Michael Toney de la Universidad de California, Davis por su apoyo en la etapa inicial de este proyecto. Lucía Teresa Angulo Sánchez por su apoyo en la obtención del constructo enzimático VpGSTT2.
INTRODUCCIÓN
En las plantas, las GST se dividen en las clases Phi, Tau, Theta, Zeta, Lambda, deshidroascorbato reductasa (DHAR) y tetraclorohidroquinona deshalogenasa (TCHQD) (Frova, 2003; Sasan et al., 2011). En bacterias, las clases más conocidas son Beta, Chi, Theta y Zeta (Nerino Allocati et al. 2009).
ANTECEDENTES
Glutatión S-Transferasa
- Descripción de las GSTs
- Actividad Catalítica de las GSTs
- Actividad catalítica de las GSTs
- Residuos catalíticos
- Estructura de las GSTs
- Estructura y plegamiento tipo tiorredoxina
- Sitios activos
Sin embargo, también se utilizan otros sustratos aromáticos (artificiales), así como sustratos no aromáticos (como los haloalcanos) (Hayes et al., 2005). También se ha propuesto un mecanismo de ajuste inducido para la unión de GSH (Sheehan et al., 2001).
Funciones de las GSTs
- Detoxificación de Xenobióticos y el Metabolismo de Fármacos
- Metabolismo de xenobióticos
- La GST en la fase II del metabolismo de fármacos
- Ligandina
- Resistencia a Metales Pesados
- Isomerasa
- Resistencia a Antimicrobianos
- Otras Funciones de las GSTs
28 enzima OAGST, lo que sugiere una participación de OaGST en la conjugación de atrazina con GSH (Allocati et al., 2009; Favaloro et al., 2000). FosX es un buen catalizador y es responsable de la alta resistencia a la fosfomicina (Stourman et al. 2003).
Clasificación de las GSTs
- Familias de GSTs
- GST Mitocondrial
- Clases de cGSTs en Eucariotas
- Clases de GSTs en Procariotas
- GSTs MAPEG
Las bacterias de clase beta también presentan una cisteína en el sitio activo (Rossjohn et al., 1998). Aunque no están relacionados con las principales superfamilias de GST, dependen del glutatión (Sasan et al., 2011). En la mayoría de los metazoos se encuentran cuatro clases de GST: Omega, Sigma, Theta y Zeta (Wongsantichon et al., 2015).
Recientemente fue identificado a partir de un GST del bivalvo antártico Laternula elliptica (LeGST), también clasificado en la clase Rho (Park et al., 2009). Las GST de la clase Theta (GSTT) en bacterias están representadas por dos diclorometano deshalogenasas (DCM) producidas por bacterias metilotróficas facultativas (Allocati et al., 2009; Stourman et al., 2003). El subgrupo III contiene proteínas microsomales similares a las GST de Escherichia coli y Vibrio cholerae (Hayes et al., 2005).
Modelos de estudio
- Mangifera indica
- Vibrio parahaemolyticus
Según la subdivisión basada en secuencias de la familia MAPEG, el subgrupo I consta de las clases FLAP, LTC4S y MGST2; el único miembro del subgrupo II es MGST3; y MGST1 y PGES1 forman el subgrupo IV. Por el contrario, los MGST2 y MGST3 humanos son capaces de desintoxicar compuestos y sintetizar LTC4 (Jakobsson et al., 1997). Tanto LTC4S como PGES1 no parecen contribuir a la desintoxicación, ya que sus acciones catalíticas se limitan a la síntesis de LTC4 y PGE2, respectivamente (Schröder et al., 2003).
La determinación de una estructura cristalina de 6 Å para MGST1 ha ilustrado que la estructura cuaternaria de la enzima es un homotrímero, también observado para PGES1, otra enzima del subgrupo IV (Holm et al., 2002; Thorén et al., 2003). Por ejemplo, FLAP puede existir en formas monoméricas, diméricas y triméricas y LTC4S puede formar multímeros (Mandal et al., 2004). El síndrome de mortalidad temprana (EMS) en camarones de cultivo fue responsable de una caída del 33% en la producción de camarón en el primer trimestre de 2013.
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos Particulares
MATERIALES Y MÉTODOS
- Obtención del Constructo de pET-VpGSTT
- Sobreexpresión
- Sobreexpresión de MiGSTU
- Sobreexpresión de VpGSTT2
- Purificación
- Purificación de MiGSTU
- Obtención de la Mutante Dirigida VpGSTT2 S11A
- Cinética de VpGSTT2
- Determinación de la Actividad Enzimática de VpGSTT2
- Obtención de Parámetros Cinéticos
- Experimentos de Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC)
- Evaluación de la Resistencia a Cadmio in vivo
- Cristalización de Proteínas
- Cristalización de MiGSTU
- Cristalización de VpGSTT2
- Obtención de las Estructuras Cristalográficas de MiGSTU
- Colecta de Datos para Cristales de MiGSTU
- Reemplazo Molecular, Afinamiento y Validación; MiGSTU
- Obtención de la Estructura Cristalográfica VpGSTT2-GTX
- Colecta de Datos de Cristal VpGSTT2-GTX
- Reemplazo Molecular, Afinamiento y Validación; VpGSTTT2
Las placas se incubaron a 16 °C y los cristales crecieron después de 4 semanas (Valenzuela-Chavira et al., 2017). Las estructuras fueron validadas con el servidor MolProbity (Chen et al., 2010) y cumplieron con los parámetros de calidad para su depósito en el Protein Data Bank. 68 Para el refinamiento de la estructura se utilizó principalmente con el programa Phenix.Refine (Afonine et al., 2012) además del AutoBuild (Terwilliger, et al., 2008) y omitir mapas (Terwilliger et al., 2008 ) ) programas también. El procesamiento manual se utilizó en el programa COOT (Emsley y Cowtan, 2004).
Se utilizaron los programas LiganFit (Terwilliger et al., 2006) y Polder (Liebschner et al., 2017) para determinar la posición del inhibidor. Finalmente, para ser depositada en el PDB, la estructura fue validada con el servidor Molprobity (Chen et al., 2010). Para evaluar la interacción del ligando se utilizó el programa LigPlot (Laskowski y Swindells, 2011; Wallace et al., 1995) y las imágenes se procesaron con los programas Pymol (Delano, 2002) y CCP4-MG (McNicholas et al., 2011). .
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Sobreexpresión y Purificación de VpGSTT2
70 cromatograma muestra que VpGSTT2 se eluyó a 10,8 ml correspondiente al MPM de 48,2 kDa, a la derecha se muestra una SDS-PAGE con las fracciones obtenidas en el experimento de filtración en gel. VpGSTT2 se purificó directamente mediante IMAC como se muestra en la Figura 8-B y se eluyó a una concentración de imidazol 150 mM correspondiente a aproximadamente el 30 % del gradiente del tampón de elución. En la Figura 8-B se observa SDS-PAGE al 12%, la proteína clarificada utilizada para la purificación, así como la proteína no unida, uniones no específicas y la proteína pura, correspondiente al peso molecular de VpGSTT2 (aproximadamente 25 kDa).
Esta sobreexpresión tuvo un mayor rendimiento de biomasa en relación con los otros experimentos de sobreexpresión, produciendo 8 g de sedimentos bacterianos. Además, el rendimiento de proteína pura de IMAC fue de 45 mg por gramo de sedimento bacteriano.
