III. MATERIALES Y METODOS 55
3.2 Materiales. 55
3.2.4 Reactivos 57
Etanol p.a., fenolftaleína p.a., hidróxido de sodio p.a., acido clorhídrico q.p., acido sulfúrico q.p.
Glucosa anhidra p.a., fenol p.a. dióxido de carbono 99% pureza, rojo de metilo p.a., anaranjado de metilo p.a., acido bórico p.a. verde de bromocresol p.a., hexano p.a., dicromato de potasio.
Patrón de carotenoides (capsantina, β- caroteno, β- criptosantina y zeaxantina) y capsaicinoides (capsaicina, dihidro capsaicina y nordihidrocapsaicina)
Acido dinitro salicílico p.a., tartrato de sodio y potasio p.a., carbonato de sodio p.a., tartrato de sodio y potasio p.a.
61
Metabisulfito de sodio p.a., sulfato de potasio, acetato de sodio anhidro p.a., éter di etílico, fenol acido acético glacial p.a. y fosfato de sodio monobásico
Tetra cloruro de carbono p.a.
Reactivos de grado HPLC: hexano, acetona, tolueno, acetato de etilo, agua, metanol y etanol
Sulfato de sodio p.a, hidróxido de potasio, carbón activado, silicagel, peptona, cobre (II) sulfato pentahidratado p.a., carbonato de sodio p.a, tetrahidrofurano p.a., twen p.a., acido acético p.a. y lactosa p.a.
El CO2, pureza de 99.995 % de praxair.
3.3 Métodos
3.3.1 Proceso de extracción de capsaicinoides y carotenoides de ají habanero y ají ojo de pez por fluido supercrítico – CO2.
3.3.1.1 Acondicionamiento de la muestra.
Se trabajó con frutos maduros de ají habanero y ají ojo de pescado procedentes del distrito de Oxapampa, cultivados en invernadero.
La muestra fue seleccionada (en estadio maduro), limpiada de hojas, desinfectadas con hipoclorito de sodio (100 ppm para 5 kg de muestra fresca) y despedunculadas.
Los frutos fueron cortados en aros de 5 mm de espesor en forma manual.
Estos fueron secados en un secador eléctrico, por arrastre de vapor a 40 ºC para ambas muestras, por un tiempo de 50 horas para el ají habanero mientras que el ají ojo de pez fue 38 h, hasta alcanzar una humedad final de 10 - 12% ± 2 en ambas muestras (Método FAO. 2002).
Se utilizó un molino de cuchillas eléctrico y se controlo el tiempo de molienda de 1 min por cada 25 g de muestra.
Se utilizo un tamizador eléctrico en el cual se puso 100 g y se obtuvo un tamaño de partícula 1 > Ø ≤ 0.425 mm (Nagi y Simandi, 2008).
62 En la figura 12, se muestra las actividades de acondicionamiento del ají (Capsicum chinense) y proceso de extracción con SC- CO2 hasta la obtención de oleorresina.
En aros de 5 mm de espesor
Tamaño de partícula (mm):
1 < Ǿ < de 0.425 Factor A: Presión: 200 y 400 bar
Factor B: Temperatura: 35 y 55 ºC Factor C: Tiempo: 1.5 y 3 h
Cant. de muestra: 80 % vol del extractor
Presión de 12 bar y 40ºC
Figura 12: Diagrama de flujo de extracción de oleorresina por fluido supercrítico CO2
Extracción supercrítica
Evaporación Despepitado
Secado
Molienda Tamizado Tamizado Lavado
Cortado
Oleorresina Despresurización
Ají
63 3.3.1.2 Extracción con CO2 supercrítico de oleorresina de ají ojo de pez y habanero
Se utilizo un sistema de extracción por fluido supercrítico (Equipo SFE-100 – 2 – FMC10 – Thar Instruments Inc), que fue limpiado y acondicionado para su uso.
Se adiciono muestra seca, hasta alcanzar un 80 % de capacidad del vaso de extracción y se aseguro las conexiones antes de iniciar el proceso. La muestra fue sometida a presiones de 200 y 400 bar; con temperaturas de 35, y 55 ºC y tiempos de presurizado de 1.5 y 3 horas.
