1 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
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Extracción por acción biocatalítica y dióxido de carbono supercrítico de capsaicinoides y
carotenoides del Capsicum chínense y análisis por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC)
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TESIS
PRESENTADO POR LA BACHILLER:
CORONEL BONIFACIO, EDITH LILIANA
PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE:
INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
Huancayo - PERÚ
2012
2 Dedicatoria: A DIOS por ser mi guía y permitirme finalizar este trabajo; a mis padres, junto con mis hermanos por su amor, interés y continuo apoyo; y a mis abuelitos Félix Bonifacio M., Natalia Cóquel E. y Delfina Fernández, se que están felices por este logro.
3 HACEN CONSTAR:
Que el presente trabajo de investigación titulado: Extracción por acción biocatalitica y dióxido de carbono supercrítico de capsaicinoides y carotenoides del Capsicum chínense y análisis por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), ha sido realizado bajo la dirección de la MSc. Norma Gamarra Mendoza como líder de proyecto y fue cofinanciado por UNCP- INCAGRO, con fondos provenientes del Banco Mundial.
AGRADECIMIENTOS
- A la MSc. Norma Gamarra Mendoza, Docente de la FAI.I.A. – U.N.C.P., que me inculco en la línea de investigación y experiencia en laboratorio.
- Al Ing. Alejandro Roncal Saíto, Encargado del laboratorio de Química de Alimentos de la Universidad Peruana Unión, que me apoyo en la cuantificación por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC).
- Al Ing. Samuel Gutiérrez Rojas, Director del laboratorio KOICA - Instituto Tecnológico Santiago Antúnez de Mayolo por su apoyo que muy amablemente me brindó.
- Al Dr. José Luis Navarrete Bolaños y PhD. Juan C. de la Fuente por su valioso apoyo en las capacitaciones de procesamiento y análisis.
- A mis compañeros y amigos de Laboratorio de Biotecnología de Alimentos y a todas las personas que de una u otra forma han hecho posible la culminación del trabajo de tesis.
GRACIAS A TODOS Edith Liliana Coronel Bonifacio.
4 CONTENIDO GENERAL
CAPITULO Pág.
RESUMEN 09
ABSTRAC 11
I. INTRODUCCIÓN 13 II.REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 15 2.1 Descripción general de la materia prima. 15
2.1.1 El Ají (Capsicum sp). 15
2.1.2 Características generales. 16
2.1.3 Aspectos botánicos. 17
2.1.4 Producción mundial y en el Perú 17
2.1.5 Composición química proximal del ají. 20
2.1.6 Productos elaborados a partir de ajíes. 20
a) Oleorresina 21 2.1.7 Capsicum chínense, características generales. 22
2.1.7.1 Origen. 24
2.1.7.2 Nombres comunes 24 2.1.7.3 Producción en el Perú 24
2.2 Biocomponentes presentes en el ají: Capsaicinoides y carotenoides 25 2.2.1 Capsaicinoides 26
2.2.1.1 Características generales 26
2.2.1.2 Efectos y aplicaciones de los capsaicinoides 29 2.2.1.3 Identificación y cuantificación de capsaicinoides 31
2.2.2 Carotenoides 31
2.2.2.1 Características generales 31
2.2.2.2 Efectos y aplicaciones de los carotenoides 34
2.2.2.3 Identificación y cuantificación de carotenoides 34
5
2.3. Extracción de Compuestos naturales 37
2.3.1 Métodos de extracción 37
2.3.1.1 Extracción mediante fluidos supercríticos. 38
a) El CO2: Fluido supercrítico. 43
2.3.1.1.1 Antecedentes de extracción con fluido supercrítico. 44
a) Aplicación en alimentos 45 2.3.1.2 Extracción de capsaicinoides y carotenoides mediante enzimas 47
2.3.1.2.1 Celulasa. 48
2.3.1.2.2 Aspergillus niger. 51
2.4 Cromatografía 51
2.4 Cromatografía: Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC). 52
III. MATERIALES Y METODOS 55 3.1 Lugares de Ejecución. 55
3.2 Materiales. 55
3.2.1 Materia prima. 55
3.2.2 Equipos e instrumentos 56
3.2.3 Materiales varios 57
3.2.4 Reactivos 57 3.3 Métodos 58 3.3.1 Proceso de extracción de capsaicinoides y carotenoides de ají ojo
de pez y habanero por SC– CO2
58
3.3.1.1 Acondicionamiento de la muestra 58
3.3.1.2 Extracción con CO2 supercrítico de oleorresina de ají ojo de pez y habanero.
60 3.3.1.3 Determinación del espectro de capsaicinoides y carotenoides del ají
ojo de pez y habanero.
60 3.3.1.4 Cuantificación de capsaicinoides y carotenoides por cromatografía
liquida de alta eficiencia (HPLC)
60 3.3.1.5 Diseño experimental Estadístico: Extracción por SC-CO2 62 3.3.2 Proceso de extracción de capsaicinoides y carotenoides de ají
habanero y ají ojo de pez por extracción biocaltalítica.
64
3.3.2.1 Acondicionamiento de muestra 66
6 3.3.2.2 Proceso de extracción enzimática de oleorresina de ají ojo de pez y
ají habanero
66 3.3.2.2.1 Producción de celulasa de Aspergillus niger ATCC10864 66 3.3.2.2.2 Hidrólisis celulítica de tejido de dos variedades de ajíes: ají ojo de
pescado y habanero
66 3.3.2.2.3 Extracción de oleorresina con solvente de tejido seco hidrolizado
de ajíes: ají ojo de pez y habanero
67 3.3.2.3 Determinación del espectro de capsaicinoides y carotenoides del ají
ojo de pez y habanero.
68 3.3.2.4 Cuantificación de carotenoide y capsaicinoides por cromatografía
liquida de alta eficiencia (HPLC).
68 3.3.2.5 Diseño experimental estadístico: Extracción enzimática 69 IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES
73
4.1 Extracción convencional de oleorresina de ají ojo de pez y habanero. 73 4.2 Proceso de extracción con fluido CO2 supercrítico de ají ojo de pez y
habanero
76
4.2.1 Acondicionamiento de la materia prima 76
4.2.2 Extracción de oleorresina de ají ojo de pez y habanero con CO2 supercrítico
78 4.2.3 Determinación de capsaicinoides totales y sus fracciones de oleorresina
de ají ojo de pez y habanero
79 4.2.4 Determinación por HPLC de carotenoides totales y sus fracciones de
oleorresina de ají ojo de pez y ají habanero
88 4.3 Proceso de extracción de oleorresina por hidrólisis enzimática. 98
4.3.1 Acondicionamiento de muestra 98
4.3.2 Extracción de oleorresina por hidrólisis enzimática y solvente orgánico
98 4.3.2.1 Actividad enzimática de la celulasa producida 98
4.3.2.2 Hidrólisis celulolítica 100
4.3.2.3 Tratamiento con solvente orgánico del tejido de ají hidrolizados 102 4.3.3 Determinación de fracciones de capsaicinoides de ají ojo de pez y
habanero
104 4.3.4 Determinación de carotenoides totales y sus fracciones de oleorresina
de ají ojo de pez y habanero
112 4.4 Rendimiento de capsaicinoides y carotenoides totales y sus fracciones
de ají ojo de pez y ají habanero por SC-CO2 e hidrólisis enzimática
122
7
V. CONCLUSIONES 129
VI. RECOMENDACIONES 131
VII. BIBLIOGRAFÍA 132
Apéndice 145
ANEXO A, B y C 145
8 ÍNDICE DE CUADROS
Pág.
