En este escenario, las herramientas inmunoinformáticas permiten identificar proteínas como candidatos vacunales que pueden expresarse en la microalga Chlamydomonas reinhardtii, que es inofensiva para los animales, aprovechando la inserción plastidial como estrategia de expresión. A los amigos de mi maestro Marcelo, Luis, Edisa, Paloma, Sergio, Peter, Eli, Pau, Kike, Betsy, Diana, Victor, Cristina, Pistina, Daniel, Tomás, Angélica, Cintya, Pipina, José Angel, Denisse, Bryan, Samuel y a Susani por compartir conocimientos en diversos campos de la ciencia y de la vida misma. A las personas del Laboratorio de Biotecnología Molecular I y II, que me recibieron con los brazos abiertos y compartieron sus conocimientos: Karlita y Daniel, Marychuy por ayudarme a escribir la tesis.
Analí Gámez por su paciencia, su aporte en las correcciones de la tesis y por estar siempre ahí para ayudarme cuando tenía dudas.
INTRODUCCIÓN
- Género Mycobacterium
- Complejo Mycobacterium avium
- Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
- Paratuberculosis: Etiología, Signos Clínicos y Patogénesis
- Impacto de la Paratuberculosis a Nivel Mundial
- Paratuberculosis en México
- Desarrollo de Vacunas
- Selección inmuno-informática de antígenos: Vacunología Inversa
- Plataformas de producción de proteínas recombinantes
- Microalgas como plataformas de producción de proteínas recombinantes
- Transformación genética de cloroplastos
- Producción de proteínas recombinantes en el cloroplasto de Chlamydomonas
MAP es el agente causante de la paratuberculosis o enfermedad de Johne caracterizada por enteritis crónica, linfagititis y linfadenopatía mesentérica (Buergelt et al., 1978). Los enfoques actuales tienen como objetivo producir vacunas contra la paratuberculosis de una manera que proporcione una protección completa en modelos de infección. La elección del sistema de expresión depende de la proteína de que se trate y de la aplicación que se le vaya a dar.
En algunos casos, la glicosilación de proteínas determina la estabilidad, solubilidad, antigenicidad, plegamiento, localización, actividad biológica y vida media de circulación de las proteínas (Palomares et al., 2004).
ANTECEDENTES
12 El primer informe de un antígeno sintetizado en algas fue de la molécula quimérica que comprende la proteína estructural VP1 del virus de la fiebre aftosa y la subunidad beta de la toxina del cólera (CTB), un conocido adyuvante de la mucosa (Sun et al., 2003 ). Este antígeno ya se ha expresado en plantas y se ha demostrado que provoca inmunidad oral en ratones (Wigdorovitz et al., 2009). Más recientemente, en 2013, Demurtas y sus colaboradores produjeron E7GGG, que es una forma mutada y atenuada de la oncoproteína E7 del virus del papiloma humano (VPH) tipo 16.
Por lo tanto, la estrategia de este trabajo fue generar los vectores de transformación de cloroplastos de C.
JUSTIFICACIÓN
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS PARTICULARES
MATERIALES Y MÉTODOS
- Análisis in silico
- Predicción de regiones de unión al CMH II y localización sub celular
- Alineamiento de las secuencias candidatas
- Predicción de epítopos a células T
- Predicción de péptidos de unión al CMH II
- Predicción de Epítopos de células B
- Predicción de Epítopos de Linfocitos T citotóxicos
- Análisis Fisicoquímicos in silico
- Hidrofobicidad
- Punto isoeléctrico
- Estructura Secundaria
- Microrganismos utilizados
- MAP ATCC19698
- E. coli Top10F´
- Chlamydomonas reinhardtii CC-125 wild type mt+ [137c]
- Extracción de ADN genómico (ADNg) de MAP
- Diseño de iniciadores
- Amplificación por PCR de los genes candidatos
- Electroforesis de ADN en geles de agarosa
- Purificación de los genes candidatos
- Digestión de ADN con enzimas de restricción
- Tratamiento con fosfatasa alcalina
- Ligación de fragmentos de ADN
- Preparación de células calcio competentes
- Minipreparación de ADN plásmidico
- Maxipreparación de ADN plásmidico
- Cultivo de C. reinhardtii, transformación y condiciones de crecimiento
- Preparación de microacarreadores de tungsteno
- Metodología de Bombardeo
- Selección de colonias transformadas y subcultivos
- Confirmación de transformación por PCR
- Extracción de proteínas de C. reinhardti
- Electroforesis de proteínas en geles de acrilamida (SDS-PAGE)
- Western Blot
Se realizó la amplificación por PCR de algunos de los genes MAP seleccionados. La amplificación de los genes candidatos con los cebadores de la Tabla II se realizó según las condiciones del kit KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen), una enzima de alta fidelidad utilizada para la amplificación de plantillas de ADN ricas en guaninas y citosinas. 22 En el caso de los genes candidatos, la amplificación con los cebadores JAB476 y JAB477 se realizó con la enzima Phusion DNA Polymerase (New England Biolabs) según las condiciones sugeridas por el proveedor, utilizando las mismas temperaturas de hibridación que con los cebadores. .