La separación de la oleorresina, se realiza despresurizando el sistema ya mencionado a 12 bar y a 40 ºC, se hizo un lavado con etanol con grado de pureza de 99 % para recuperar la mayor cantidad de oleorresina.
Se realizó una evaporación para separar la oleorresina del etanol, se utilizó un rotaevaporador a temperatura y presión controlada de 40 °C y 500 mm Hg respectivamente, hasta la eliminación total del solvente. La cantidad de oleorresina extraída se determinó gravimétricamente.
La oleorresina se almaceno en botellas de color ámbar a temperatura de - 25 ºC.
3.3.1.3 Determinación del espectro de carotenoides del ají ojo de pez y habanero En la determinación del contenido total de carotenoides por método espectrofotométrico (Lee et al, 1976). Los carotenoides tienen propiedades espectroscópicas es decir pueden absorber específicamente la luz en las regiones ultravioleta (UV) y visible del espectro de absorción, por lo que pueden ser identificados en un intervalo de longitud de onda (λ) de 420 - 510 y por ende cada caroteno tiene un espectro de absorción característico (Elizalde, 2006).
3.3.1.4 Cuantificación de capsaicinoides y carotenoides por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC)
La identificación de capsaicinoides y carotenoides se hizo con un cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC) con detector de arreglo de diodos.
64 a) Determinación del perfil de capsaicinoides por HPLC,( método AOAC -995.03)
Se utilizó una columna C18, con partículas de 25 μm de diámetro, 150 mm de longitud y 4,6 mm de diámetro. La cuantificación de capsaicina y dihidrocapsaicina se hizo en base a las curvas patrón correspondiente a los estándares de Capsaicina, dihidrocapsaicina y nordihidrocapsaicina en concentraciones en 10, 20, 30, 40, 80 y 160 ppm.
Fase móvil: 50% acetonitrilo y 50% agua (con 1.0% de acido acético). Los capsaicinoides fueron monitoreados usando un detector a 280 nm, se inyectaron 20 μL de cada extracto en la columna de separación para capsaicinoides y el tiempo de análisis para cada muestra fue de 17 min.
Con las lecturas de cada serie de soluciones estándar con áreas de picos de absorción y concentración de capsaicinoides, se obtuvieron las ecuaciones de regresión para calcular el contenido de los 3 compuestos en las muestras.
b) Determinación del perfil de carotenoides por HPLC, (método adaptado de AOAC - 970.64).
Se utilizó una columna para carotenoides, la cuantificación de las fracciones se hizo en base en las curvas patrón correspondiente a los estándares de β-caroteno, β-criptoxatina, zeaxantina y capsantina en concentraciones de 10, 20, 30, 40, 60, 80 y 160 ppm.
Fase móvil: hexano 66,5 %, acetato de etilo 32 %, isopropanol 1,5 % (Ver anexo B), las muestras fueron monitorearon usando un detector UV-VIS a 447 nm, se inyectaron 20 μL de cada extracto en la columna de separación para carotenoides y el tiempo de análisis para cada muestra fue de 25 min.
Con las lecturas de cada serie de soluciones estándar con áreas de picos de absorción y concentración de carotenoides, se obtuvieron las ecuaciones de regresión para calcular el contenido de los 4 compuestos en las muestras.
65 3.3.1.5 Diseño experimental estadístico: Extracción por fluido supercrítico
Variables independientes:
FACTOR A: Presiones de 200 y 400 bar.
FACTOR B: Temperatura de 35 y 55 ºC.
FACTOR C: Tiempo de extracción de 1,5 y 3h.
Variables dependientes
Tasa de rendimiento de oleorresina (%)
Cantidad de capsaicinoides y carotenoides representativos predominantes (mg/100g muestra seca)
Variables intervinientes
Tamaño de partícula: 0.425 < < 1 mm de ají habanero y ojo de pez
Humedad: 10 -12 % ± 2 de ají habanero y ojo de pez
Modelo estadístico para extracción por SC – CO2 para capsaicinoides totales Yijkl: µ +Ai+Bj + Ck + (AB)ij +AC)ik +(BC)jk +(ABC)ijk + Eijkl DONDE:
Yijkl : Cantidad de capsaicinoides totales (mg/100g ms)
µ : Media general.
Ai : Efecto del factor A (Presiones de 200 y 400 bar).
Bj : Efecto del factor B (Temperatura de 35 y 55 ºC) Ck : Efecto del factor C (Tiempo de extracción de 1,5 y 3h) (AC)ik : Efecto de la interacción de los factores A y C.
(BC)jk : Efecto de la interacción de los factores B y C.
(ABC)ijk : Efecto de la interacción de los factores A, B y C
Eijkl : Error experimental.
66 Modelo estadístico para extracción por SC – CO2 para carotenoides totales
Yijkl: µ +Ai+Bj + Ck + (AB)ij +AC)ik +(BC)jk +(ABC)ijk + Eijkl DONDE:
Yijkl : Cantidad de carotenoides totales( mg/100 g ms)
µ : Media general.
Ai : Efecto del factor A (Presiones de 200 y 400 bar).
Bj : Efecto del factor B (Temperatura de 35 y 55ºC) Ck : Efecto del factor C (Tiempo de extracción de 1.5 y 3h) (AC)ik : Efecto de la interacción de los factores A y C.
(BC)jk : Efecto de la interacción de los factores B y C.
(ABC)ijk : Efecto de la interacción de los factores A, B y C
Eijkl : Error experimental.
Los cuadrados 15 y 16 muestran los tratamientos experimentales ejecutados para evaluar el efecto de la presión, temperatura y tiempo con respecto al contenido de capsaicinoides y carotenoides recuperados. Realizando 2 repeticiones para cada tratamiento.
Cuadro 15: Diseño experimental para evaluación de capsaicinoides en el proceso de extracción por SC-CO2
NDHC= Nordihicrocapsaicina, CAP= Capsaicina, DHC= Dihidrocapsaicina.
Capsaicinoides Totales = NDHC + CAP + DHC
Presión (A)
T (B)
Tiempo
(C) NDHC CAP DHC
Capsaicinoides Totales
200 35 1,5 ndhc1 cap1 dhc1 C1
200 35 3 ndhc2 cap2 dhc2 C2
200 55 1,5 ndhc3 cap3 dhc3 C3
200 55 3 ndhc4 cap4 dhc4 C4
400 35 1,5 ndhc5 cap5 dhc5 C5
400 35 3 ndhc6 cap6 dhc6 C6
400 55 1,5 ndhc7 cap7 dhc7 C7
400 55 3 ndhc8 cap8 dhc8 C8
67 Cuadro 16: Diseño experimental para evaluación de carotenoides en el proceso de extracción por SC-CO2
β-Car= β caroteno, β-crip= β criptoxantina, Zea=zeaxantina y Caps = capsantina.
Carotenoides Totales= β-Car + β-crip + Zea + Caps.
Para el análisis de los resultados obtenidos se utilizó un Diseño completamente aleatorio (DCA) con un arreglo factorial 23 y para el procesamiento de datos, se realizo un ANOVA con un α = 5 % y la prueba de comparación de rangos múltiples entre tratamientos por DUNCAN, para determinar la significancia de las variables de estudio en el proceso e extracción.
El procesamiento de datos se realizó usando un paquete estadístico (software) de Estadistical Análisis System (SAS) versión 9.
3.3.2 Proceso de extracción de capsaicinoides y carotenoides de ají ojo de pez Y habanero por acción biocatalítica y órgano-solvente.
En la figura 13, se muestra las actividades de acondicionamiento del ají (Capsicum chinense) de hidrólisis enzimática y extracción con órgano-solventes, también se muestra los pasos previos para la obtención de extracto celulítico a partir de esporas de Aspergillus niger ATC 10864.
Presión (A)
T (B)
Tiempo
(C) β-Car β-crip Zea Caps
Carotenoides Totales
200 35 1,5 car1 crip1 zea1 caps1 Carott1
200 35 3 car2 crip2 zea2 caps2 Carott2
200 55 1,5 car3 crip3 zea3 caps3 Carott3
200 55 3 car4 crip4 zea4 caps4 Carott4
400 35 1,5 car5 crip5 zea5 caps5 Carott5
400 35 3 car6 crip6 zea6 caps6 Carott6
400 55 1.5 car7 crip7 zea7 caps7 Carott7
400 55 3 car8 crip8 zea8 caps8 Carott8
68 Tamaño de espesor
de los aros de ajíes: 5 mm
Esporas de A. niger – ATCC 10864
A 40 ºC, tiempo: 38 – 50 horas Humedad final: 10- 12 %
Tamaño de partícula: Ǿ < 0.425 mm
Temperatura: 35 ºC
Factor A: sto/enzima (w/v): 1/15 y 1/20 Factor B: 170 y 190 rpm
Factor C: 2 y 4 h
40 ºC x 1/2 h para ají habanero y para ají ojo de pez
Solución: hexano/etanol: 75/25 Relación (sto: ste): 1:50 Temperatura: 40 ºC x 3horas
Figura 13: Diagrama de flujo para la extracción biocatalítica de oleorresina de Capsicum chinense
Hidrolisis
Evaporación
Oleorresina Lixiviación
Secado
Cultivo y cosecha de esporas esporas
Fermentación en biopelículas
Filtrado Despepitado
Secado
Molienda Tamizado
Tamizado Lavado
Cortado
Extracto celulolitico Ají
69 3.3.2.1 Acondicionamiento de muestra
Se trabajó con frutos maduros de ají habanero y ají ojo de pescado procedentes del distrito de Oxapampa, cultivados en invernadero.
La muestra fue seleccionada (en estadio maduro), limpiada de hojas, desinfectadas con hipoclorito de sodio (100 ppm para 5 kg de muestra fresca) y despedunculadas.
Los frutos fueron cortados en aros de 5 mm de espesor en forma manual.
Estos fueron secados en un secador eléctrico, por arrastre de vapor a 40 ºC para ambas muestras, por un tiempo de 50 horas para el ají habanero mientras que para el ají ojo de pescado fue 38 h, hasta alcanzar una humedad final de 10-12% ± 2 en ambas muestras (Método FAO. 2004).
Se utilizó un molino de cuchillas eléctrico y se controlo el tiempo de molienda de 1 min por cada 25 g de muestra.
Se utilizo un tamizador eléctrico y se obtuvo un tamaño de partícula ≤ 0.425 mm (Nagy y Simandi, 2008).
3.3.2.2 Proceso de extracción enzimática de oleorresina de ají ojo de pez y habanero:
3.3.2.2.1 Producción de celulasa de Aspergillus niger ATC 10864
Se realizo por el método desarrollado por Villena & Gutierrez – Correa (2007a) basado en una fermentación en biopelículas, se utilizo Aspergillus nigerATCC10864.
Previamente se cultivo las esporas de Aspergillus niger ATCC10864 en agar papa dextrosa (PDA) a temperatura de 30 ºC por 5 días en matraces de 250 mL,
70 seguidamente se realizo la cosecha de las esporas utilizando solución tween 80 al 0,01
% de concentración. Luego se preparo el inoculo en una concentración de 1 x 106 esporas /mL (Figura 13).
Se preparó el soporte con tela poliéster con una superficie de 0,27cm2 para un volumen de 60 mL de medio de cultivo (Duff, 1998); el cual fue preparado con 2 % KH2PO4; 0,3 % CaCl2.2H2O; 0,3 % MgSO4.7H2O; 0,3 % (NH2)2CO; 1,4 % (NH4)2SO4; 1 % peptona; 10 % lactosa; 2 mL Tween 80, 1,25 % FeSO4 7 H2O; 0,4 % Mn SO4 H2O; 0,35 % ZnSO4 7 H2O; 0,5 % CoCl2 6 H2O y se esterilizó a 120ºC x 15 min. La fermentación se realizo en matraces de 250 mL por 4 dias a 30 ºC, con un agitador orbital a 175 rpm.
Se realizo el análisis de actividad enzimática (Miller, 1959) expresada en actividad de papel filtro (FPA: cantidad de enzima que libera un 1µmol de GLU/min).
3.3.2.2.2 Hidrolisis celulítica de tejido de dos variedades de ajíes: ají ojo de pez y habanero.
2.5 g de ají habanero y ají ojo de pez acondicionado se sometió a hidrólisis por separado en matraces de 125 mL en una relación sustrato/extracto enzimático: 1/15 y 1/20; velocidad de agitación: 150 y 170 rpm; y tiempo de hidrólisis: 2 y 4 h; en baño maría con agitador orbital a una temperatura de 35ºC.
3.3.2.2.3 Extracción de oleorresina con solvente de tejido seco hidrolizado de ajíes: ají ojo de pez y habanero.
Previa a la extracción por hidrólisis enzimática se realizo una extracción convencional (soxhlet) a fin de comparar el rendimiento total con los métodos de estudio. Dicha extracción fue a condiciones de 2,5 g de muestra, con tamaño de partícula < 0,425 mm.
71 La pasta o torta obtenida de la hidrólisis se seco a 45 °C con un secador eléctrico hasta que se reduzca de 10-12 % de humedad para realizar la lixiviación.
Lixiviación: Se preparo una mezcla solvente de hexano/etanol (75/25) el cual se utilizo para la extracción de la oleorresina en una relación muestra hidrolizada/mezcla solvente: 1/50, con una agitación de 170 rpm, 40 ºC , 3 h. Se realizo en un baño maría con agitación orbital.
Evaporado: Se realizo para separar la oleorresina del disolvente orgánico se en un rotaevaporador a 40 °C y 500 mm Hg, hasta la eliminación total del solvente. El contenido de la oleorresina extraída se determinó gravimétricamente.
Oleorresina: Se almaceno la oleorresina obtenida en botellas de color ámbar a temperatura de - 25 Cº, hasta el momento de la cuantificación de capsaicinoides y carotenoides.
3.3.2.3 Determinación del espectro de carotenoides del ají habanero y ojo de pez
En la determinación del contenido total de carotenoides por Método espectrofotométrico (Lee et al., 1976). Los carotenoides tienen propiedades espectroscópicas es decir pueden absorber específicamente la luz en las regiones ultravioleta (UV) y visible del espectro de absorción, por lo que pueden ser identificados en un intervalo de longitud de onda (λ) de 420 - 510 y por ende cada caroteno tiene un espectro de absorción característico (Elizalde, 2006)
3.3.2.4 Cuantificación de carotenoides y capsaicinoides por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).
La identificación de capsaicinoides y carotenoides se hizo con un cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC) con detector de arreglo de diodos.
72 a) Determinación del perfil de capsaicinoides por HPLC, (método AOAC 995.03)
Se utilizó una columna C18, con partículas de 25 μm de diámetro, 150 mm de longitud y 4.6 mm de diámetro. La cuantificación de capsaicina y dihidrocapsaicina se hizo en base a las curvas patrón correspondiente a los estándares de Capsaicina, dihidrocapsaicina y nordihidrocapsaicina en concentraciones en 10, 20, 30, 40, 80 y 160 ppm.
Fase móvil: 50% acetonitrilo y 50% agua (con 1.0% de acido acético). Los capsaicinoides fueron monitoreados usando un detector a 280 nm, se inyectaron 20 μL de cada extracto en la columna de separación para capsaicinoides y el tiempo de análisis para cada muestra fue de 17 min.
b) Determinación del perfil de carotenoides por HPLC, (método adaptado de AOAC 970.64).
Se utilizó una columna para carotenoides, la cuantificación de las fracciones se hizo con base en las curvas patrón correspondiente a los estándares de β- caroteno, β-criptoxatina, zeaxantina y capsantina en concentraciones de 10, 20, 30, 40, 80 y 160 ppm.
Fase móvil: hexano 66,5 %, acetato de etilo 32 %, isopropanol 1,5 % (Ver anexo B), las muestras fueron monitorearon usando un detector UV-VIS a 447 nm, se inyectaron 20 μL de cada extracto en la columna de separación para carotenoides y el tiempo de análisis para cada muestra fue de 25 min.
3.3.2.5 Diseño experimental estadístico: Extracción enzimática
Variables independientes:
Hidrólisis
FACTOR A: Enzima/ Sustrato: 1/15 y 1/20
73
FACTOR B: Velocidad de agitación para hidrólisis: 170 y 190 rpm
FACTOR C:Tiempo de hidrolisis: 2 y 4 h
Variables dependientes
Rendimiento de oleorresina (%)
Cantidad de capsaicinoides y carotenoides representativos y predominante (mg/100 g muestra seca)
Variables intervinientes
Temperatura de hidrólisis: 35º C.