Nº 1: Producción mundial del ají por hectárea 18
Nº 2: Volumen de producción y exportación de los ajíes en el Perú
19 Nº 3: Composición y valor nutritivo de los ajíes. 20 Nº 4: Tabla de Unidades de grado Scoville de Capsaicina 28 Nº 5: Estructuras y características de los carotenos comunes en los
alimentos.
33 Nº 6: Estructuras y características de las xantofilas comunes en los
alimentos.
33 Nº 7: Métodos empleados para la extracción de compuestos naturales
(pigmentos).
38 Nº 8: Propiedades físicas de un fluido supercrítico 39 Nº 9: Propiedades de algunas sustancias en estado supercrítico. 40
Nº 10: Solubilidad de β -caroteno en presencia de CO2 -Supercritico. 42 Nº 11: Solubilidad de capsaicina en presencia de CO2 -supercrítico. 42 Nº 12: Compuestos extraídos usando el CO2 - Supercrítico como
solvente.
45
Nº.13: Aminoácidos presentes en celulasas 48
Nº 14: Características del Aspergillus niger, descripción (a) micro y (b) Macroscópica.
51 Nº 15: Diseño experimental para capsaicinoides en CO2 – Supercrítico. 63
Nº 16: Diseño experimental para carotenoides en CO2 – Supercrítico. 64 Nº 17: Diseño experimental para capsaicinoides en extracción enzimática 71
Nº18 : Diseño experimental para capsaicinoides en extracción enzimática 72 Nº 19: Cantidad de oleorresina obtenida por soxlhet
del ají ojo de pez y ají habanero.
73 Nº20: Cantidad de carotenoides y capsaicinoides obtenidas de la
oleorresina de ají ojo de pez habanero por método convencional.
75 Nº 21: Características de la materia prima acondicionada 77 Nº 22: Cantidad de oleorresina obtenida en diferentes tratamientos SC-
CO2 del ají ojo de pez y habanero
78 Nº 23: Tiempos de retención, área y % de área de
capsaicinoides en ají ojo de pez y ají habanero
82 Nº 24: Fracciones de capsaicinoides obtenidas por extracción 83
9 supercrítica de presentes ají ojo de pez y ají habanero.
Nº 25: Análisis de varianza (ANVA) y comparación de rangos multiples Duncan en los 8 tratamientos obtenidos en la extracción por SC- CO2 de capsaicinoides ají ojo de pez y ají habanero.
85 Nº 26: Tiempos de retención área y % de área de carotenoides en ají ojo
de pez y ají habanero.
91 Nº 27: Fracciones de carotenoides por extracción supercrítica presentes
en ají ojo de pez y ají habanero
92 Nº28: Análisis de varianza (ANVA) y comparación de rangos múltiples
Duncan en los ocho tratamientos obtenidos en la extracción por SC-CO2 de carotenoides de ají ojo de pez y habanero.
94
Nº 29:Caracteristicas de la materia prima acondicionada para la hidrolisis enzimática
98
Nº 30: Actividad celulítica 100
Nº31: Cantidad de oleorresina obtenida en ocho tratamientos extracción enzimática del ají ojo de pez
103 Nº32: Cantidad de oleorresina obtenida en ocho tratamientos extracción
enzimática del ají habanero
103 Nº33: Tiempos de retención, área de fracciones de capsaicinoides del ají
habanero y ají ojo de pez
107 Nº 34: Fracciones de capsaicinoides y grados Scoville (SHU) por
extracción enzimática presentes en ambas muestras 108 Nº35: Análisis de varianza (ANVA) y prueba de rango múltiple Duncan
de los 8 tratamiento por extracción enzimática del ají ojo de pez y ají habanero
109
Nº36: Tiempos de retención de carotenoides obtenido del perfil cromatográfico del ají ojo de pez y ahí habanero
116 Nº37: Fracciones de carotenoides obtenidas por extracción enzimática
presentes e el ají ojo de pez y ají habanero
117 Nº38: Análisis de varianza (ANVA) y prueba de rango múltiple Duncan
de los ocho tratamientos en extracción enzimática del ají ojo de pez y ají habanero
118
Nº39: Comparación de ambas técnicas con relación al rendimiento de extracción de oleorresina de ají ojo de pez y habanero
122 Nº40: Porcentaje obtenido de cada fracción de carotenoides (a) y
capsaicinoides (b) por tipo de extracción en cada muestra analizada.
123 Nº41: Capsaicinoides y carotenoides totales obtenidas en cada
extracción y muestra.
127
10 INDICE DE FIGURAS
Pág
Nº 1: Forma e identificación del Capsicum chínense y sus variedades. 16 Nº 2: Capsicum chínense y sus variedades de la provincia de Oxapampa. 23
Nº 3: El esqueleto base de los capsaicinoides 26
Nº 4: A: Molécula de capsaicina; B: Molécula de dihidrocapsaicina.
27 Nº 5: Estructura molecular de otros capsaicinoides presentes en el ají
(Capsicum chínense).
27 Nº 6: Espectro visible de los carotenoides en ajíes de color amarillo(a) y rojos
(b).
35
Nº 7: Comparación de espectro de carotenoides con resultados en HPLC. 36 Nº 8: Diagrama de fases sólido/líquido/gas. 40
Nº 9: Grafico de circulación del CO2 en sus diferentes fases y las etapas para una extracción por fluido supercrítico.
44
Nº 10: Rendimiento de celulasa producido con Aspergillus niger en biopeliculas
49 Nº 11: Hidrólisis de la celulosa 50 Nº 12: Diagrama de flujo de la extracción por SC-CO2 70 de oleorresina de Capsicum chinense
59 Nº 13: Diagrama de flujo de la extracción biocatalitica de oleorresina de
Capsicum chinense.
65 Nº14: Espectro de carotenoides en ají ojo de pez y habanero. 74 Nº 15: Perfil cromatográfico de capsaicinoides extraídos
por SC -CO2: estándar, ají ojo de pez y habanero.
80 Nº 16: Perfil cromatográfico de carotenoides extraídos
por SC -CO2: estándar, ají ojo de pez y habanero
89 Nº 17: Biopelícula de celulasa y extracto enzimático 99 Nº 18: Cinética de liberación de azucares reductores de tejido de ajíes
durante la hidrolisis enzimática
100 Nº 19: Cromatograma de capsaicinoides extraídos por acción enzimática. 105 Nº 20: Cromatograma de carotenoides extraídos por acción enzimática. 114 Nº 21: Comparación de porcentajes obtenidos de fracciones de
capsaicinoides en ambas extracciones.
125 Nº 22: Comparación de porcentajes obtenidos de fracciones de carotenoides
en ambas extracciones.
126
11 INDICE DE ABREVIATURAS
Abs Absorbancia.
AOAC Asociación Oficial de Químicos Analistas.
BHT 2,6-di-ter-butil-p-cresol (butilhidroxitolueno).
HPLC Cromatografía liquida de alta resolución.
°C Grados Celsius.
ES. Error estándar.
FPA Actividad de papel filtro.
g Gramos.
kg Kilogramo.
mg ms
Miligramos.
Muestra seca
mL Mililitros.
Min Minutos.
ppm Partes por millón.
pH Potencial de hidrógeno.
SFE Extracción por fluido supercrítico.
SFC-CO2 Extracción por fluido supercrítico CO2. SC-CO2 Extracción supercrítica con CO2
SHU Unidad de Grados Scoville.
T R Tiempo de Retención.
UV-Vis Ultravioleta – visible.
µ g Microgramos.
λ Longitud de onda.