Se escindieron los productos correspondientes al tamaño de los genes y se añadió a los tubos Eppendorf un volumen igual de solución de unión a membrana incluida en el kit Wizard® SV Gel y PCR Clean-Up System (Promega). El producto de la PCR se incubó durante un minuto en las columnas SV a temperatura ambiente y luego se centrifugó de modo que este producto de la PCR pasara a través de la membrana de las columnas SV. Se incubó durante la noche a 4 °C y luego se usaron 2-7 μL de la mezcla para la transformación con células competentes en calcio de E.
Para la reacción de confirmación de la transformación por PCR se tomaron 2 μL de la extracción de ADN C. Para la obtención de proteínas recombinantes, además del uso de la expresión en cloroplastos, se utilizó la cepa estrella BL21 de E. Bloquear la membrana con una solución de leche desnatada al 5%.
Luego del bloqueo de la membrana, se realizaron cinco lavados con PBST (previamente frío) durante cinco minutos, cada uno con agitación. Al final de la hora, se descartó el anticuerpo anti-DDDDK y se realizaron cinco lavados con PBST.
RESULTADOS
- Análisis in silico
- Predicción de regiones de unión al CMH II y localización sub celular
- Alineamiento de las secuencias candidatas
- Predicción de péptidos de unión al CMH I y II
- Predicción de epítopos de células B y Linfocitos T citotóxicos
- Predicción de la respuesta inmune
- Análisis Fisicoquímico
- Punto isoeléctrico, Hidrofobicidad y estructura secundaria
- Evaluación de la transformación genética del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii. 39
- Subclonación de los genes candidatos al vector pBlueScript II SK (+)
- Transformación del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii
- Confirmación por PCR de las cepas transformadas de C. reinhardtii
- Electroforesis de proteínas en geles de acrilamida (SDS-PAGE)
- Western blot
Se predice que cada proteína posee una gran cantidad de epítopos de afinidad débil y un número relativamente bajo de epítopos de afinidad fuerte por cualquiera de los MHC. La amplificación de los genes MAP0065, MAP0215 y MAP0901, correspondientes a los carriles 1, 4 y 5, no se logró por no utilizar las temperaturas óptimas de alineamiento, mientras que los carriles 7 y 8 correspondientes a los genes MAP2327 y MAP3101 presentaron múltiples respectivamente. amplicones (Figura 3). 40 De manera similar, se diseñaron los cebadores RSS3-RSS4, RSS5-RSS6, RSS7-RSS8 y RSS9-RSS10 que contienen los sitios de corte Nde I y Sph I además de la secuencia codificante 3x FLAG en el extremo 5' para la amplificación de los genes. MAP0189, MAP1609 (Ag85b), MAP2100 y mTagpBFP respectivamente.
En el caso de los genes MAP0164 y MAP0189, el primer nucleótido en el codón de inicio fue reemplazado de una guanina a una adenina debido al uso preferencial de codones C. Posteriormente se realizó la amplificación de los genes MAP0164, MAP0189, MAP2100 y mTagBFP. con los cebadores que contienen la etiqueta FLAG 3x y los sitios de corte Nde I y Sph I. Las temperaturas de hibridación en la PCR para la amplificación de los genes fueron de 64°C para MAP0164 y MAP0189, mientras que para mTagBFP y MAP2100 fueron de 66°C (Figura 4).
La reacción de ligación de genes se realizó en el plásmido pBlueScript II SK (+) (Figura 15) para obtener un número de copias mayor. 42 Se transformó con células competentes en calcio como el resto de genes y se seleccionaron las colonias que contenían el inserto. La inserción de los genes candidatos en el vector pkM3 se confirmó mediante digestión enzimática en la que se obtuvieron los tamaños esperados (Figura 6).
La amplificación de los genes MAP2100 y mTagBFP se realizó con los cebadores JAB476 y JAB477, que amplifican el promotor psbA y el terminador rbcL, estos contienen el sitio Pac I. 44 La introducción de los genes MAP2100 y MAP0189 se confirmó mediante restricción y secuenciación. en la orientación correcta y los marcos de lectura del vector de expresión p320. El número de colonias resistentes se refiere a aquellas colonias que dominaron el medio de selección durante al menos 45 días después del bombardeo.
La Figura 8 ilustra la secuencia dada a las cepas que pueden haber sido transformadas con cada uno de los vectores de transformación de cloroplastos.
