I. INTRODUCCIÓN 13
2.3. Extracción de Compuestos naturales 37
2.3.1 Métodos de extracción 37
2.3.1.1 Extracción mediante fluidos supercríticos. 38
La extracción supercrítica es una operación unitaria de transferencia de masa que se efectúa por encima del punto supercrítico del solvente; esta extracción permite controlar y manipular propiedades tales como la difusividad, viscosidad y densidad del fluido mediante pequeños cambios de presión y temperatura, lo que conlleva a una variación en la selectividad y el poder de solvencia de este (Gallego y Castañeda,
42 2004), comparado a los métodos clásicos, permiten un menor tiempo de extracción, consumo de poca cantidad de solvente, el rendimiento de extracción es de mayor calidad. Se puede optimizar el rendimiento utilizando un co-solvente, la separación selectiva se obtiene por medio del enfriamiento gradual del sustrato, permitiendo con esto un fraccionamiento controlado de los productos que se desea extraer (Mohamed, 1997).
Un fluido supercrítico es un cuasi estado con propiedades intermedias entre líquidos y gases, como se puede apreciar en la Cuadro 8.
Cuadro 8: Propiedades físicas de un fluido en condiciones diferentes de estado.
Densidad (g/mL)
Viscosidad (g/cmxs)
Difusividad (cm2/s) Gas
10-3 10-4 10-1
Liquido
1 10-2 10-6
Fluido
supercrítico 0,2-0,9 10-4 10-3
Fuente: Mohamed (1997).
En un diagrama de fases clásico como el de la Figura 8, las curvas de fusión, sublimación y vaporización muestran las zonas de coexistencia de dos fases. Tan solo hay un punto de coexistencia de tres estados, el llamado punto triple (PT). El cambio de estado se asocia a un cambio brusco de densidad y, para que se produzca, es necesario un aporte extra de energía denominado entalpía de cambio de estado. Por encima del punto crítico, no se produce licuefacción al presurizar, ni gasificación al calentar; y por ende un fluido supercrítico es aquel que se encuentra por encima de dicho punto (Nagy y Simandi, 2008)
43 Figura 8:.- Diagrama de fases sólido/líquido/gas.
Fuente: Peuch et al (1997).
Cuadro 9: Propiedades críticas de las sustancias más comúnmente empleadas en condiciones supercríticas
Compuesto Peso molecular (g/mol)
Presión crítica (bar)
Temperatura crítica (*C)
Densidad crítica (g/mL) Dióxido de
carbono 44,01 72,0 31,1 0,47
Agua 18,02 214,8 374,2 0,32
Amoniaco 17,03 109,8 132,5 0,23
Argón 39,95 48,6 -122.4 0,73
Acetona 58,08 47,0 235,0 0,28
Etanol 46,07 72,0 243,4 0,28
Metanol 32,04 78,9 239,0 0,27
Metano 16,04 46,0 -82,6 0,17
Etano 30,07 47,6 32,3 0,20
Fuente: Nagy y Simandi (2008).
44 Los fluidos en el punto crítico poseen propiedades muy peculiares:
No existe interface gas-líquido
La compresibilidad isotérmica se hace infinitamente positiva
El coeficiente de expansión térmica es infinito y positivo
La entalpía de vaporización es cero
Si la densidad crítica se mantiene constante la capacidad calorífica a volumen constante tiende al infinito.
Así mismo en la región supercrítica muestra excelentes propiedades físicas que lo hacen un solvente excelente
La densidad por encima del punto crítico depende de la presión y la temperatura. La viscosidad es mucho más baja que la de los líquidos, lo que le confiere propiedades hidrodinámicas muy favorables.
La bajísima tensión superficial permite una alta penetrabilidad a través de sólidos porosos y lecho empaquetado comparable a la del ciclo hexano (Lee et al, 1976).
Existe una alternativa al uso de condiciones tan extremas que consiste en la adición de pequeñas cantidades (≤ 10 %) de modificadores, es decir, sustancias polares como etanol o agua, que añadidas al CO2 varían enormemente la polaridad del fluido extractante. En ocasiones los modificadores no sólo sirven para aumentar la polaridad del CO2 sino que se emplean con el objetivo de mejorar su capacidad solvente, por lo que también se emplean sustancias apolares (Gnayfeed et al, 2001)
La solubilidad del β-caroteno es uno de los claros ejemplos (Cuadro 10.) que podemos observar. Debido a la degradación del β-caroteno por temperatura, exposición a la luz y auto-oxidación, es posible tener desviaciones en los resultados de solubilidad con respecto a la literatura.