12 RESUMEN
El trabajo de investigación tuvo como finalidad realizar la extracción de capsaicinoides y carotenoides del Capsicum chínense, variedades: ají habanero y ají charapita u ojo de pez, por dos métodos de extracción. Estas muestras fueron acondicionadas, lavadas, secadas (40ºC) hasta obtener una humedad 10 - 12% ± 2, luego fueron molidas y tamizadas hasta obtener un tamaño de partícula menor a 0.425 mm para la extracción enzimática y entre 1 < Ǿ < 0,425 mm de tamaño de partícula para la extracción con CO2-supercrítico (SC – CO2).
En la extracción biocatalítica se utilizó 2,5 g ± 0,5 de muestra acondicionada, y fue sometida a una hidrólisis usando celulasa con 2 162 ±150 FPA (UIL-1) de actividad enzimática, en proporciones muestra/enzima de 1/15 y 1/20; agitaciones de 150 y 170 rpm; en tiempos de 2 y 4 horas, todo esto a una temperatura de 35ºC, se obtuvo una pasta que fue secado a 40 °C hasta reducir a una humedad considerable para el manipuleo, ésta se llevo a lixiviación en una solución de hexano – etanol (75/25 ) en proporciones de muestra/solución (1/50), con agitación de 170 rpm, 40 º C x 3 h, posteriormente se filtró y evaporó al vacío obteniéndose como resultado oleorresina de la muestra.
En la extracción con SC - CO2 se tomaron 25 g ± 2 de muestra acondicionada que fue sometido a presurización en el equipo de fluido supercrítico con presiones de 200 y 400 bar; temperaturas de 35 y 55 ºC; por un tiempo de 1,5 y 3 horas; luego se despresurizó a 12 bar y a 40 ºC, luego fue lavado con etanol (99 % pureza) y finalmente fue evaporado al vacío, resultando oleorresina de la muestra.
Las oleorresinas obtenidas de ambas extracciones fueron empleados en los métodos adaptados de AOAC 970.64 e ISO 7543 para aislar carotenoides y capsaicinoides respectivamente, luego se uso el método de cromatografía líquida de alta eficiencia
13 (HPLC) para obtener los respectivos cromatogramas para cuantificar las fracciones de carotenoides y capsaicinoides presentes en cada muestra de ají. En ambas extracciones se aplicó el diseño completamente aleatorio DCA con arreglo factorial de 23, (p = 0,05) con un nivel de significancia de 5 % y el análisis de prueba de rangos múltiples por DUNCAN para la evaluación factores, combinación de factores y tratamientos. Los resultados demuestran que ambas extracciones son viables y se obtienen mayores resultados frente a una extracción convencional, la extracción supercrítica obtuvo mejores resultados en selección y obtención de biocomponentes (carotenoides y capsaicinoides) con alta pureza en comparación a la extracción biocatalítica.
La extracción con SC-CO2 contiene mayor cantidad de capsaicinoides totales en el ají ojo de pez, siendo de 29 665,16 mg/100 g ms con un picor de 4 449 774,17 SHU, el ají habanero tiene 5954,31 mg/100 g ms capsaicinoides totales, llegando a tener una pungencia de 893 147,04 SHU.
Con respecto a los carotenoides el ají ojo de pez y habanero mostraron 2 520,73 y 750,07 mg/100 g ms de carotenoides totales respectivamente, 1 281,82 y 300,55 mg/100 g ms de β - Caroteno, 179.59 y 64.47 mg/100 g ms de β -Criptoxantina respectivamente, 820,57 y 223,11 mg/100 g ms de Zeaxantina, 238,76 y 131,94 mg/100 g ms de Capsantina, respectivamente. Todos estos resultados validaron de esta manera la hipótesis de trabajo, pues utilizando tecnologías extractivas como extracción enzimática o biocatalítica y fluido supercrítico con CO2 fue posible determinar el contenido de capsaicinoides y carotenoides del Capsicum chinense;
estos ajíes son las mas pungentes y contienen mayor cantidad de carotenoides, con estos resultados se ha generado conocimiento científicos y tecnológico de nuestra flora local, que servirá de punto de partida para transformar el conocimiento adquirido y mejorado en valor económico.
14 ABSTRACT
The research aimed to perform the extraction of capsaicinoids and carotenoids of Capsicum chinense varieties and Hot Chili habanero pepper or fisheye, two extraction methods. These samples were conditioned, washed, dried (40 °C) to a moisture 10 -12% ± 2 then were ground and sieved to obtain a particle size less than 0.425 mm for enzymatic extraction and 1 < Ǿ < 0,425 mm for the extraction with SC-CO2.
In biocatalytic extraction was used 2,5 g ± 0,5 of conditioned sample, and was subjected to hydrolysis using cellulase with 2 162 ± 150 FPA (UIL-1) enzyme activity in proportions shows / enzyme 1/15 and 1/20; agitation of 150 and 170 rpm;
at times of 2 and 4 hours, all at a temperature of 35 °C, was obtained paste was dried at 45 °C to reduce to a considerable moisture to the handling, it took leaching.
A solution of hexane - ethanol (75/25) in proportions of sample/solution (1/50), with agitation of 170 rpm, 40 °C x 3 h, then filtered and evaporated in vacuo resulting oleoresin sample.
In the extraction with SC - CO2 were taken 25 g ± 2 conditioned sample was subjected to pressurization equipment supercritical fluid pressures of 200 and 400 bar, temperatures of 35 and 55 ºC, for a time of 1,5 to 3 hours, then was depressurized to 12 bar and at 40 °C, then washed with ethanol (99% purity) and was finally evaporated under vacuum, the resulting oleoresin sample.
Oleoresins derived from both extractions were employed in the methods adapted from AOAC 970.64 and ISO 7543 for isolating carotenoids and capsaicinoids respectively, then using the method of high performance liquid chromatography (HPLC) for the respective chromatograms for carotenoid fractions quantifying and capsaicinoids present in each sample of chili. In both extractions were applied DCA
15 completely randomized design with factorial arrangement of 23, (p = 0.05) with a significance level of 5% and test analysis by Duncan's multiple range for the evaluation factors and combination of factors treatments.
The results demonstrate that both extractions were viable and better results are obtained versus conventional extraction, supercritical extraction outperformed in selecting and obtaining biocomponents (carotenoids and capsaicinoids) with high purity in comparison to the extraction.
The SC-CO2 extraction contains more total capsaicinoids in chili fisheye, being 665,16 mg/100 g of 29 ms with an itchy 774,17 4449 SHU, habanero pepper is 5954,31 mg/100 g ms total capsaicinoids, getting to have a pungency of 893 147.04 SHU.
Regarding carotenoids fisheye chili and habanero showed 2 520,73 and 750,07 mg/100 g of total carotenoids ms respectively, 1 281,82 and 300,55 mg/100 g ms of β - Carotene, 179,59 and 64.47 mg/100 g of β-cryptoxanthin ms respectively, 820.57 and 223,11 mg/100 g ms Zeaxanthin, 238,76 and 131,94 mg/100 g of Capsanthin ms, respectively. These results thus validated the hypothesis, then using technologies such as extractive or enzymatic biocatalytic extraction and supercritical fluid CO2 was possible to determine the content of carotenoids capsaicinoids and Capsicum chinense, and these are most pungent chili and contain more carotenoids, with these results has generated scientific and technological knowledge of our local flora, which will serve as a starting point for transforming the knowledge acquired and improved economic value.