DISCUSIÓN
- Unión y promiscuidad al CMH
- Localización subcelular
- Homología con el huésped
- Predicción de la respuesta inmune
- Potencial de proteínas de membrana como vacunas de sub unidades
- Transformación del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii
La localización subcelular de proteínas ha sido un criterio importante en el desarrollo de vacunas subunitarias, como lo fue para el desarrollo de la vacuna contra la meningitis MenB (Pizza et al., 2000). Por lo tanto, las proteínas de la superficie de la membrana y las proteínas secretadas son de interés por su potencial como candidatos a vacunas u objetivos de diagnóstico (Rodríguez-Oretga et al., 2006). Después de la activación, las células CD4+ pueden diferenciarse en subpoblaciones Th1 o Th2 según la naturaleza del antígeno presentado (Coussens et al., 2010).
Gurung et al., (2012) encontraron resultados similares y asociaron el reordenamiento péptido/epítopo previsto con una posible activación de la respuesta de las células Th CD4+. Por otro lado, MAP2100 tiene una función transportadora ABC prevista, que es esencial en la viabilidad y patogenicidad celular (Davidson et al., 2008). Rendimiento de 100 μg de proteína purificada por Se ha obtenido 1 g de biomasa de algas secas (Tran et al., 2009), pero la mayoría de las proteínas recombinantes producidas en C.
Por lo tanto, los niveles de acumulación de proteínas recombinantes en las algas están todavía por debajo de los alcanzados por otros sistemas de producción procarióticos (Surzycki et al., 2009) aguas arriba y aguas abajo de la región codificante e incluyen el promotor, la región 5' no traducida (5' UTR) y Región 3' no traducida (3' UTR). Una de ellas es que para obtener mejores rendimientos de proteínas recombinantes se deben realizar mejoras en la optimización de codones (Franklin et al., 2002; Surczyki et al., 2009).
Está bien establecido que los genomas de varios organismos utilizan la preferencia de codones para optimizar y regular la expresión de proteínas (Gustafsson et al., 2004). Al mismo tiempo, el acoplamiento de proteínas débilmente expresadas con proteínas expresadas de manera estable ha mostrado un aumento en la acumulación de las primeras en sistemas de expresión como los cloroplastos (Muto et al., 2009).
CONCLUSIONES
PERSPECTIVAS
BIBLIOGRAFÍA
Identificación del polymorphismo genético de isolations de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis de caprinos del centro de Mexico. Efficacy of different pasteurization time-temperature conditions in combination with homogenization in the inactivation of Mycobacterium avium subsp. The problem of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis and its relation to the causation of Crohn's disease.
Environmental risk factors for the acquisition of Mycobacterium avium complex in persons with human immunodeficiency virus infection. Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, by means of PCR-anidada and partir of muestras de heces de ovinos. Distribution of Mycobacterium avium complex isolates in tissue samples from pigs fed peat naturally infected with supplemental mycobacteria.
Prevalencia de infección por Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis en rebaños de ovinos de dos municipios de San Luis Potosí, México. Análisis ProPred y evaluación experimental de epítopos de células T promiscuos de tres antígenos secretados principales de Mycobacterium tuberculosis. Respuestas inmunes diferenciales del ciervo (Cervus elaphus) después del desafío experimental con Mycobacterium avium subsp.
Early infection dynamics after experimental challenge with Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in calves show limited calf-to-calf transmission and no impact of Hsp70 vaccination. Molecular identification and characterization of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in free-living non-human primate (Rhesus macaques) from northern India.
ANEXOS
- Medios de cultivo
- Antibióticos
- Mantenimiento y conservación de cepas
- Vectores plasmídicos
- Geles de electroforesis de proteínas
Para evitar la pérdida de plásmidos introducidos en los microorganismos, fue necesario mantenerlos bajo presión selectiva añadiendo antibióticos correspondientes a la resistencia del plásmido contenido en el medio de cultivo. Para una cantidad de 100 mg/ml, se disolvieron 100 mg de ampicilina en 1 ml de agua con kanamicina milliQ. Para una solución madre de 50 mg/ml, se disolvieron 50 mg de kanamicina en 1 ml de agua milliQ.
Este vector se utilizó para la clonación de los genes de interés con un promotor y un terminador rodeados por la enzima Pac I. El plásmido p320, realizado por el grupo de trabajo del laboratorio de Biotecnología Molecular, es una modificación del plásmido p322, del que forma parte de una biblioteca genómica del cloroplasto de C. Este plásmido tiene las secuencias psbA-intron4 y psbA-exón5, que son los sitios de recombinación que se encuentran en el genoma del cloroplasto de C.
La ubicación de Bamhi contiene el gen alfa-6, que se utiliza para seleccionar resistencia al antibiótico kanamicina.