45 Cuadro 10: Solubilidad de β - caroteno con CO2 supercrítico
Fuente: Gnayfeed et al, (2001).
La solubilidad de la capsaicina en CO2 ha sido estudiada por diferentes autores En el Cuadro 11 se presentan los métodos experimentales por cada autor, se observa que los tres métodos experimentales son estáticos en la manera de alcanzar el equilibrio y analíticos en la cuantificación del sólido. A excepción de los datos reportados por Knez y Steiner (2001).
Cuadro 11: Solubilidad de capsaicina con CO2 supercrítico
Fuente: Gnayfeed et al, (2001).
46 Parámetro de solubilidad.- El parámetro de solubilidad es la capacidad de solvatación de un gas comprimido dada por la variación de la densidad. Se entiende que a mayor presión, mayor densidad y por lo tanto, mayor solubilidad.
a) El CO2: Fluido supercrítico
Debido a que presenta ventajas comparativas, como su bajo costo, fácil obtención, propiedades críticas bajas, el CO2 es considerado con mayor potencialidad para la extracción por este método (Gallego y Castañeda, 2004).
El CO2 no es tóxico ni inflamable, químicamente inerte y es más inocuo para el medio ambiente (Se puede considerar como un disolvente verde en todas sus aplicaciones) que los disolventes orgánicos, es un gas que está disponible en alta pureza a un bajo coste, lo que hace que su uso no sea muy costoso una vez que se tiene el equipamiento de extracción, presenta además una alta capacidad de solvatación, selectividad y una gran efectividad de extracción, en muchas ocasiones superiores a los métodos tradicionales que utilizan disolventes orgánicos (Ferreira y Meireles, 2002).
Hay que destacar que la polaridad del fluido puede ser modificada apropiadamente para optimizar el aislamiento de los compuestos de interés. Otros fluidos también pueden utilizarse, especialmente el óxido nitroso, que tiene temperatura y presión critica similares al CO2, pero con la desventaja de ser inflamable y tóxico (Ferreira y Meireles, 2002).
Las 4 etapas básicas en la extracción por CO2: supercrítico.
Los cuatro pasos primarios involucrados en un proceso de extracción por fluido supercrítico son: Extracción, Expansión. Separación y Compresión del solvente. Los equipos críticos del proceso son: Un extractor de alta presión, una válvula de reducción, un separador de baja presión y una bomba para elevar la presión del solvente reciclado.
47 El proceso se inicia (Figura 9) de la siguiente manera: La alimentación, generalmente un sólido molido, es cargada al extractor. El CO2 es alimentado al extractor a través de una bomba de alta presión, la cual trabaja desde 100 a 400 bares. El CO2 comprimido es calentado por un intercambiador de calor hasta la temperatura de extracción (en un rango de 30 a 60°C). Luego, ingresa al extractor y el solvente procede a extraer la esencia de la matriz herbácea cargada. La mezcla CO2-extracto es enviada a un separador, el cual opera desde 150 a 1 bar con un paso previo a través de una válvula de reducción de presión.
Figura 9: Grafico de circulación del CO2 en sus diferentes fases y las etapas para una extracción por fluido supercrítico.
Fuente: Ferreira (2002).
Con la temperatura y presión reducidas, el extracto precipita instantáneamente en el separador (Figura Nº9), mientras el CO2 libre de cualquier extracto, es reciclado al proceso, con pasos previos de enfriamiento y compresión.
Circulación de CO2: CO2 LÍQUIDO (A)
CO2 SUPERCRITICO (B) (extracción)
CO2 gaseoso (C) EXTRACTO (D)
(A)
(B)
(B) (C)
(C)
(D)
(D)
48 3.3.1.1.2 Antecedentes de extracciones por fluido supercrítico
El dióxido de carbono probablemente es el fluido supercrítico ampliamente usado debido a su temperatura crítica (31,1 ºC) que hace él un solvente ideal para extraer los materiales lábiles termalmente (Ferreira et al., 1999).
a) Aplicaciones en alimentos:
Como por ejemplo la extracción cafeína, especias, aceites esenciales, productos de interés y muchos otros (Ferreira et al., 1999). Así como podemos observar en el siguiente cuadro.
Cuadro 12: Compuestos extraídos usando el CO2 supercrítico como solvente.