Estructura Cuaternaria de VpGSTT2
Actividad Específica de VpGSTT2 y de la Mutante S11A
Comparando nuestros resultados de actividad específica con los valores reportados para otros GST, se observó que la actividad específica de VpGSTT2 y su mutante S11A se encuentra dentro del rango ya reportado, siendo la actividad más baja la GST de Aspergillus fumigatus con 0.025 AU (Burns et al., 2005) y el más grande es el hígado con hasta 1297 AU (Moatamedi Pour et al., 2014) como el más grande. En este estudio, VpGSTT2 tiene una alta identidad con ScGSTT2, estableciendo una comparación con GST de levaduras como Aspergillus fumigatus e Issatchenkia orientalis con actividades de 0,025 y 2,16 AU, respectivamente (Tamaki et al., 1999; Burns et al., 2002). . ). Una unidad de actividad (UA) se define como la cantidad de producto formado a lo largo del tiempo por miligramos de proteína.
Parámetros Cinéticos de la VpGSTT2
Parámetros Termodinámicos de VpGSTT2
A novel membrane-bound glutathione S-transferase functions in the stationary phase of the yeast Saccharomyces cerevisiae. A mu-class glutathione S-transferase from the gills of the marine shrimp Litopenaeus vannamei: Purification and characterization”. A new class of glutathione S-transferase from the hepatopancreas of sea bream Pagrus major.” Journal of Biochemistry.
An evolutionary perspective on glutathione transferases derived from class-theta glutathione transferase cDNA sequences. The Biochemical Journal. Elucidation of the role of key active site residues of glutathione transferase zeta/maleylacetoacetate isomerase by a novel spectrophotometric technique. The Biochemical Journal. Identification of glutathione S-transferase (GST) genes from a dark septate endophytic fungus (Exophiala pisciphila) and their expression patterns under different metal stress.
Resistencia a Cadmio de E. coli con pET-VpGTT2 y la Mutante S11A
Cristalización de MiGSTU y de VpGSTT2
Los cristales de MiGSTU y VpGSTT2 se obtuvieron en la condición de índice (Hampton Reasearch) descrita en la sección 5.8 de Materiales y métodos. Para el cristal Apo de MiGSTU se obtuvieron mejores cristales con el método "microbatch", mientras que para el resto de complejos con algún ligando, incluido el de VpGSTT2-GTS, fue mejor el método de gota colgante. También se muestran en la Figura 12-A los cristales obtenidos de VpGSTT2 con el inhibidor de GSX.
78 tuvieron mejor calidad y forma que los obtenidos para VpGSTT2 con GSX, lo que se refleja en la calidad de las difracciones. La Figura 12-B muestra un ejemplo de las difracciones de MiGSTU solo en la forma Apo, que, en comparación con la difracción de VpGSTT2, muestra que las difracciones de MiGSTU son mucho más intensas y se observan difracciones de calidad de hasta 1,8 Å. Aunque las difracciones de VpGSTT2 son más débiles, fueron suficientes para obtener datos cristalográficos de sincrotrón.
Estadísticas de las Estructuras Cristalográficas
- Estadísticas de las Estructuras de MiGSTU
- Estadísticas de la estructura de VpGSTT2
Se formaron cristales GTS de VpGSTT2 durante un período de tres semanas y se difractaron en una fuente de rayos X sincrotrón en las instalaciones de Stanford Synchrotron Light Source (SSRL). La estructura de VpGSTT2 con el inhibidor GTS tiene dos monómeros en la unidad asimétrica (Figura 16-B) y está en una celda unitaria monoclínica con un grupo espacial P1211. Estadísticas de recopilación de datos y refinamiento de datos de estructura cristalográfica de VpGSTT2.
La Figura 16-A muestra la densidad electrónica representativa característica de la resolución de la estructura. La estructura final obtenida tiene valores de Rwork/Rfree de 19%/22% además de la región permitida del diagrama de Ramachandran de 97%, obteniendo una estructura cristalográfica con buenas estadísticas para ser validadas (Ver Tabla 5).
