Una alternativa de apoyo para la erradicación de la TBB es la selección genética de animales con resistencia natural a la infección por micobacterias. Gracias a mis padres y hermanos por enseñarme los valores importantes de la vida, por el apoyo incondicional y sobre todo por el amor que me han brindado.
Tuberculosis bovina
Según datos de SAGARPA (Figura 1), como resultado de la Campaña Nacional para el control y erradicación de la TBB basada en la prueba de tuberculina que detecta animales infectados por M. La falta de éxito en la erradicación de la tuberculosis indica la necesidad de crear nuevas estrategias de control.
Etiología de la tuberculosis bovina
Intercaladas están las proteínas de la pared celular, fosfatidilinositol manósido (PIM), lípidos que contienen tiocerol, lipomanano y liporabinomanano (Figura 2) (Chatterjee et al. 1998; Brennan 2003). Otro componente de la pared celular es el fosfatidilinositol manósido (PIM), cuya interacción con el TLR2 de los macrófagos se ha demostrado que aumenta la fusión de los fagosomas con los endosomas tempranos (Vergne et al. 2004).
Patogénesis de la tuberculosis bovina
Dentro de los alvéolos, los macrófagos alveolares fagocitan las bacterias, luego se produce la fusión con el fagolisosoma para la posterior destrucción de las micobacterias y el procesamiento de antígenos (Hope et al. 2004). Otra posible consecuencia de la exposición a micobacterias es que la vaca no pueda eliminar el bacilo o mantenerlo latente dentro de los granulomas, provocando que el animal enferme (Pollock et al. 2002).
Macrófagos
- Clasificación
- Funciones
- Fagocitosis
- Procesamiento y presentación de antígeno
- Mecanismos bactericidas
- Producción de citocinas y quimiocinas
- Macrófagos en la resistencia
Los macrófagos M2 pueden diferenciarse en diferentes subtipos cuando se estimulan con IL-4 o IL-13 (M2a), con complejos inmunes/ligandos TLR (M2b) o con IL-10 y glucocorticoides (M2c) (Solinas et al. 2009). En base a esto, estas células se clasifican según sus funciones inmunológicas, macrófagos “clásicamente activados” (M1) y macrófagos “alternativamente activados” Fuente: (Solinas et al. 2009). Esto guía la polimerización de actina en el sitio de ingestión y la internalización de partículas a través de un mecanismo basado en actina (Aderem et al. 1999).
La formación del fagosoma es un proceso crucial para la eliminación de patógenos invasores y, como se mencionó anteriormente, para el procesamiento y presentación de antígenos (Vergne et al. 2004). Un papel importante de esta citoquina es la inducción de la activación de macrófagos (Orme et al. 1999), es decir, la producción de ROS, RNS y quimiocinas (Zuniga et al. 2012). En humanos, una deficiencia de esta citoquina aumenta la susceptibilidad a infecciones por micobacterias (Filipe-Santos et al. 2006).
Sus funciones son inducir la migración de leucocitos, angiogénesis, producción de colágeno y proliferación de precursores quimiotácticos (Mantovani et al. 2004). La proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), también conocida como CCL2, es crucial para el reclutamiento y agregación de células inflamatorias para la formación de granulomas y la contención de micobacterias (Arji et al. 2012).
ANTECEDENTES
Las bases moleculares de la resistencia a la tuberculosis han sido ampliamente estudiadas, pero los resultados obtenidos en algunas especies no son aplicables a otras. En ratones, se ha observado que la proteína Nramp1 (que funciona como transportadora de iones divalentes a través de la membrana fagosómica, privando a las bacterias de nutrientes) desempeña un papel importante en la resistencia a la tuberculosis (Frehel et al. 2002). ). Un ortólogo de Nramp1 está presente en el ganado vacuno, pero en este modelo animal aún no se ha observado un papel de esta proteína en la resistencia a TBB en condiciones naturales (Barthel et al. 2000).
Existen estudios previos realizados en bovinos en los que se observó que macrófagos de vacas eran resistentes a B. En el caso de los macrófagos que controlan mejor la replicación de BCG (resistentes), también controlan mejor la replicación de una cepa de campo de M en un En un estudio realizado en Etiopía se observó que la prevalencia de TBB era mayor en vacas Holstein (Bos taurus) en comparación con las de la especie Cebú (Bos indicus), y mayor en vacas mestizas. la gravedad de la enfermedad fue mayor en la raza europea (Ameni et al. 2007).
Además, también se ha demostrado que favorece el control de M un macrófago que produce RNS y ROS a partir del estallido respiratorio y que produce mayores niveles de IL-12, una citocina proinflamatoria y moduladora de la respuesta inmune anti-Th1. es posible que exista un fenotipo bactericida y proinflamatorio en macrófagos de ganado sano expuesto a M.
JUSTIFICACIