INTRODUCCIÓN
Pandemia COVID-19
Virus SARS-CoV-2
Estos hallazgos sugieren que Pangolin-CoV podría ser el origen común del SARS-CoV-2 y RaTG13, aunque esto aún está en debate (Zhang et al., 2020). El genoma consta de una cadena de ARN positiva (Wu et al., 2020).
Proteínas estructurales del SARS-CoV-2
- Proteína S
- Proteína N
- Proteína M
- Proteína E
Esta proteína consta principalmente de dos dominios: N-terminal (NTD) y C-terminal (CTD), conectados por una región conectora (LKR) que contiene una región rica en serina y arginina (SRD) (Zeng et al., 2020) . Además, es una de las proteínas involucradas en el proceso de ensamblaje del virus (Bianchi et al., 2020).
Vacunas basadas en proteínas contra SARS-CoV-2 (COVID-19)
Dentro de la célula infectada, la proteína E se encuentra principalmente en el retículo endoplásmico (RE) y el aparato de Golgi, participando en el proceso de unión, ensamblaje y tráfico de viriones infecciosos (Schoeman y Fielding, 2019). NVX-CoV2373 es la vacuna desarrollada por Novavax que contiene la proteína S recombinante con el adyuvante Matrix-M1™ y se administra en dos dosis separadas por 21 días (ClinicalTrials.gov, 2020b).
ANTECEDENTES
Diseño inmunoinformático de la vacuna multiepitópica usando las proteínas
Para PADRE, se ha informado de un aumento en la respuesta de las células T colaboradoras (Sarkar et al., 2022). Dagur (2020) realizó un estudio in silico de la proteína E del SARS-CoV-2 en busca de epítopos candidatos para el desarrollo de vacunas.
Importancia de las variantes de preocupación de SARS-CoV-2 para el diseño de vacunas . 9
La principal preocupación, dado que se ha demostrado que la gravedad de la enfermedad causada por Omicron es menor que la de Delta (Wolter et al., 2022), es que las vacunas y los tratamientos específicos no funcionen contra ella. En los últimos años se han logrado importantes avances en el campo de la inmunoinformática, que han permitido el desarrollo y la caracterización in silico de diseños de vacunas.
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos particulares
MATERIAL Y MÉTODOS
- Selección de epítopos
- Análisis de epítopos para células T CD8+
- Análisis de epítopos de células T CD4+
- Análisis epítopos de células B
- Refinamiento de las regiones
- Diseños finales
- Adición de enlazadores
- Adición de elementos finales del diseño de la vacuna
- Diseño de primers específicos
- Caracterización in silico de las proteínas quiméricas
- Evaluación de seguridad y caracterización de propiedades fisicoquímicas
- Modelaje 3D
- Selección de péptidos para producción de sueros hiperinmunes
Al igual que con los epítopos de MHCI, durante la selección se consideraron las mutaciones del virus. Se añadió un codón de parada (tga) a las construcciones finales en el extremo 3' de la secuencia.
RESULTADOS
Selección de epítopos y refinamiento
- Análisis proteína E
- Análisis proteína M
- Análisis proteína N
- Análisis proteína S
Porcentajes de cobertura poblacional de alelos MHCII iniciales y mejorados con refinamiento de secuencia seleccionado para la proteína E. Porcentajes de cobertura poblacional de alelos MHCI iniciales y mejorados con refinamiento de secuencia seleccionado para la proteína M. Porcentajes de cobertura poblacional de alelos iniciales y mejorados. MHCI mejorado mediante el refinamiento de la secuencia seleccionada para la proteína N.
Porcentajes de cobertura poblacional de alelos MHCII iniciales y mejorados con el refinamiento de secuencia seleccionado para la proteína N. Cobertura poblacional de alelos MHCI iniciales y mejorados con el refinamiento de secuencia obtenido para la proteína S. Porcentajes de cobertura poblacional final de alelos MHCII de la secuencia seleccionada para la proteína S.
Análisis final de las regiones multiepitópicas seleccionadas
- Cobertura poblacional final promedio
- Cobertura poblacional por proteína
- Afectaciones de nuevas variantes Ómicron
Para la proteína E, al menos uno de los tres programas sugirió al menos un epítopo que cumplía todos los criterios de selección para 17 de los 19 alelos HLA-A; y también sugerido para 16 de los 32 alelos HLA-B considerados. Las barras representan el número promedio de epítopos de los tres programas utilizados que cubren el alelo correspondiente. Para la proteína E, existe al menos un epítopo que responde a los criterios de selección propuestos por al menos un programa que abarca 11 de los 15 alelos considerados del grupo HLA-DRB.
Para la proteína M, 12 de los 15 alelos considerados del grupo HLA-DRB están cubiertos por al menos un epítopo que cumple con los criterios de selección propuestos por al menos un programa. Representación gráfica del número de epítopos T CD4+ obtenidos de la proteína M que cumplieron los criterios de selección para cada alelo MHCII. Representación gráfica del número de epítopos T CD4+ obtenidos de la proteína S que cumplieron los criterios de selección para cada alelo MHCII.
Diseños finales
- Construcciones finales
- Diseño de primers específicos
Notas: Las letras resaltadas en verde indican el sitio de escisión de SmaI; Las letras subrayadas indican el péptido señal; Las letras resaltadas en amarillo indican conexiones; Las letras resaltadas en cian indican la cola de histidina; Las letras resaltadas en rojo indican señal de retención del retículo endoplásmico; Las letras rojas en negrita indican el codón de parada; Las letras resaltadas en violeta indican la ubicación. Se presenta la selección de cebadores específicos para la amplificación de los genes a utilizar para la producción de la vacuna CIB-GIVac, tanto para productos de PCR como de qPCR (Tabla 26). Cabe señalar que, para el gen SARS2_M, se utilizó el mismo cebador directo en las reacciones de PCR y qPCR.
Los pares de cebadores para ambos tipos de PCR del gen SARS_E no son exclusivamente específicos de esta secuencia. Dado que ninguno de estos organismos está involucrado en ninguno de los procesos de producción de vacunas, sus no especificidades no son esenciales para evitar la selección de cebadores. Cebadores elegidos para PCR y qPCR de los genes con sus correspondientes datos extraídos de Primer3 y Primer-BLAST.
Caracterización in silico de las proteínas quiméricas
- Evaluación de seguridad y caracterización de propiedades fisicoquímicas
- Modelaje 3D
- Modelaje de la Proteína E
- Modelaje de la Proteína M
- Modelaje de la Proteína N
- Modelaje de la Proteína S
- Selección de péptidos para la producción de sueros hiperinmunes
Distribución de residuos de SARS2_E en las regiones de las parcelas de Ramachandran y factor de calidad general. La diferencia más obvia con el modelo refinado es la posición que adoptan las regiones (Fig. 15). Dos de los aminoácidos de la molécula se encuentran en regiones desfavorables del gráfico de Ramachandran, siendo la leucina en la posición 84 y la treonina en la posición 178.
Desglose de la distribución de los residuos de SARS2_M en las regiones de las parcelas de Ramachandran y factor de calidad general. Desglose de la distribución de los residuos de SARS2_N en las regiones de las parcelas de Ramachandran y factor de calidad general. Desglose de la distribución de los residuos de SARS2_S en las regiones de las parcelas de Ramachandran y factor de calidad general.
DISCUSIÓN
Selección y refinamiento de las regiones multiepitópicas
Las nuevas líneas de Ómicron han servido para evaluar la validez de los modelos de vacunas creados en este trabajo. 6, pudimos ver que estos dos alelos afectados en MHCflurry están cubiertos por al menos un epítopo sugerido por uno de los otros dos programas que cumple con los criterios. Esta última mutación tiene la particularidad de estar presente en algunas de las líneas de Ómicron, pero no en todas.
Si bien en el momento actual de la pandemia parece ser una mutación predominante, pues ocurre en el 67% de los casos, su comportamiento histórico indica que puede ocurrir o no en las variantes Ómicron. Por otro lado, es una sustitución conservadora, por lo que el procesamiento del MHC no podría verse afectado (da Costa et al., 2021). Es de destacar que esta mutación es la que omite el único epítopo que podría cubrir el alelo B*18:01 en cualquiera de los programas (Fig. 6).