16 I. INTRODUCCIÓN
El género Capsicum es originario del nuevo mundo y comprende 25 especies de las cuales cinco han sido domesticados y han dado origen a numerosos cultivares; entre estos el Capsicum chínense, en la región amazónica es uno de los géneros mas cultivados por sus etnias y es parte del patrimonio cultural de la región, lo cual ha dado lugar a variedades adaptadas en diferentes condiciones ambientales de acuerdo a los requerimientos agro culturales donde se cultiva. La utilización sostenible de esta diversidad genética y la oferta natural del ecosistema amazónico, constituye una garantía rentable en la medida que exista una tecnología apropiada para su aprovechamiento como se pretende en este trabajo, la tecnología extractiva por vía enzimática y por fluidos supercríticos están siendo utilizados para obtener diferentes biocomponentes naturales. Los ajíes contienen capsaicinoides y carotenoides los cuales son de interés medicinal, farmacológico, alimentario y analítico, aislado en estado puro es utilizado en estos sectores. Asimismo estos compuestos poseen propiedades antioxidantes. El Capsicum chínense es uno de los ajíes mas picantes, tiene un alto contenido de capsaicinoides, este compuesto tiene propiedades anti cancerígenas, antiartríticas, antinflamatorias, neuropatías, diabéticas y analgésicas) y un alto contenido de carotenoides el cual esta relacionado con el aumento del sistema inmune y una disminución de enfermedades degenerativas; por estas bondades toma interés revalorar químicamente el contenido de capsaicinoides y carotenoides de ají ojo de pez y ají habanero.
A la fecha no ha recibido la suficiente atención científica-tecnológica, ni en términos económicos ya que en el mercado externo la capsaicina (1g) pura (> 95 %) que tiene un precio de S/. 3000 - S/. 4000 y el β-caroteno (> 98 % de pureza), 550 miligramos =
$300 - $ 400. Esta realidad, hace necesario el uso de tecnologías extractivas como extracción por fluido supercrítico y biocatalítica) que permitan aislar compuestos naturales de alta pureza.
17 Existen diferentes procesos para la obtención de extractos naturales, pero son contaminantes y principalmente obtener extractos libres de disolventes, el consumo de productos sintéticos es cada vez menor ya que los productos naturales presentan mayores ventajas, principalmente en la salud de los seres humanos, debido a ello se busca un método de extracción que disminuya el grado de contaminación al extraer carotenoides y capsaicinoides.
La extracción por fluido de CO2 y la extracción por acción biocatalítica, son métodos no contaminantes para aislamiento de oleorresina, de ajíes, y sus fracciones de carotenoides y capsaicinoides.
En el presente trabajo se realizo la extracción con fluido supercrítico y acción enzimática, además se cuantificó el contenido de capsaicinoides y carotenoides por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) del Capsicum chinense, de la provincia de Oxapampa, Departamento de Pasco. Los objetivos del trabajo de tesis fueron:
Determinar la cantidad de capsaicina, nordihidhocapsaicina y dihidrocapsaicina extraído mediante tecnologías extractivas de fluido supercrítico y acción biocatalítica presentes en el ají habanero y ají ojo de pez.
Determinar la cantidad de β-caroteno, β-criptoxantina, capsantina y zeaxantina extraído mediante tecnologías extractivas de fluido supercrítico y acción biocatalítica presentes en el ají habanero y ají ojo de pez.
Evaluar las variables operativas de cantidad de enzima, agitación y tiempo de hidrólisis en el proceso de extracción por catálisis enzimática,
Evaluar las variables operativas de presión, temperatura y tiempo; en la extracción por fluido supercrítico de CO2.
Cuantificar por cromatografía líquida de alta eficiencia, las fracciones de capsaicinoides y carotenoides obtenidas en ambas extracciones.
18 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Descripción general de la materia prima 2.1.1 El ají (Capsicum sp), origen.
El ají es una hortaliza cuyo género Capsicum es originario de los trópicos americanos (Pickersgill, 1997; Walsh y Hoot, 2001; Votaba, Baral y Bosland, 2005); este género agrupa aproximadamente de 20 a 30 especies, basado a los criterios de diferentes investigadores (Esbaugh, 1993; De Witt y Bosland, 1993; Bosland, 1996; Yamamoto y Nawata, 2005 y Votaba, Baral y Bosland, 2005). Entre estos, cinco fueron domesticados: Capsicum annuum L., Capsicum frutescens L.; Capsicum chinense Jacq., Capsicum pubescens Ruiz & Pav. y Capsicum baccatum L .var pendullum (Esbaugh 1993; Bosland, 1994; Pickesrsgill, 1997; Paran, Aftergoot y Shifriss, 1998;
Toquica et al., 2003), los cuales fueron seleccionados para la siembra por parte de comunidades precolombinas, de manera independiente en regiones separadas del Sur, Centro y Norte América (Votaba, Baral y Bosland, 2005). Con relación a las anteriores entidades biológicas, se ha indicado que C. annuum, C. chinense y C. frutescens podrían ser formas politípicas de la misma especie (Toquica et al, 2003), lo cual se apoya en la compatibilidad genética que ocurre entre los taxa (Macrae et al., 1993).
Hoy día, poblaciones silvestres y cultivadas se distribuyen desde el área amazónica, hasta México (León, 1987). Pickersgill, citado en Long-Solís, (1998), plantea una difusión del C. chínense desde la cuenca amazónica hasta la costa del Perú, al mismo tiempo que se extendía la técnica para hacer cerámica. Hay restos de esta especie de ají en Huaca Prieta y Punta Grande, Perú; en el nivel estratigráfico anterior a la aparición de la cerámica entre 122 a.C. y 150 d.C. también hay hallazgos arqueológicos de la cultura Chavín en la costa de Perú, 1 200 a.C., indican que es un cultivo muy antiguo (Brack, 2002).
19 2.1.2 Características generales
El fruto del ají es una baya hueca, semicartilaginosa y deprimida, de color variable (verde, rojo, amarillo, naranja, violeta o blanco); algunas variedades van pasando del verde al anaranjado y al rojo a medida que van madurando. Su tamaño es variable, pudiendo pesar desde escasos gramos, hasta más de 500 gramos. Su forma y tamaño son variados (Figura 1). Las semillas se encuentran insertas en una placenta cónica de disposición central. Son redondeadas, ligeramente reniformes, de color amarillo pálido y longitud variable entre 3 y 5 milímetros. En conjunto la forma externa del fruto presenta una gran diversidad de tipos. Siendo el descriptor el consejo internacional de Recursos Filogenéticas (CCI, 2003) y podrían distinguirse entre alargadas, oblongas y redondeadas, cónicas, acampanadas y rectangulares.
Figura 1: Forma del fruto: a. alargada: b. oblonga: c. redonda: d. cónica: e.
acampanulada: f acampanulada y rectangular e identificación del Capsicum chínense y sus variedades.
Fuente: Consejo Internacional de Recursos Geneticos. (2003)
a)
b)
d)
f)
c)
e)
20 2.1.3 Aspectos botánicos
La clasificación botánica de los Capsicum ha sido difícil, debido al alto número de variedades, a la falta de características definidas y a que no existen barreras marcadas para la hibridación de algunas especies. Por esto los criterios para clasificar Capsicum han variado, desde algunos antiguos que reconocen 20 especies, hasta uno moderno que sostiene que existe sólo una (Servicio de Conservación de Recursos Naturales, 2003).
INFORMACION TAXONOMICA Reino: Plantae – Plantas.
Subreino: Tracheobionta – Plantas Vasculares.
Superdivisión: Spermatophyta – Plantas con semillas.
División: Magnoliophyta – Plantas con flores.
Clase: Magnoliopsida – Dicotiledóneas.
Subclase: Asteridae.
Orden: Solanales.
Familia: Solanaceae.
Género: Capsicum L.
Especie: Capsicum chinense Jacq. (Servicio de Conservación de Recursos Naturales, 2003).
