Clases de cGSTs en Eucariotas

2.3.3.1. Mamíferos. Las GST citosólicas de mamíferos son todas diméricas con subunidades de 199-244 aminoácidos de longitud. En base a la similitud de secuencias de aminoácidos, se reconocen siete clases de GSTs citosólicas en especies de mamíferos, denominadas Alpha, Mu, Pi, Sigma, Theta, Omega y Zeta (Arockiaraj et al., 2014; Brock, Board, y Oakley 2013; Dixon, Cole, y Edwards 2000; Hayes y Pulford 1995; Ruscoe et al.

2001). En roedores y humanos, las isoenzimas GST citosólicas dentro de una clase típicamente comparten >40% de identidad, y aquellas entre clases comparten <25% de identidad (Hayes, Flanagan, y Jowsey, 2005). Además de estas clases de cGST en mamíferos, se han reportado los Canales Intracelulares de Cloruro (CLIC) y el factor de elongación 1Bγ, ambos adoptan la misma estructura cristalina de una cGST (Harrop et al., 2001; Jeppesen et al., 2003).

40 Las GST clase Theta (GSTT) de mamíferos fueron ignoradas originalmente porque no se unían a matrices de afinidad a GSH (Meyer et al., 1991). Esta clase solo muestra 7% de identidad de secuencia global con las clases Alpha, Mu y Pi (Pemble y Taylor, 1992) y GSTT no tiene especificidad con el CDNB, considerado el sustrato universal. Por otra parte, a diferencia de las clases Alpha, Mu y Pi, las GSTT tiene en la región N-terminal una serina como residuo catalítico en lugar de una tirosina (Rossjohn, et al., 1998). La serina del sitio activo no es esencial para esta reacción, lo que sugiere que la arquitectura del sitio activo hace una importante contribución a la catálisis en este enzima. La GSTT también se encuentra en bacterias, levaduras, plantas, insectos y otras fuentes.

Posteriormente se descubrió que algunas GSTT de plantas son activas con CDNB como sustrato (Sheehan et al., 2001).

El cribado de una base de datos de secuencias de humano identificó una nueva GST llamada clase Omega (GSTO), cuya estructura cristalina muestra diferencias muy marcadas con otras GSTs de mamífero descritas anteriormente (Board et al., 2000). En particular, la enzima tiene un residuo de prolina inusual en la posición 19 o 20, no presente en otras clases, que junto con el dominio C-terminal forma una unidad estructural única.

La interfaz entre subunidades está dominada por interacciones no polares y es considerablemente más abierto que en otras GSTs. En el sitio activo se encontró una interacción entre Cys32 y el grupo sulfhidrilo del GSH, que contrasta con lo encontrado en otras GST de mamíferos, donde una tirosina (Alfa, Mu y Pi) o una serina (Theta) realizan el ataque nucleofilico. La clase Beta bacteriana también presenta una cisteína en el sitio activo (Rossjohn et al., 1998).

Esta enzima muestra una actividad particularmente alta con CDNB y otros sustratos. La enzima parece estar expresada en la mayoría los tejidos humanos y ortólogos existen en el ratón (Kodym et al., 1999), rata (Ishikawa et al., 1998) y el nemátodo Caenorhabditis elegans (Board et al., 2000). El efecto de inhibición depende de que GSTO sea catalíticamente activo, y la mutación de Cys32 a alanina la inactivó (Dulhunty et al., 2001).

41 2.3.3.2. Plantas. Las clases de GST en plantas son Phi, Tau, Theta y Zeta, que son proteínas diméricas y poseen un residuo de serina en sus sitios activos; la DHAR y la GST clase Lambda, difieren de estas enzimas en ser monómeros y tener una cisteína catalítica en sus sitios activos. La proteína TCHQD también puede contener una serina en su sitio activo. En el caso de GST phi y tau, solo aquellas subunidades de la misma clase se dimerizarán. Sin embargo, las subunidades dentro de una misma clase pueden dimerizarse incluso si son bastante diferentes en sus secuencias de aminoácidos (Sasan et al., 2011).

Adicionalmente se ha reportado como GST el factor de elongación eucariótico 1Bγ (EF1Bγ).

Las familias que se han reportado exclusivamente en plantas son las GSTs Phi, Tau, DHAR y Lambda, siendo las más abundantes Tau y Phi, estando involucradas principalmente en procesos de desintoxicación (Frova 2003, 2006).

El análisis genético y los proyectos de genómica indican que las plantas tienen más de 55 genes que codifican GSTs y que las proteínas comparten tan solo el 10% de identidad de aminoácidos (McGonigle et al., 2000). La cantidad de exones es diferente para cada clase de GST. Por ejemplo, el gen para la GST clase phi contiene tres exones y para la clase tau contiene dos, mientras que para la clase zeta, que cataliza reacciones de isomerasa, contiene diez exones (Basantani y Srivastava, 2007; Sasan et al., 2011).

En el primer intento en clasificar a las GST de plantas, los reservistas propusieron tres clases basadas en sus similitudes de secuencia de polipéptidos y estructuras de exones (Dixon et al., 2000). Las GST se han clasificado recientemente en cuatro tipos: Tipo I (Phi), tipo II (Zeta), tipo III (Tau) y tipo IV (Theta) (Sasan et al., 2011). Las GST tipo I que componen toda las GST clásicas de plantas con actividad desintoxicante de herbicidas, contienen tres exones y un intrón. El otro grupo grande, tipo III, consiste principalmente en GSTs inducidas por auxinas, con genes que contienen dos exones y dos intrones. Éstas GST son altamente divergentes a las isoenzimas tipo I y ahora han sido colocado en una clase. Las GST tipo II tienen diez exones y nueve intrones (Dixon et al.,

42 1998). Recientemente, se ha propuesto un grupo tipo IV para varios genes de Arabidopsis con cinco intrones (Edwards et al., 2000).

Curiosamente, las GST de clases Theta y Zeta comparten un alto grado de similitud de secuencia, incluso considerando períodos evolutivos largos (Frova, 2003). Las clase Zeta y Theta tienen actividades muy restringidas hacia los xenobióticos (Liu et al., 2013).

Mientras que las GSTT son glutatión peroxidasas y están involucradas en el metabolismo del estrés oxidativo (Basantani y Srivastava, 2007), las GSTZ participan en el catabolismo de Tyr, son dependientes de GSH y tambien tienen actividad isomerasa (Edwards y Dixon, 2005).

La primer DHAR que se identificó fue novedosa (Jakobsson et al., 1999) y se clasificó como clase Lambda (Wongsantichon y Ketterman, 2005). Esto a pesar de que las GST de clase Lambda no muestran ninguna actividad tipo DHAR. Mas bien, estas enzimas tienen actividad de tiol transferasa dependiente de GSH, al igual que DHARs, y se sabe que son inducidas junto con GSTs Phi y Tau en cereales después de la exposición a herbicidas (Dixon et al., 2002).

Finalmente, las plantas también contienen genes que codifican a GSTs microsomales.

Aunque no están relacionadas con la principal superfamilia GSTs, son dependientes de glutatión (Sasan et al., 2011). DHAR y GST Lambda no tienen actividad de conjugación a GSH detectable hacia xenobióticos estándares usados como sustratos de GST (Dixon et al., 2002). DHAR es también una enzima clave en el ciclo del ascorbato-glutatión que mantiene concentraciones reducidas de ácido ascórbico (Moons, 2005). Un estudio encontró que las GST lambda usan flavonoles como ligandos de alta afinidad y demostraron un nuevo rol donde es dependiente de GSH y participa en reciclaje de quercetina oxidada (Dixon y Edwards, 2010).

43 2.3.3.3. Hongos. En comparación con otros grupos principales como los mamíferos, plantas e insectos, se sabe relativamente poco sobre las GST de hongos, aunque está claro que estas enzimas se expresan ampliamente en una gran cantidad de especies de hongos.

Al igual que con los mamíferos, plantas e insectos, las GSTs de hongos se expresan en formas múltiples y son inducible por xenobióticos (Dowd y Sheehan, 1999).

Teniendo en cuenta la identidad de secuencia de aminoácidos y otras características, nueve clases de GST citosólicas se han descrito hasta la fecha en hongos, incluyendo: GTT1, GTT2, Ure2p, MAK16, EFB1, similar a la eteresa (recientemente renombrado GSTFuA) (Mathieu et al., 2013), Phi (Morel et al., 2013), Omega y glutationil hidroquinona reductasa (GHR o clase Xi), además de un número de clases no caracterizadas (Morel et al., 2009; Shen et al., 2015). Sin embargo, debido a sus diferencias estructurales e inmunológicas en comparación con otros organismos, no se ha alcanzado una clasificación uniforme de las GST fúngicas (Morel et al., 2013; Shen et al., 2015).

Sin embargo, dos clases de GST llamadas Omega (GSTO) y glutationil hidroquinona reductasa (GHR) poseen en su sitio catalítico un residuo de cisteína, confiriendo a estas proteínas la capacidad de eliminar el glutatión de varias moléculas estructuralmente diferentes (Morel et al., 2013). Estas enzimas son altamente versátiles y pueden cambiar de actividad cuando se cambian solo uno o pocos aminoácidos en la secuencia de la proteína (Mannervik, 2012). La GSTFuA solo se encuentra en bacterias y hongos (Morel et al., 2009), y está relacionada con las proteínas Lig de Sphingobium sp. (Masai et al., 1989). Los genes que codifican Lig están organizados en operones, que contiene LigE, LigF y LigG. Las proteínas correspondientes están involucrados en el corte de los enlaces de β-aril éter, que es el enlace más abundante que se encuentra en la lignina (Morel et al., 2013).

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, siete proteínas tienen actividad GST; GTT1, GTT2, GSTO1, GSTO2, GSTO3, Grx1 y Grx2 (Collinson y Grant, 2003). Sin embargo, las estructuras de Grx1 y Grx2 muestran que no son auténticas GSTSs, sino que solo corresponden al dominio N-terminal (Yu et al., 2008). De las otras cinco proteínas

44 homólogas, GSTO1, GSTO2, GSTO3 se clasifican en la clase Omega (Garcerá et al., 2006), mientras que GTT1 y GTT2 no se clasifican en ninguna clase existente.

La GST clase GTT se ha definido para unas GST especiales, ya que corresponden a la primer GST caracterizada en S. cerevisiae (Choi et al., 1998). En la levadura se encuentran GTT1 y GTT2. Ambas proteínas muestran actividad contra sustratos para GST clásicos, como CDNB. ScGTT2 también cataliza la formación de conjugados de glutatión-Cd (Adamis et al., 2004), mientras que ScGTT1 cataliza la reducción de hidroperóxidos, en particular hidroperóxido de cumeno, probablemente en el retículo endoplásmico (Herrero et al., 2006). ScGTT1 y ScGTT2 tienen funciones superpuestas con glutaredoxinas (ScGrx1 y ScGrx2) que están involucradas en la respuesta al estrés oxidativo. Análisis filogenéticos sobre ascomicetos, zygomycetos y basidiomicetos han demostrado que GTT1 y los homólogos GTT2 se agrupan por separado (Choi et al., 1998; Morel et al., 2009). El número de isoformas GTT1 y GTT2 varía de 0 a 4 para GTT1 y 0 a 5 para GTT2 (Morel et al., 2013).

En algunas GSTs de hongos se ha identificado un grupo, que se encuentra en una clase separada, y en base a la secuencia de aminoácidos se muestran una similitud con la clase phi de las plantas. En particular, la parte N-terminal de algunas secuencias en basidiomicetas poseen alrededor del 75 % de similitud con la GSTFs de álamo y de Arabidopsis (Morel et al., 2013). En hongos, la cantidad de genes que codifican GSTF difiere considerablemente según el genoma considerado, que van de 0 a 10. El número más alto (10 isoformas) se encuentra en Botryobasidium botryosum, Hydnomerulius pinastri, Coniophora puteana y Serpula lacrymans (Morel et al., 2013). Un estudio proteómico reveló la regulación positiva de la isoforma Phi de Phanerochaete chrysosporium después de la adición exógena de vainillina, que es uno de los intermediarios clave encontrados durante la degradación de la lignina (Shimizu et al., 2005).

Las GST que pertenecen a la clase Ure2p se han encontrado solo en hongos y bacterias.

En S. cerevisiae, Ure2p actúa como un regulador de represión catabólica del nitrógeno y

45 como proteína de respuesta al estrés (Cooper, 2002). Al analizar las secuencias de aminoácidos de GST Ure2 de ascomicetos y basidiomicetes, se ha demostrado que esta clase podría ser dividido en dos subclases llamadas Ure2pA y Ure2pB (Morel et al., 2013).

En cada subclase, las secuencias se agrupan según la taxonomía que sugiere una diversificación reciente de secuencias de Ure2p (Thuillier et al., 2011). Se descubrió que Ure2p tienen una alta homología con la GST clase Nu, reportada inicialmente en bacterias (Stourman et al., 2011). Posteriormente, se concluyó que la subclase Ure2pB pertenece a la clase Nu y que la subclase Ure2pA no se agrupa con las Nu (Ure2pB) por lo que se sugiere utilizar la nomenclatura tipo-Nu (Roret et al., 2015).

2.3.3.4. Otros organismos. En base a alineamiento de secuencias, se creó una nueva clase de GSTs, designada como Sigma (GSTS) (Buetler y Eaton 1992). Esta clase incluye a GSTs purificadas de calamar (Harris et al. 1991). Su estructura tridimensional revela que la interfaz del dímero es distinta a las clases Alpha, Mu y Pi ya que no contiene el motivo llave y cerradura, que tiene importancia para la estabilidad del dímero y que las interacciones electrostáticas del sitio activo parecen ser importantes (Stevens et al., 2000).

El sitio activo de GSTS se une a GSH de una manera similar a las GSTs Alpha y Pi, mientras que la GST Mu proporciona un conjunto diferente de interacciones con el GSH en el sitio activo (Ji et al., 1995). Un tercer sitio de unión para conjugados de GSH también se ha identificado, que puede ser importante en el transporte conjugado (Sheehan et al., 2001). Las enzimas de la clase Sigma han estado fuertemente implicadas en la síntesis de prostaglandina. Se reveló una relación entre las GSTS de helmintos y una prostaglandina isomerasa dependiente de GSH, mediante la comparación de datos de secuencias (Ji et al., 1996).

Se han purificado GSTs de insectos individuales y al igual que con las plantas y los mamíferos, las enzimas son expresadas en niveles altos, en formas de isoenzimas múltiples y en diferentes patrones en varias etapas de desarrollo (Zhou y Syvanen 1997).

Las GST se relacionan con la resistencia a los insecticidas y son a menudo inducidas en

46 cepas resistentes. El sistema de clasificación más generalmente aceptado para insectos reconoce dos clases inmunológicamente distintas designadas I y II (Syvanen et al., 1994).

Las clase I presentes en Musca domestica, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae (Ranson et al., 1997) y Anopheles dirus (Prapanthadara et al., 1998) y Lucilia. cuprina (Wilce et al., 1995) están más estrechamente relacionadas con la clase Theta de los mamíferos basado en alineamientos múltiples , aunque ahora han sido reclasificadas en una clase Delta de insectos (Sheehan et al., 2001). Las GST clase II se han identificado en Manduca sexta y Drosophila melanogaster (Prapanthadara et al., 1998) y sobre la base de publicaciones de árboles filogenéticos, se cree que son similares a la clase Sigma. Una búsqueda BLAST en el genoma de D. melanogaster identificó varios miembros de las clases Omega, Zeta, Sigma (Chelvanayagam et al., 2001).

Organismos helmintos como Fasciola hepatica, Schistosoma mansoni y Ascaris lumbricoides son parásitos que afectan la salud humana y animal. Generalmente, estos organismos tienen niveles bajos de enzimas de la fase I de la desintoxicación, pero expresan GST especialmente en respuesta al tratamiento farmacológico del hospedero (Brophy y Barrett, 1990). Las GSTs de están helmintos asignadas a la clase Sigma (GSTS) (Meyer y Thomas, 1995), y muestran poca similitud con las GSTs clase Alpha, Mu y Pi.