Tamaño de partícula: < 0, 425 mm. de muestras de ají habanero y ojo de pez
Modelo estadístico para la extracción biocatalitica para capsaicinoides totales Yijkl: µ +Ai+Bj + Ck + (AB)ij +AC)ik +(BC)jk +(ABC)ijk + Eijkl
DONDE:
Yijkl : Cantidad de capsaicinoides totales ( mg/ 100 g ms) µ : Media general
Ai : Efecto del factor A (Enzima/ Sustrato:(1/15) y (1/20)).
Bj : Efecto del factor B (Velocidad de agitación: 170 y 190 rpm).
Ck : Efecto del factor C (Tiempo de hidrolisis: 2 y 4 h).
AC)ik : Efecto de la interacción de los factores A y C.
(BC)jk : Efecto de la interacción de los factores B y C.
(ABC)ijk : Efecto de la interacción de los factores A, B y C.
Eijkl : Error experimental.
74 Modelo estadístico para la extracción biocatalitica para carotenoides totales
Yijkl: µ +Ai+Bj + Ck + (AB)ij +AC)ik +(BC)jk +(ABC)ijk + Eijkl DONDE:
Yijkl : Cantidad de carotenoides totales( mg /100 g ms) µ : Media general
Ai : Efecto del factor A (Enzima/ Sustrato:(1/15) y (1/20)).
Bj : Efecto del factor B (Velocidad de agitación: 170 y 190 rpm).
Ck : Efecto del factor C (Tiempo de hidrolisis: 2 y 4 h).
AC)ik : Efecto de la interacción de los factores A y C.
(BC)jk : Efecto de la interacción de los factores B y C.
(ABC)ijk : Efecto de la interacción de los factores A, B y C.
Eijkl : Error experimental.
Los cuadrados 17 y 18 muestran los tratamientos experimentales ejecutados para evaluar el efecto de la dilución (sutrato/enzima), velocidad de agitación y tiempo de hidrolisis respecto al contenido de capsaicinoides y carotenoides recuperados.
Realizando 2 repeticiones para cada tratamiento.
Cuadro 17: Diseño experimental para evaluación de capsaicinoides en el proceso de extracción por acción biocatalítica.
NDHC= Nordihicrocapsaicina, CAP= Capsaicina, DHC= Dihidrocapsaicina.
Capsaicinoides Totales = NDHC + CAP + DHC
(Sutrato/
enzima) (A)
Agitación (B)
Tiempo de hidrolisis
(C)
NDHC CAP DHC
Capsaicinoides Totales
1/15 170 2 ndhc1 cap1 dhc1 C1
1/15 170 4 ndhc2 cap2 dhc2 C2
1/15 190 2 ndhc3 cap3 dhc3 C3
1/15 190 4 ndhc4 cap4 dhc4 C4
1/20 170 2 ndhc5 cap5 dhc5 C5
1/20 170 4 ndhc6 cap6 dhc6 C6
1/20 190 2 ndhc7 cap7 dhc7 C7
1/20 190 4 ndhc8 cap8 dhc8 C8
75 Cuadro 18: Diseño experimental para evaluación de carotenoides en el proceso de extracción por acción biocatalitica.
β-Car= β caroteno, β-crip= β criptoxantina,Zea=zeaxantina y Caps = capsantina.
Carotenoides Totales= β-Car + β-crip + Zea + Caps.
Para el análisis de los resultados obtenidos se utilizo un diseño cuadrático aleatorio (DCA) con un arreglo factorial 23 y para el procesamiento de datos, se realizo un ANOVA con un α = 5% y la prueba de rangos múltiples entre tratamientos por DUNCAN para determinar la significancia de las variables de estudio en el proceso e extracción.
El procesamiento de datos se realizo usando un paquete estadístico (software) de Estadistical Análisis System (SAS) versión 9.
(Sutrato/
enzima) (A)
Agitaci ón (B)
Tiempo de hidrolisis
(C)
β-Car Β-crip Zea Caps
Carotenoides Totales
1/15 170 2 car1 crip1 zea1 caps1 Carott1
1/15 170 4 car2 crip2 zea2 caps2 Carott2
1/15 190 2 car3 crip3 zea3 caps3 Carott3
1/15 190 4 car4 crip4 zea4 caps4 Carott4
1/20 170 2 car5 crip5 zea5 caps5 Carott5
1/20 170 4 car6 crip6 zea6 caps6 Carott6
1/20 190 2 car7 crip7 zea7 caps7 Carott7
1/20 190 4 car8 crip8 zea8 caps8 Carott8
76 I V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1 Extracción convencional de oleorresina de ají ojo de pez y habanero
Se realizó una extracción convencional (soxhlet) a fin de comparar el rendimiento total con los métodos de extracción de estudio, esta extracción se realizó con tetrahidrofurano, 2.5 g de muestra y entre 1 < Ǿ < 0.425 mm de tamaño de partícula.