2.1.4 Producción Mundial y en el Perú.
El cultivo del ají se ubica entre las siete hortalizas más cultivadas en el mundo con una producción mundial para el año 2006 esta más de 25 millones de toneladas (Ton). El principal productor es China con 12 531.00 (Ton), México produce 1853,16 (Ton).
El Perú registra el rendimiento y volumen de producción mundial del ají por hectárea de 61 mil toneladas de ajíes (entre ají panca, rocoto y paprika) por año.
21 Cuadro 1: Principales países productores de ají
País Área (ha) Rendimiento (Ton/ha)
Producción (Ton)
Alergia 20 10 200
Argentina 6,117 20,43 125
Australia 2,838 19,84 56,319
Bulgaria 20 8 160
Chile 3,75 17,07 64
China 612,8 20,45 12531
Corea del Norte
70 6 420
Corea del Sur 26 2,31 60
Cuba 9 10,22 92
Egipto 29 15,86 460
España 22,5 42,36 953,2
Estados Unidos
34,4 28,42 977,76
México 140,693 13,17 1853,16
Nigeria 91 7,91 720
Perú 7,5 8,13 61
Rumania 19,000 12,47 237,000
Serbia 21,000 8,33 175,000
Sri Lanka 15 3,33 50
Túnez 20 12,85 257,000
Turquía 88 19,83 1,745,000
Ucrania 15,000 8,93 134,000
Venezuela 5,000 17,6 88,000
Otros países 112,869 768,791
Total 1'696,891 25'015,498
Fuente: Food and Agriculture Organization FAO. (2010)
Los cultivares de hortalizas como el Capsicum es una de las principales en auge en el Perú (Cuadro 1), para el año 2013 aproximadamente se estiman 18 000 Hectáreas a nivel nacional para cultivos de pimientos anchos, piquillo, jalapeño, paprika, guajillos, etc., siendo considerada una especie cultivable de importancia económica, consumido de forma muy diversa por la gastronomía nacional e internacional y por el sector industrial alimentario farmaceútico, cosmética entre otras, que son materia de investigación de importancia económica y científica.
22 Según Aduanas la evolución de las exportaciones de pimiento seco (páprika) tuvieron un incremento de 58,9 toneladas en 1 995 a 15,074 toneladas en el año 2 002 (Cuadro 2) con un valor FOB de US$ 19 425,627 que fueron comercializados por 60 empresas a 18 mercados (España, México, Chile, Argentina, Francia, Estados Unidos, Uruguay, Alemania, etc.). Así como la paprika los demás ajíes cultivados se han incrementado debido a su demanda internacional.
Cuadro 2: Crecimiento en el volumen de producción peruana por año de los ajíes exportados al extranjero
Año
Volumen de producción
(t)
valor FOB (US$)
Precio (US$
/g)
Nº de empresa
Nº de mercado
2002 15 074 19 425,62 1,29 60 18
2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
18 023 20 895 21 546 22 589 22 852 23 458 23 8974 26 8356
20 356,89 21 405,89 25 682,65 28 912,23 30 000,98 31 035,89 33 859,25 35 789,26
1,54 1,56 1,48 1,49 1,59 1,60 1,64 1,63
65 68 69 71 73 77 82 94
20 22 23 25 28 29 33 36 Fuente: Instituto Nacional de Investigación y Extensión Agraria (INIA) 2010
En el año 2014, la producción de páprika será de 50 000 toneladas lo que representará aproximadamente US$ 72 millones y en el año 2020 se estima producir 100 000 toneladas.
Los Capsicum se cultivan en los valles de Tacna, Majes, Ica, Chincha, Cañete, Huaral, Barranca, Virú, Paiján, Motupe y Piura, donde un alto porcentaje de quienes cultivan este producto son agricultores ocasionales, por lo que las técnicas de cultivo están poco desarrolladas, estimándose costos de producción que van desde 1,774 a 3,221 dólares/hectárea, dependiendo del nivel tecnológico.
Por ejemplo el precio de páprika se determina en el mercado internacional con tendencia a subir por el incremento de la demanda por ser un producto natural.
23 Páprika seco (Perú): 1,0 – 1,4 dólares / kilo y Páprika (Mercado Internacional): 1,7 – 1,9 dólares / kilo.
2.1.5 Composición química proximal de los ajíes
La composición químico proximal de los ajíes es muy variado, dependen de cada especies de ajíes y sus variedades, en el Cuadro Nº 3, observamos la composición de los ajíes en el Perú (por 100 g de muestra).
Cuadro 3: Composición y valor nutritivo de los ajíes
Componentes Cantidad
Agua (g) 85 a 89
Valor energético (cal) 40 a 60 Proteínas (g) 0,9 a 2,5
Grasas (g) 0,7 a 0,8
Carbohidratos (g) 8,8 a 12,4
Fibra (g) 2,4 a 2,9
Calcio(mg) 21 a 31
Fosforo(mg) 21 a 58
Hierro(mg) 0,9 a 1,3
Caroteno(mg) 2,5 a 2,9 Riboflavina (mg) 0,11 a 0,58 Niacina(mg) 1,25 a 1,47 A. ascórbico (mg) 48 a 60.
Fuente: Brack (2003).
2.1.6 Productos elaborados a partir de ajíes
En el ámbito internacional es innumerable el número de productos a base de ají habanero que se comercializan, secos enteros y en polvo. Algunas marcas comerciales que ofrecen estos productos son: Alacena rocoto, Alacena ají amarillo, Alacena crema a la huancaína. Industrias “TIO RICO”: rocoto en polvo, panca sin picante; Sazón Lopeza: panca sin picante.
24 a) Oleorresina:
Es el aceite resultante del proceso de extracción y concentración del pimiento y del pimentón. Es viscoso, tiene color rojo o amarillo intenso y aroma típico, fluido a temperatura ambiente y muy soluble en aceite. De acuerdo con la Comunidad Económica Europea (CEE, 2008) son "extractos de especias de los que se ha evaporado el disolvente de extracción, dejando una mezcla del aceite volátil y el material resinoso de la especia". Posee colorantes orgánicos naturales permitidos para uso alimentario, según las normativas de cada país. Durante la extracción se evita la contaminación con bacterias, hongos, insectos o pérdida del color, a fin de lograr un adecuado almacenamiento. Además, poseen un nivel de picor uniforme y su empleo facilita el control en el resultado final del producto. Por otro lado, también aporta ventajas económicas, puesto que no requieren que el fruto sea de primera categoría (Long-Solís, 1998).
La oleorresina esta constituida químicamente por componentes lipofílicos, como mono, di y triglicéridos; ácidos grasos libres; pigmentos (carotenos con estructura hidrocarbonada o xantofilas con oxígeno); aceites esenciales; resinas ácidas y sus ésteres; terpenos y productos de oxidación o polimerización de estos terpenos; ceras, esteroles vegetales y en mayor o menor medida capsaicinoides (Contreras-Padilla y Yahia, 1998). Sus otras vitaminas liposolubles son los tocoferoles con actividad vitamina E (Daood et al., 2002; Gnayfeed et al., 2001).
Una parte importante de estos compuestos liposolubles de la oleorresina procedentes de la parte carnosa de los frutos y las semillas del pimiento, que tienen actividad antioxidante (Levy et al., 1995). Los carotenoides están en diferente proporción en una muestra roja o amarilla, en oleoresina roja predominan la capsorubina, en ají amarillo, además del β caroteno se encontraría luteína (la proporción de carotenoides es diferente según la muestra procedente). Dentro de los carotenoides en oleoresina, la capsantina y capsorrubina (pigmentos rojizos) constituyen entre alrededor del 60 ± 4 % y 6 %, respectivamente. Los carotenoides de pigmentos amarillos son‚ β criptoxantina o
25 zeaxantina (5,5 ± 1 % y 11 ± 2 % respectivamente) y violaxantina (± 4 %). El color amarillo-anaranjado lo aporta el 8% aproximadamente del carotenoide hidrocarbonado caroteno (Burns et al., 2003; Mínguez-Mosquera y Hornero-Méndez, 1993; Pérez- Gálvez et al., 1999).