Diseños finales
Para aumentar la inmunogenicidad de la vacuna, se añadió la secuencia adyuvante PADRE, también conocida como epítopo pan-DR, que ha demostrado ser segura en humanos (Sarkar et al., 2022). Agregar una etiqueta de histidina es una práctica común en el diseño de vacunas recombinantes porque facilita la purificación y la solubilidad de las proteínas (Ki y Pack, 2020). También es útil para la detección y cuantificación de antígenos utilizando anticuerpos específicos contra His en técnicas como Western Blot y ELISA (Ramos-Vega et al., 2021).
Se ha evaluado que el uso de una etiqueta de 6-histidina puede inducir anticuerpos neutralizantes mejor que las cadenas de histidina más cortas (Chen et al., 2022). El primero es un péptido de la proteína de almacenamiento vegetativo de Glycine max (soja) (Romero-Maldonado et al., 2016). Por otro lado, la secuencia SEKDEL se utiliza para prevenir la secreción de la proteína recombinante (Ramos-Vega et al., 2021).
Caracterización in silico de las proteínas quiméricas
Además, estas dos propiedades muestran una correlación ya que los residuos alifáticos son hidrófobos, por lo que un índice alifático más alto conduce a un aumento de la hidropatía y viceversa (Sun et al., 2020). GalaxyRefine es un servidor que mejora la estructura de modelos de proteínas reconstruyendo cadenas laterales y evaluando posibles choques y rotámeros (Heo et al., 2013). El servidor ERRAT evalúa el porcentaje de residuos que se encuentran dentro de un intervalo de confianza comparando la estructura con datos cristalográficos de alta resolución (Mahmud et al., 2021).
Lo deseable en un modelo es tener más del 85% de la estructura en regiones favorables (Yang et al., 2021). El valor GDT-HA proporcionado en el programa GalaxyRefine indica la similitud entre dos proteínas (Yang et al., 2021). En este servidor, un valor RMSD entre 0 y 1,2 es aceptable para sugerir una estructura estable (Yang et al., 2021).
CONCLUSIONES
Los diseños multiepítopos basados en las proteínas estructurales del SARS-CoV-2 generados en este estudio predicen una buena respuesta humoral y celular en la población global y tienen el potencial de mantenerse vigentes ante la aparición de nuevas variantes del virus. . Todas estas construcciones se diseñaron para insertarse en los vectores de expresión pAlgevir y pBI121. También se han diseñado péptidos sintéticos que se utilizarán para producir sueros hiperinmunes para su uso en ensayos de expresión y cuantificación de proteínas.
Los modelos diseñados están destinados a funcionar como vacunas individuales o mezclas que contengan todas o algunas de ellas. Además, sería deseable medir la prevalencia de respuestas humorales y celulares después de los ensayos. Los programas de PCR de punto final para la amplificación de todos los genes ahora están estandarizados.
LITERATURA CITADA
Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential development of antiviral drugs for COVID-19. Exploration of SARS-CoV-2 structural proteins for the development of multi-epitope vaccines: an in-silico approach. Structure and drug binding of the SARS-CoV-2 envelope protein transmembrane domain in lipid bilayers.
Early assessment of the clinical severity of the SARS-CoV-2 Omicron variant in South Africa: a data linkage study. Structural basis for the different states of the peak protein of SARS-CoV-2 in complex with ACE2. An in silico deep learning approach to multi-epitope vaccine design: a SARS-CoV-2 case study.
ANEXOS
Los genes sintéticos enviados por la empresa Gene Universal fueron insertados en los vectores pAlgevir y pBI121 basándose en la metodología de Márquez-Escobar et al. La extracción de ADN plasmídico se realizó con el kit de extracción de ADN PureLink® Quick Plasmid Miniprep Kit (K210011 Invitrogen), según la metodología del fabricante. Para confirmar la calidad de las extracciones, se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1,2% a 120 V durante 30 minutos y se observó en el fotodocumentador BioRad Gel Doc® EZ Imager.
Finalmente, la purificación se confirmó mediante electroforesis cualitativa comparando la muestra obtenida con ADN no digerido del mismo vector en un gel de agarosa al 1,5% a 120 V durante 30 min. Se digirió el ADN plasmídico y se confirmó la digestión mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2 % a 120 V durante 30 minutos y observando la banda genética de interés en el BioRad Gel Doc® EZ Imager. Finalmente, la amplificación se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% a 120 V durante 30 minutos, con el marcador DNA Ladder 100 pb (N3231S NEB) y se observó en el BioRad Gel Doc® EZ Imager (Fig. 24).