Sin embargo, un modelo cristalográfico sugiere que las GSTS se parece más a la clase Pi, ya que carece tanto del lazo Mu como de la a-hélice extra de la clase Alpha. El bajo nivel de identidad de secuencia facilitó la producción de anticuerpos policlonales específicos para esta enzima (Sheehan et al., 2001).

Una estructura cristalográfica de GST Fh-47 confirmó el parecido general a la clase Mu en general y a la GST de Schistosoma. japonicum (Rossjohn et al., 1997). El modelado molecular mostró diferencias críticas en el sitio de unión al sustrato xenobiótico, que puede explicar las diferencias de unión de inhibidores entre estas isoenzimas, así como diferencias en el sitio de unión sin sustrato (Sheehan et al., 2001). Desde la perspectiva de la clasificación, es interesante que mientras que los organismos helmintos expresan GST claramente relacionadas a las clases Mu, Pi y Sigma de otros organismos, estas enzimas contienen suficientes regiones de diferencia estructural en comparación con las enzimas

47 del huésped para mantener la perspectiva del desarrollo de vacunas específicas para parásitos.

Con la creciente cantidad de información de secuencia y estructura disponible, se han encontrado GSTs relacionadas con otras proteínas de unión a GSH, como por ejemplo, la proteína URE2 de Saccharomyces cerevisiae (J Rossjohn et al., 1996), el factor de elongación 1γ de traducción eucariótica (Sheehan et al., 2001) y el factor inhibidor de macrófagos (Sheehan et al., 2001). La evolución de estas enzimas citosólicas parece suceder a través de la adición de un dominio helicoidal después la estructura de la tioredoxina βαβαββα (Sasan et al., 2011).

En la mayoría de los Metazoos se encuentran cuatro clases de GSTs: Omega, Sigma, Theta y Zeta (Wongsantichon et al., 2015). También hay clases que aparecen solo en organismos específicos como en plantas, Phi y Tau (Edwards y Dixon, 2005), o en artrópodos, Delta y Epsilon (Wongsantichon et al., 2015). La GSTO de Drosophila se reportó una enzima sintasa clave en la biosíntesis de pigmentos de pteridina que se encuentra en los ojos rojos de algunos insectos (Kim et al., 2006). En insectos, las GSTs de las clases Delta y Epsilon hacen contribuciones importantes a la desintoxicación de insecticidas, contribuyendo a la resistencia de los mismos (Wongsantichon et al., 2015). Existen estructuras cristalográficas de GST clase Epsilon; por ejemplo, del mosquito Anopheles gambiae vector de la malaria (Mitchell et al., 2014), de un segundo gran vector de la malaria el mosquito Anopheles funestus (Riveron et al., 2014)^, y una estructura de la mosca doméstica Musca domestica (Nakamura et al., 2013). La GST Epsilon de la mosca (Drosophila melanogaster, DmGSTE6) presenta una actividad significativamente alta para el sustrato 4-hidroxinonenal (HNE) (Saisawang y Ketterman, 2012). El HNE fue propuesta como un citotóxico secundario producto final de la peroxidación lipídica que contribuye a la etiología de los trastornos degenerativos como el Alzheimer (Sayre et al., 1997) y la enfermedad de Parkinson (Yoritaka et al., 1996).

No hay un estándar de clasificación para categorizar las GSTs de organismos marinos, hasta el 2005 donde la GST clase Rho que es una clase específica de organismos marinos,

48 se identificó en Pagrus major (Konishi et al., 2005). Muchas otras GSTs de organismos marinos también se han clasificado en la clase de Rho. Recientemente se identificó de una GST del bivalvo antártico Laternula elliptica (LeGST) también clasificado en la clase Rho (Park et al., 2009). Las GSTs Rho han evolucionado para reducir los efectos de cualquier compuesto xenobiótico tóxico, lo que resulta en una especificidad equilibrada del sustrato sin preferencia por ciertos sustratos (Park et al., 2013).