La alta viscosidad de la oleoresina hace necesario que para su análisis debamos recurrir a técnicas de arrastre de volátiles, especialmente si esta fracción es importante, destacan el 1,3-dimetilbenceno y el elemeno en algunos Capsicum.
El contenido de capsaicinoides depende de la variedad de Capsicum picante. Algunos de los capsaicinoides (vanillilamidas o alcaloides) encontrados en la oleoresina son la capsaicina o E-8-metil-N-vanillil-6-nonenamida, dihidrocapsaicina, norhidrocapsaicina, homocapsaicina, monodihidrocapsaicina y otros siete más como la nonivamida, (Burns et al., 2003; Kirchbaum- Titze et al., 2002a; En frutos maduros la monodihidrocapsaicina generalmente está ausente (Kirchbaum et al., 2002b).
Narashimha et al. (2006) identificaron los ácidos grasos unidos al grupo amida de los capsaicinoides, liberando dichos ácidos grasos en la forma de ésteres metílicos.
Destacaron el 8-metilnonanoato de la dihidrocapsaicina y el E-8-metilnon-6-enoato de la capsaicina. Appendino et al. (2005) mostraron la importancia de los dobles enlaces de las vanillamidas, ya que dependiendo del ácido graso al que se una la vanillamida, la actividad de la capsaicina podía verse reforzada. Por ejemplo la del ácido oleico (olvanil) es más potente que la capsaicina, mientras que la del esteárico es inactiva.
Igualmente, la unión de grupos –OH secundarios a este doble enlace, o la sustitución del mismo por un anillo de ciclo propano, podría originar compuestos útiles para farmacología.
2.1.7 Capsicum chínense, Características generales.
El fruto puede ser de forma esférica o alargada, con pericarpio liso o arrugado. Ciertos cultivares tienen forma de trompo, con áreas hundidas. El color del fruto puede ser
26 blanco, anaranjado, amarillo, salmón, rojo o café. En la base del fruto es característico que el cáliz presente una constricción anular. Las semillas son arrugadas, color paja irregularmente con bordos salientes y ondulados (Cano, 2003)
La variabilidad (Figura 2) inter e intra especies que se presenta en el Capsicum puede atribuirse a la hibridación (León, 1987).
Las muestras analizadas son de la especie del Capsicum chinense, 2 variedades como el ají charapita u ojo de pescado y ají habanero peruano (Figura 2).
Figura 2: Especie de Capsicum chínense y sus variedades de la provincia de Oxapampa. Ají habanero (a) y ojo de pez (b).
Los usos de los frutos ya sea en fresco o procesados son múltiples. Aparte del consumo fresco, cocido o como condimento o “especia” en comidas típicas de diversos países, existe una gran gama de productos industriales que se usan en la alimentación humana;
congelados, deshidratados, encurtidos, enlatados, pastas y salsas (Rengifo, 2003).
a)
b)
27 2.1.7.1 Origen
El Capsicum chínense es originario de América del sur, en el Perú según los estudios de Antonio Brack menciono que se encontró a este ají presente en Cueva Guitarrero, Ancash; con una antigüedad de entre 8 000 a 7 500 a. C.
Tras descubrimiento por los europeos se difundió rápidamente hasta el punto que en el siglo XVIII algunos taxonomistas confundieron a China como su lugar de origen y lo llamaron Capsicum chínense, “de los chinos pimienta”
Se considera que C. chinense es la más variable de las especies domesticadas en América. Está estrechamente emparentada con C. frutescens y su distribución en América del Sur es similar. Su área de mayor diversidad es la cuenca Amazónica (Cheng, 1989). De Witt y Bosland (1993), señalan que C. chinense tiene su centro de origen en el Amazonas.
2.1.7.2 Nombres comunes
En los Andes sudamericanos las formas silvestres de C. chinense son conocidas como
“chincha uchú”. En el Caribe, algunos cultivares primitivos se conocen como “ojo de pez” u “ojo de perico”. El C. chinense cultivado se conoce como habanero en Cuba, México, Belice y Guatemala, Catch Bonnet en Jamaica, Ocotillo en las Islas Caimán, Congo Pepper en Trinidad, Banda Mano Jacques en Martinica, en Perú también se le nombra como charapita, habanero peruano, cuerno de toro.
2.1.7.3 Producción en el Perú
La especie C. chinense aparentemente se domesticó primero en el Perú. Sin embargo, hoy día la región de Los Andes se caracteriza principalmente por la presencia de cultivares de C. pubescens y C. frutescens. Los cultivares de C. chinense son comparativamente muy raros en Perú, pero aún existen varias variedades locales en los trópicos peruanos. El cultivar mas renombrado es “Chinchi-uchu” de frutos rojos muy picantes; y un cultivar de frutos amarillos conocidos como “ají limo”. El “ají panca” es
28 particularmente interesante ya que tiene el sabor pleno de C. chinense, pero es poco picante.
2.2. Biocomponentes presentes en el ají: Capsaicinoides y carotenoides
Los biocomponentes son considerados compuestos indispensables para la vida, fundamentalmente debido a las funciones que cumple en nuestro cuerpo, en los animales y plantas. Ellos son los pigmentos, antioxidantes, etc. (Burns et al., 2003) Entre los compuestos con marcadas propiedades biológicas que aparecen en los pimientos destacamos los siguientes grupos de compuestos:
Carotenoides entre los que destacan: xantofilas, β-caroteno, luteína, capsantina, capsorrubina, criptoxantina, zeaxantina, anteraxantina, violaxantina, neoxantina.
Vitamina A.
Vitaminas (B): tiamina (B1), riboflavina (B2), niaciana (B3), piridoxina (B6).
Ácido ascórbico (vitamina C), que se encuentra en concentraciones desde 40 a 250 mg/100 g de pimiento fresco.
Tocoferol (vitamina E), que se encuentra en concentraciones desde 3 a 250 mg/100 g de pimiento seco (Mari, 2002).
Ácidos fenólicos libres (protocatéquico, clorogénico, cumárico, ferúlico, cinámico, cafeico, etc.).
Ácidos orgánicos (málico, oxálico, cítrico, fumárico, quínico, etc.).
Azúcares solubles (glucosa, fructosa, etc.).
Flavonoides (quercetina, luteolina, etc.).
Lípidos.
Compuestos volátiles (aldehídos, cetonas, alcoholes, pirazinas, etc.).
Capsaicinoides (capsaicina, dihidrocapsaicina, entre otros).
Capsinoides (capsiato, dihidrocapsiato, entre otros).
29 2.2.1 Capsaicinoides
2.2.1.1 Características generales.
Los capsaicinoides son alcaloides que en frutos maduros sólo se sintetizan en las células de la superficie de la placenta, los cuales se especializan como glándulas que segregan estos compuestos depositándolos en las semillas y paredes de la capa más interna de la pared frutal llamada endocarpio (Khachik et al., 1986). Iwai et al. (1979), indicaron que el capsaicinoide fue detectado por primera vez 20 días después de floración y depende de las condiciones del cultivo como temperatura, período de exposición de luz y fertilización como ya se menciono.
Los mismos investigadores observaron que los niveles de capsaicinoides no sufren cambios apreciables en las etapas posteriores a la maduración y señalan que la capsaicina y la dihidrocapsaicina son los dos capsaicinoides principales en todas las etapas como muchos autores aseguran (Alpizar et al, 2003).