Compuesto extraído
Condiciones de extracción
Referencias solvente Presión Mpa TºC Flujo Extracto de romero
(antioxidantes)
CO2 10-16 37-47 - Ibañez et al.,
1999 Carotenoides de
paprika
CO2/ 4
% de etanol
>50 100 - Ambrogi et al., 2002 Extracto de orégano
(antioxidantes)
CO2 25 40 - Cavero et
al.,2006 Vitamina E de germen
de trigo
CO2 34,5 43 - Ge et al., 2002
Esterales y tocoferoles del aceite de oliva
CO2 20 40 2L/h Ibáñez et al.,
2002 Flavonoides del jugo
de naranja
CO2 16 40 2400
mL/h
Señorans et al.,2001
Fuente: Daood et al, (2002).
Muchos investigadores han desarrollado métodos de extracción de capsaicinoides mediante fluidos supercríticos (Cuadro 12). Daood et al, (2002) estudiaron la extracción de capsaicinoides a partir de una oleorresina proveniente de pimiento páprika picante (Capsicum annuum L.) mediante fluidos supercríticos, utilizando para ello CO2. La solubilidad de la oleorresina fue estudiada a temperaturas comprendidas entre 35 y 55 ºC y presiones entre 100 y 400 bares. Las mejores condiciones de
49 extracción que se observaron para los capsaicinoides fueron utilizándose presiones de 400 bares a una temperatura de 55 ºC.
Peusch et al. (1997) compararon también la técnica de extracción mediante fluidos supercríticos con la extracción empleando disolventes orgánicos, para los capsaicinoides (capsaicina, dihidrocapsaicina y nordihidrocapsaicina). Se compararon los resultados obtenidos con ambos métodos y se observó que los resultados obtenidos mediante el empleo de la extracción mediante fluidos supercríticos eran similares o incluso algo inferiores que los obtenidos con disolventes orgánicos.
Gnayfeed et al.(2001)estudiaron la extracción de capsaicinoides a partir de pimientos del tipo Capsicum annuum L. var SZ-178 mediante esta técnica, empleando temperaturas comprendidas entre 35 y 55 ºC y presiones en un rango que oscilaba entre los 100 y 400 bar. Comprobaron que las mejores condiciones para la extracción de capsaicinoides fueron 400 bares de presión y una temperatura de 55 ºC. Con estas condiciones comprobaron que se recuperaba un 93 % del contenido total de capsaicinoides en la muestra. También comprobaron que la solubilidad de los capsaicinoides incrementaba 3,6 veces al subir la presión de 200 a 400 bares a la temperatura de 55 ºC.
Del Valle et al, (2003) estudiaron la extracción de capsaicinoides del pimiento Jalapeño (Capsicum annuum L.) mediante fluidos supercríticos, usando para ello el CO2. Se estudiaron presiones comprendidas entre los 120 y 320 bares a 40 ºC. Como resultado se obtuvo una mayor cantidad de capsaicinoides en menos tiempo, utilizando presiones de 320 bares, observándose que a los 30 minutos, a esa presión, ya se habían extraído la mayor parte de los capsaicinoides presentes en la muestra.
50 2.3.1.2 Extracción de capsaicinoides y carotenoides mediante enzimas
Ésta consiste en la síntesis de compuestos mediante la utilización de enzimas o complejos enzimáticos. Este tipo de síntesis suele utilizarse cuando la síntesis química resulta compleja y costosa, actualmente este punto de vista está cambiando y la síntesis enzimática está tomando una gran importancia.
Las transformaciones enzimáticas se llevan a cabo, bien a través de enzimas parcialmente purificadas, o mediante células completas para la producción de un amplio número de sustancias. Desde un punto de vista económico, los procesos biocatalíticos son a menudo más baratos y directos que sus análogos químicos. Sin embargo, muchas de las reglas que definen las biotransformaciones no son comprendidas todavía, por lo que existen muchas reacciones químicas en las que no existe su equivalente biocatalítico.
Hay diversos autores que han empleado esta metodología sintética para la obtención de capsaicinoides y compuestos de interés, tales como la extracción de aceites esenciales y comestibles, la producción de jugos de fruta o de vegetales, y la extracción de pigmentos, saborizantes y aromas, enfrenta problemas (el consumo de tiempo del proceso y la eficiencia de la extracción) debido a la compleja naturaleza química de los vegetales.
Las hidrolasas que tienen la capacidad de degradar los polisacáridos que constituyen la pared celular de los tejidos vegetales tales como la celulosa, la hemicelulosa y la pectina, reciben en la actualidad mayor atención principalmente en la industria alimentaría. Por lo que en las últimas décadas, en particular los preparados celulolíticos comerciales y los preparados con actividad múltiple, se han aplicado con éxito para facilitar y aumentar la liberación de productos de interés y para mejorar el proceso tecnológico mediante la predigestión enzimática de la pared celular de los tejidos vegetales (Lynd et al, 2005).