Análisis Estructural
- Análisis Estructural de MiGSTU
- Análisis estructural de VpGSTT2
- Comparación Estructural entre MiGSTU y VpGSTT2
La cavidad del sitio G en la estructura cristalográfica de VpGSTT2 tiene el residuo Ser11 como posible residuo catalítico, ya que Ser11 interactúa con el grupo sulfonato de GTS. Además de las moléculas de agua H2O172 y H2O183, todas participan en la coordinación de los ligandos GSH o GTS en el sitio G (ver Figura 16 C y D). La Figura 16-A muestra la densidad electrónica del inhibidor GTS con Ser11 y H2O172, por lo que esta densidad respalda su posición en la estructura cristalográfica.
3m3m), la distancia entre el residuo catalítico Ser10 y GSH es 2,96 Å. Interacción GTS en el sitio G de VpGSTT2. La Figura 18 muestra la superposición de MiGSTU-GTX (monómero A) con VpGSTT2-GTS (monómero A), observándose diferencias principalmente en las cadenas laterales del dominio C-terminal. La Figura 19-A muestra la superposición de los ligandos GTX y GTS; Ambos se encuentran en la ubicación G de GST, pero su disposición es diferente.
Análisis del Sitio Activo y Residuo Catalítico de VpGSTT2
Comparación de ligandos y serina catalítica de Migstu y VPGSTT2. A) Superposición de ligandos GTS de VPGSTT2 (azul) vs GTX de Migstu (verde). Para confirmar la importancia de Ser11 y demostrar que es el residuo catalítico, se creó el mutante S11A. Al evaluar su actividad específica, fue 21 veces menor que la obtenida para VpGSTT2 nativo, confirmando que Ser11 es el residuo catalítico. Alineamiento de secuencia de VPGSTT2 vs secuencias con mecanismo atípico y serina como residuo catalítico.
CONCLUSIONES
92 Su sitio activo se conserva con serina como residuo catalítico característico de la clase Tau. También se encontraron diferencias estructurales en parte del sitio G, donde la principal diferencia es un desajuste del residuo catalítico Ser11 de VpGSTT2 con respecto a Ser14 de MiGSTU.
RECOMENDACIONES
Characterization of a zeta-class glutathione transferase from Arabidopsis thaliana with a putative role in tyrosine catabolism. Formation of the 1-(S-glutathioneyl)-2, 4, 6- trinitrocyclohexadiene anion in the active site of glutathione S-transferase: evidence for enzymic stabilization of. Binding of substrates and an enzymatic reaction product to glutathione S-transferase A. Journal of Biological Chemistry.
Crystal structure of the glutathione S-transferase-like domain of elongation factor 1Bgamma from Saccharomyces cerevisiae.”. A genomic approach to comprehensive analysis of the glutathione S-transferase gene family in soybean and maize. Three-dimensional structure of glutathione S-transferase from Arabidopsis thaliana at 2.2 Å resolution: Structural characterization of herbicide-conjugating plant glutathione S-transferases and a novel architecture of the active site.
Esquema de la reacción de las GSTs
Reacción de conjugación del GSH y CDNB catalizada por GST
Residuos conservados de cada tipo de mecanismo
Estructura del dímero de GST
Diferentes representaciones del sitio activo de GST
Ruta de biotransformación de xenobióticos
Relación Filogenética de las clases de cGST
Obtención de VpGSTT2 pura
Datos experimentales de cinética enzimática
Perfil termodinámico de VpGSTT2 por ITC
Prueba de resistencia al cadmio
Cristales y ejemplo de difracción de MiGSTU y VpGSTT2
Representación en listón de un monómero MiGSTU
Modelo cristalográfico de GSH y GTX en el sitio G
Superposición de MiGSTU con GSH vs GTS
Estructura cristalográfica de VpGSTT2
Interacción GTS en el sitio G de VpGSTT2
Superposición de MiGSTU-GTX con VpGSTT2-GTS
Comparación de ligando y serinas catalíticas de MiGSTU y VpGSTT2
Alineamiento de secuencia con el mecanismo atípico y con serina