Por lo general, la capsaicina es el capsaicinoide mayoritario presente en las variedades picantes de ajíes, pero no es extraño encontrar variedades de pimientos en las cuales el capsaicinoide más abundante sea la dihidrocapsaicina.pero también están la nornorcapsaicina, norcapsaicina, homocapsaicina, nornordihidrocapsaicina, nordihidrocapsaicina, y homodihidrocapsaicina.
Figura 3: El esqueleto base de los capsaicinoides.
Fuente: Kirchbaum et al (2002a).
La capsaicina es una sustancia alcalina y aceitosa, que solamente está presente en la placenta de los frutos. Químicamente es 8-metil-N-vainillil-6-enamida. La capsicina tiene la siguiente fórmula: C18H27O3N, con un peso molecular de 305,199 g/g-mol.
30 Forma cristales en forma de aguja, es inodora, con un punto de fusión de 64,5 ºC y un punto de ebullición de 210 –220 ºC. A una presión absoluta de 0,01 mm Hg, se sublima a 115 ºC y presenta su máxima absorción en UV a 227 – 228 nm. Es soluble en éter etílico, alcohol etílico, acetona, alcohol metílico, ácido acético, tetracloruro de carbono, benceno y álcalis calientes. Es insoluble en agua fría
Figura 4: A: Molécula de capsaicina; B: Molécula de dihidrocapsaicina
Fuente: Contreras (1998).
La dihidrocapsaicina tiene la siguiente fórmula condensa: C18H29O3N y un peso molecular de 307,215 g/g-mol, forma cristales de color blanco opaco inodoro con una fuerte pungencia. Su punto de fusión varia entre 65,5 y 65,8 ºC, presenta su máxima absorbencia en UV por debajo de 230 nm y sus propiedades de solubilidad son idénticas a las de la capsaicina (Iwai et al., 1979)
Figura Nº 5: Estructura molecular de otros capsaicinoides presentes en el ají (Capsicum chínense), A): Molécula de nordihidrocapsicina, B): Molécula de
homocapsicina y C): Molécula de homodihidrocapsicina
Fuente: Iwai et al., 1979 A
)
B )
A) B)
C)
31 Una de las características de los ajíes es el picor que tiene (capsaicinoides) y en la escala de las unidades de grado Scoville (Cuadro 4) podemos observar que el Capsicum chinense están dentro de 10 000 y 100 000 siendo los mas altos, pero ¿Qué es escala de unidades Scoville?
La escala de unidades Scoville es un sistema de medición del picor de los ajies inventada por Wilbur Scoville durante la primera década del siglo XX. Su objetivo era determinar la máxima dilución del extracto de chile en la que aún fuera detectable el picor. De esta manera, si un jalapeño (Capsicum chinense) ha sido determinado en 4 500 unidades, significa que se necesitan 4 500 partes de solución para diluir una parte de extracto de jalapeño hasta el punto en que el picor aún pueda ser detectado; si se a hade mas solución, el picor ya no podrá ser detectado. Hoy en día se emplea la cromatografía de líquidos de alta eficiencia para medir el contenido de capsaicina en los ajíes. Este método, mucho mas preciso, mide los niveles de capsaicina en partes por millón que pueden ser convertidas en unidades Scoville (Narasimha, 2006).
Cuadro 4: Tabla de Unidades de Grado Scoville de Capsaicina
Fuente: López (2003).
32 3.2.1.2 Efectos y aplicaciones de los capsaicinoides.
La capsaicina estimula la membrana mucosa de la boca y del estómago, incrementando la secreción salival y la perístasis, lo que estimula el apetito y ayuda a tragar los alimentos secos e insípidos. Además, los chiles intensifican la secreción, tanto nasal y lagrimal como de jugos gástricos. De esta manera, ayudan a la digestión al intensificar la secreción mediante la estimulación del movimiento intestinal. Por si fuera poco, existen tratamientos con ají como ingrediente principal, que se emplean en el control o la eliminación de infestaciones parasitarias. De hecho, los de la sierra poblana preparan una infusión a partir de las hojas y flores del ají para eliminar las lombrices. Incluso se han desarrollado compuestos insecticidas que contienen capsaicinoides. Además, cuando consumimos ají, el organismo reacciona incrementando la circulación sanguínea. El chile también actúa como estimulante en el tratamiento de problemas de presión arterial y estimula también la transpiración.
La capsaicina tiene también propiedades anticoagulantes, previniendo de trastornos causados por coágulos en la sangre, e incluso del endurecimiento de las arterias y ataques cardíacos. El gran aporte de vitaminasA y C que proporcionan los ajíes ayuda a prevenir problemas de las mucosas, encías y dientes y. por supuesto de la vista. Aun más estos participan en la protección contra el cáncer, pues son aun más ricos en vitamina C que los cítricos. Esta vitamina es un antioxidante capaz de neutralizar el daño causado por radicales libre. Por otra parte, ya que los chiles muy picosos incrementan la secreción en los ojos, nariz y boca, estimulan la expectoración a través de un reflejo nervioso similar al involucrado en el vómito, por lo cual, el ají en grandes dosis puede también causar atragantamiento y hasta vómito, pero, en dosis moderadas puede mejorar la expectoración, limpiando los conductos respiratorios de congestión por flemas a la vez que relaja los músculos de la garganta. Los antiguos mexicanos usaban el ají en forma de gárgaras, ungüentos e infusiones, para el asma, la tos, la bronquitis, el resfriado y otros problemas respiratorios (López, 2003)
Antimutagénico y antitumoral: En los últimos años, están apareciendo un gran número de estudios que apuntan al potencial quimiopreventivo que presenta la capsaicina. Se
33 ha comprobado que los extractos de pimientos picantes, o los capsaicinoides aislados bloquean los procesos de carcinogénesis y muta génesis (Narasimha et al, 2006).
Antioxidantes: Los capsaicinoides presentan una actividad antioxidante muy interesante. Se conoce que la capsaicina y la dihidrocapsaicina son capaces de inhibir la peroxidación lipídica catalizada por cationes Fe3+ y la oxidación de lipoproteínas de baja densidad producida por cationes cobre. Este efecto es atribuido a la capacidad de estos compuestos para formar complejos con estos metales reducidos, actuando además como donadores de hidrógenos. La capsaicina puede también prevenir la oxidación del ácido oleico a altas temperaturas al igual que previene la formación de hidroperóxidos lipídicos provenientes de la auto-oxidación del ácido linoleico (Bosland, 1996).
Analgésico tópico contra el dolor: Una de las propiedades fisiológicas más importantes de la capsaicina es su efecto selectivo sobre la zona periférica del sistema nervioso, particularmente sobre las neuronas aferentes primarias. La capsaicina tiene el efecto de reducir la transmisión del impulso nervioso de dolor, lo que la hace una herramienta muy versátil en el estudio de este mecanismo. Por ello, la capsaicina es usada terapéuticamente como analgésico tópico para el tratamiento de ciertos dolores de tipo periférico como pueden ser la artritis reumatoide, la neuralgia post-herpética, neuropatías diabéticas y osteoartritis entre otros (Narasimha et al, 2006).
Actividad anti-microbiana: Los capsaicinoides también se conocen por presentar unas marcadas propiedades antimicrobianas y anti-fúngicas. Kischbaum y colaboradores en el 2002(b), comprobaron que los extractos obtenidos a partir de pimientos picantes inhibían el desarrollo de determinados patógenos como Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes, Clostridium tetani y Streptococcus pyogenes.
También se ha demostrado que extractos de capsaicinoides presentan propiedades anti- bacterianas frente a Salmonella typhimurium y Pseudomonas aeruginosa, y frente a Helicobacter pylorientre otras.