51 2.3.1.2.1 Celulasa
La celulasa, es un complejo enzimático esta conformado por endoglucanasas, exoglucanasas y (5- glucosidasas, las cuales hidrolizan sinérgicamente la celulosa cristalina, también contiene muchos aminoácidos y aproximadamente 241 número de residuos como podemos ver en el cuadro 13.
Cuadro 13: Aminoácidos presentes en celulasas.
Content (Residues /molecule)
Fuente: Zhang et al. (2006).
La producción celulasa por la acción microbiana para producir los azúcares fermentables (Choi, 2003) ha sido dé la consideración seria, investigación continua y actividades de desarrollo han sido llevado a cabo en laboratorios alrededor del mundo.
Las celulasas también se usan en la fabricación de productos útiles como etanol (Rajoka et al, 1992), como solvente en industrias, en la preparación de medicinas, las resinas, perfumes etc.
Las celulasas de origen bacteriano y fungico se usan en la industria para producción de alimento animal, fermentación de alcohol de grano y otros (Deshpande y Ericksson 1984; Kubicke et al., 1993), estas son producidas en sistemas de fermentación de substrato sumergidos o sólidos (Persson et al., 1991).
52 Existe un método para obtener celulasa a partir d microorganismos, esta es la fermentación sumergida o utilizando biopeliculas. Villena et al, (2007) utiliza esporas deAspergillus niger ATCC 10864 desarrolla la producción de celulasa por el método sumergido y biopeliculas. Luego las compara, como observamos en la figura 10 muestra el comportamiento en un tiempo de 0 - 120 h, mostrándonos que el rendimiento de obtención de celulasa por fermentación en biopeliculas es mayor frente a la fermentación sumergida.
Fuente: Villena et al. (2001).
Figura 10: Rendimiento de celulasa producido con Aspergillus niger producido en biopelículas.
La celulasa degrada a la celulosa, esta es químicamente un polímero muy simple. Se trata de un homopolimero formado por un máximo de 1 000 unidades de anhidroglucopiranosidos con enlaces 1, 4. La celulosa existe en las plantas superiores, en las algas, en muchos tipos de hongos y en los quistes de algunos protozoarios. El polisacárido está localizado en la pared celular donde se encuentra como unidades submicroscópicas de forma alargada conocidas como micelas, y estas micelas se arreglan en estructuras más grandes, las microfibrillas, las cuales están suficientemente empaquetadas para prevenir la penetración no sólo de
enzi
mas sino de pequeñas moléculas semejantes al agua (Lynd et al. 2002).53 Hidrolisis: La acción enzimàtica para llevar a cabo la hidrólisis de la celulosa implica la operación secuencial y (Figura 11) la acción sinergísta de un grupo de celulasas, la endo p-1,4 glucanasa (p-1,4 glucano glucanohidrolasa), la exo p-1,4 celobiohidrolasa y la p-1,4 glucosidasa (Zhang et al, 2006).
La endo p- 1,4 glucanasa hidroliza aleatoriamente los enlaces p- 1,4 glucosídicos intramoleculares accesibles de cadenas de celulosa para producir oligosacáridos de varias longitudes. La exo p-1,4 celobiohidrolasa cliva los extremos no reductores del sustrato generando unidades de celobiosa o glucosa y por último la p-1,4 glucosidasa, completa el proceso hidrolítico convirtiendo los fragmentos de celobiosa a glucosa o removiendo glucosa desde los extremos no reductores de pequeños celoligosacáridos (Zhang et al, 2006).
Figura 11: Hidrólisis de la celulosa
Fuente: Zhang et al, (2006)
54 Extracción de compuestos de interés, es la aplicación de enzimas celulasas o preparados con actividad enzimàtica múltiple (celulasa, hemicelulasa y pectinasa) debido a su efecto sinergístico, por el potencial que tienen sobre la hidrólisis de los componentes estructurales de la pared celular de los vegetales (Zhang et al, 2006) 3.3.1.2.2 Aspergillus niger es un hongo filamentoso perteneciente al grupo de los Deuteromicetos y a la familia Eurotium y se reproducen exclusivamente en forma de miscelos. Han sido considerados por largo tiempo como organismos ideales para el estudio de las características fisiológicas y genéticas de los eucariota debido a su fácil manipulación en el laboratorio, su capacidad para crecer en medios químicamente definidos de bajo costo y la rapidez de su crecimiento, que permite obtener varias generación es poco tiempo.( ver Cuadro 14)
Cuadro 14: Características del Aspergillus niger .
