos de yemas florales durante la etapa AC de plantas inoculadas.

Conclusión

Conclusión general

Perspectivas

Bibliografía

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93 Tuttle JR, Haigler C, Walker JM, Robertson D (2015) Virus-induced gene silencing of fiber-associated genes in cotton. A novel vector for virus-induced gene silencing based on Euphorbia-Yucatan Peninsula mosaic virus for NPR1 silencing in Nicotiana benthamiana and Capsicum annuum var.