34 3.2.1.3 Identificación y cuantificación de capsaicinoides
Para identificar la presencia de capsaicinoides se utiliza la característica de la polaridad de la molécula de capsaicinoides, para su extracción se emplean solventes polares de los cuales han dado buenos resultados: el alcohol metílico, el etílico y el isopropílico;
la acetona, éter etílico y acetato de etilo. También hay otros solventes secundarios de positivos resultados, como son cloroformo, cloruro de metileno, hidróxido de sodio, agua tibia (Zendie y Bosland, 2000).
El acetonitrilo da una eficiencia de extracción buena de capsaicinoides y reduce la cantidad de pigmentos y aceites presentes en la extracción con acetona (Zewdie y Bosland, 2000).
El contenido de capsaicinoides es medido en partes por millón (ppm). Estas, son convertidas a unidades Scoville multiplicando al resultado por 15 .Estas unidades son el estándar del nivel de pungencia utilizado en la industria del Capsicum (Zewdie y Bosland, 2000).
3.2.2. Carotenoides
3.2.2.1 Características generales.
Los carotenoides son pigmentos naturales más comunes, son los responsables de la gran mayoría de los colores amarillos, anaranjados o rojos incluidos en los alimentos vegetales y anaranjados en algunos alimentos de origen animal, también presentes pájaros, insectos, peces y crustáceos. Se conocen alrededor de 600 compuestos de esta familia, que se dividen en dos tipos: los carotenos, que son hidrocarburos, y las xantofilas, sus derivados oxigenados (Rodríguez- Amaya 1999).
Los carotenoides hidrocarbonados se denominan colectivamente como carotenos (Cuadro 5); aquellos que contienen oxígeno se denominan xantofilas (Cuadro 6). Las funciones oxigenadas más comunes son los grupos hidroxi (OH) y epoxi (epóxidos
35 5,6- ó 5,8-). También se encuentran los grupos aldehído (CHO), ceto (C=O), carboxi (CO2H), carbometoxi (CO2Me) y metoxi (OMe) (Rodríguez-Amaya, 1999).
Los carotenoides, ya sea carotenos o xantofilas, pueden ser aciclícos (ej. fitoflueno, ξ- caroteno, licopeno), monocíclicos o bicíclicos. La ciclación ocurre en uno o ambos extremos de la molécula, formando uno o dos anillos β de seis miembros (a veces denominados β-ionona) o anillos ε (algunas veces denominados α-ionona). Así, el monocíclico γ-caroteno tiene un anillo β mientras los bicíclicos β-caroteno, β- criptoxantina, zeaxantina y astaxantina tienen dos de estos anillos. Los bicíclicos α- caroteno y luteína tienen cada uno un anillo β y un anillo ε (Rodriguez-Amaya, 1999).
Carotenoides representan un papel importante en la vida de la planta y la habilidad de sintetizar son regulados a través de irradiación, sobre todo durante el desarrollo de joven plantas (Harding. 1980). Madurar de frutas es otro proceso complejo en plantas más altas controladas por radiación (Rodríguez-Amaya, 1999). La estructura básica de los carotenoides es un tetraterpeno de 40 carbonos, simétrico y lineal formado a partir de ocho unidades isoprenoides de 5 carbonos unidas de manera tal que el orden se invierte al centro.
Este esqueleto básico puede modificarse de varias maneras como por ejemplo por hidrogenación, dehidrogenación, ciclación, migración del doble enlace, acortamiento o extensión de la cadena, reordenamiento, isomerización, introducción de funciones oxigenadas o por combinaciones de estos procesos, dando como resultado una gran diversidad de estructuras. Se han aislado y caracterizado más de 600 carotenoides que ocurren naturalmente. El número de carotenoides hasta ahora encontrados en los alimentos es mucho menor; sin embargo, la composición de los carotenoides de un alimento dado puede ser bastante compleja (Rodríguez-Amaya, 1999).
36 Cuadro 5: Estructuras y características de los carotenos comunes en los alimentos.
Fuente: Rodríguez-Amaya, 1999.
Cuadro 6: Estructuras y características de las xantofilas comunes en los alimentos
Fuente: Rodríguez-Amaya, 1999
37 2.2.2.2 Efectos y aplicaciones de los Carotenoides
La actividad antioxidante de estos pigmentos depende de una serie de factores, como su estructura química (tamaño, número de sustituyentes, configuración cis o trans, etc.), su concentración, la presión parcial de oxígeno o su interacción con otros antioxidantes, sobre todo las vitaminas C y E . En un principio estos estudios se llevaron a cabo basándose principalmente en el β - caroteno; el mecanismo de la actividad antioxidante de este compuesto está relacionado con su carácter hidrofóbico y con su capacidad para "retirar" el oxígeno y desactivar radicales libres (Mínguez y Pérez, 1998a).
2.2.2.3 Identificación y cuantificación de carotenoides
Los carotenoides en su mayoría son solubles en solventes apolares (éter etílico, benceno, cloroformo, acetona, acetato de etilo, etc.), para una eficiente extracción es recomendable secar el tejido. El procedimiento de análisis e identificación de los carotenoides en muestras biológicas se realiza en dos o tres etapas principales (Mínguez y Pérez, 1998b). En la primera, se obtiene el extracto crudo, seguidamente se analiza y/o fracciona. La identificación puede hacerse por cromatografía líquida de alta eficiencia y comparación con los tiempos de retención de carotenoides estándares, o en el caso preparativo los carotenoides aislados se someten a análisis espectrales (Figura 6).
a)
38 Figura 6: Espectro visible de los carotenoides en ajíes de color amarillo (a) y rojos (b)
característico en el rango de 400 a 500 nm. (Máximo alrededor de 450 nm).
Fuente: Hornero (2001).
Por otro lado la composición de los carotenoides varía en función del cultivar o la variedad, estado de maduración, clima, composición del suelo, parte de la planta utilizada, duración de la post cosecha, procesamiento y almacenamiento (Mínguez- Mosquera y Gandul-Rojas, 1994). Por lo tanto, el muestreo es de absoluta importancia y los resultados deben ser acompañados por informaciones adicionales (por ejemplo, especificando cultivar, estado de maduración, parte analizada, origen geográfico). Los errores en el muestreo pueden superar los del propio análisis.
El procedimiento general de los análisis consiste de: I) extracción; II) partición con éter de petróleo o hexano; III) saponificación; IV) concentración; V) separación cromatográfica; y VI) identificación y cuantificación. La partición puede ser eliminada en los métodos que emplean HPLC .La saponificación se usa para remover clorofilas y lípidos indeseables y en hidrolizar hidroxicarotenoides esterificados con ácidos grasos, liberando los carotenoides. Sin embargo, esta etapa debe ser evitada siempre que sea posible, puesto que puede causar degradación y producir compuestos artificiales (Mínguez-Mosquera y Garrido, 1989)
b)
39 El método oficial de la Asociation of Analitical Chemists (A.O.A.C., 1990) consiste en la extracción, saponificación en caliente o en frio, cromatografía en columna y la elución de carotenoides, para su posterior determinación cuantitativa por espectrofotometría basado en la densidad óptica de volúmenes y cantidades conocidas de carotenoides, leída a longitud de onda específica. El caroteno de la muestra es calculado y se expresa como β-caroteno. Luego se puede cuantificar por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), dándonos los resultados que por comparación podemos asegurar la cantidad de cada uno de los carotenoides analizados (Mínguez et al, 1998) (Figura 7).
Figura 7: Comparación de espectro de carotenoides con resultados en HPLC.
Fuente: Rodríguez- Amaya (1993).