Sección Grupo Metula Vesícula Conidióforos Otros
Nigri A. niger Si/no globosa liso eclerocio
(a) microscópica (b) macroscópica
Fuente: Persson et al, 1991.
3.4 Cromatografía:
La cromatografía es un método que permite la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas, es común el uso de una fase estacionaria y otra móvil, en todas las separaciones cromatografícas la muestra se desplaza con una fase móvil, que puede ser un gas un líquido o un fluido supercrítico, esta fase móvil se hace pasar através de una fase estacionaria con la que es inmiscible y que se fija a una columna o a una superficie solida. Las dos fases se eligen
55 de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de modo indistinto entre la fase móvil y la fase estacionaria
Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil por el contrario, los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez, como consecuencia de distinta movilidad los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente.
Prácticamente todos los artículos publicados en los últimos 20 años sugieren el uso de la cromatografía de alta eficiencia (HPLC) para el análisis y cuantificación de los capsaicinoides y carotenoides.
3.4.1 Cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC).
La sigla HPLC en un comienzo se debió a “High Pressure Liquid Chromatography”, que hubo que cambiar a “High Performance Liquid Chromatography” cuando los cromatografistas se dieron cuenta de que la presión sólo constituía una herramienta que forzaba a la fase móvil a atravesar la columna, sin constituir una variable del sistema (Maldonado, 2005)
Tipos de Cromatografía Líquida
La cromatografía líquida puede desarrollarse en diferentes sistemas, en función de la forma física de la fase estacionaria.
Existen muchas maneras de clasificar la cromatografía líquida en columna. Basándose en la naturaleza de la fase estacionaria y en los procesos de separación, pueden enumerarse los tipos:
Cromatografía Líquido – Sólido (LSC) o de adsorción.
Cromatografía Líquido – Líquido (LLC) o de partición.
56
Cromatografía de Fase Ligada
Cromatografía de Intercambio Iónico
En cuanto a los dos primeros tipos, no siempre puede asegurarse cuál de los dos procesos implicados (adsorción o reparto) desempeña el papel más importante. Por esta razón, en la práctica se definen dos o más tipos, según sea la polaridad relativa de las dos fases: cromatografía en fase normal y cromatografía en fase reversa.
En la cromatografía en fase normal, la fase estacionaria es de naturaleza fuertemente polar (por ej. Sílice) y la fase móvil es apolar (por ej. n- hexano o THF). Las muestras polares quedan retenidas en la columna durante tiempos mayores que los materiales menos polares o apolares (Maldonado, 2005).
Solventes y aditivos de fase reversa.
Las fases móviles de fase reversa están formadas por mezclas de solventes polares, en general agua, y un modificador orgánico (Me OH, acetonitrilo, THF) con o sin el agregado de aditivos (sales inorgánicas o reactivos de apareamiento iónico).
Dioxano y THF se mezclan tanto con agua como con solventes no polares (cloroformo, hexano) y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa.
Agua: Es el más usado en HPLC. Se puede adquirir de calidad cromatográfica, o bien puede ser purificada por el mismo usuario. El agua destilada y desionizada, pueden encontrar limitaciones en HPLC por la presencia de sustancias orgánicas (ftalatos, cloraminas, etc.) que no se eliminan por el tratamiento aplicado. Las columnas de fase reversa, muy hidrofóbicas, tienen afinidad por compuestos de baja polaridad (Maldonado, 2005).
Metanol: Es el modificador orgánico más utilizado en fase reversa, en mezclas con agua o buffers. Por su mayor poder disolvente de sales y reactivos de apareamiento iónico se lo prefiere frente al acetonitrilo cuando es necesario
57 utilizar altas concentraciones salinas. Es poco tóxico y el más barato de grado HPLC. Genera presiones algo mayores y tiene mayor afinidad por el oxígeno que el acetonitrilo (Maldonado, 2005).
Acetonitrilo: Tiene una selectividad muy diferente a la del MeOH y es una primera alternativa cuando se busca cambiar la selectividad. El solvente grado HPLC se comercializa puro sin conservadores. Su baja c (190 nm) lo hace el adecuado cuando hay que trabajar a cortas. Es caro (Maldonado, 2005).
Tetrahidrofurano: Tiende a formar peróxidos, por lo que, se vende con antioxidantes (BHT, hidroquinona), los que absorben en el UV (Maldonado, 2005).
Dioxano: Tiene selectividad similar al THF, pero su alta viscosidad hace que no se emplee en HPLC, salvo como aditivo en pequeñas proporciones (Maldonado, 2005).