Cuadro 19: Cantidad de oleorresina obtenida por soxhlet del ají ojo de pez y habanero Cantidad de oleorresina
AJÍ OJO DE PEZ AJÍ HABANERO (g ole/100g ms) Rendimiento
(%)
(g oleo/100g m s) Rendimiento (%)
14,4 ± 0.017* 5,7 19,4 ± 0.003* 7,7
*Promedio de 2 repeticiones
En el cuadro 19, se muestra la cantidad de oleorresina y los rendimientos obtenidos por extracción convencional de ambas muestras, en el cual al ají habanero presento un mayor rendimiento de 1,4 veces mayor que el ají ojo de pez, estos resultados muestran claramente que aun entre las variedades de una misma especie, el contenido de oleorresina es diferente. Asimismo, Rodríguez et al (2002), obtuvo 5.6 % en rendimiento de oleorresina del Capsicum chinense en extracción convencional, que comparados con los resultados obtenidos del ají ojo de pez y habanero, estos superan en 2.5 y 3.4 veces, respectivamente. Esta variación podría deberse a varios factores como variedad de fruto, condiciones de cultivo, grado de madurez, fecha de recolección, y métodos de aislamiento y cuantificación.
A la oleorresina obtenida de ambas muestras, se aislaron y analizaron los carotenoides por el método espectrofotométrico, obteniéndose espectros que fueron comparados con el β –caroteno estándar y la imagen espectral de carotenoides totales como se muestra en la figura 14.
77 Figura 14: Espectro de carotenoides de a) ají ojo de pez y b) ají habanero; c) Espectros de carotenoides de la fracción amarilla
(a)
(b)
(c)
78 El espectro obtenido para el aj ojo de pez y habanero presentan características similares a los espectros del β-caroteno, β-cripotoxantina y zeaxantina, el espectro en la región visible de los carotenoides es bastante característico en la longitud de onda comprendida entre 400 y 500 nm como por ejemplo el β-caroteno estándar, presenta en su mayoría tres picos, el ají ojo de pez presenta ligeramente tres picos a diferencia del ají habanero, esto se debería a características propias de cada muestra (Mínguez et al., 1993), las formas de extracción, separación y almacenamiento juegan un papel importante pues los pigmentos amarillos son mas inestables que los pigmentos rojos formando isómeros u otros compuestos, los productos formados son mas susceptibles a ataques oxidativos y se pueden originar roturas de cadena central de la molécula y por tanto pérdida de color, logrando modificar el espectro de cada carotenoide (Pérez y Garrido,1997).
Asimismo, se determinó y cuantifico fracciones de capsaicinoides y carotenoides de la oleorresina obtenida por el método convencional, tal como se observa en el cuadro 20, siendo punto de comparación frente a las obtenidas en las extracciones por SC - CO2 y extracción enzimática más adelante.
Cuadro 20: Cantidad de carotenoides y capsaicinoides obtenidas de la oleorresina de ají ojo de pez y ají habanero por método convencional
Biocomponentes Ají ojo de pez Ají habanero
Carotenoides totales
(mg/100g muestra seca) 870,70 ± 3.23 * 207,94 ± 2,45 *
Capsaicinoides totales
(mg/100g muestra seca) 1494,50 ± 5.24 * 1945,21 ± 8,56 *
SHU (Grados Scoville) 224175,44 291781,94
*Promedio de 2 repeticiones
En el cuadro 20, se observa la cantidad de carotenoides y capsaicinoides totales obtenidas por extracción convencional, al comparar a las obtenidas de ambas muestras (Cuadro 20), se puede observar una diferencia del ají ojo de pez en 4,2 veces frente al habanero, sucediendo lo contrario con respecto a capsaicinoides totales, el ají habanero supero en 1,3 veces al ojo de pez; lo que demuestra la cantidad de carotenoides y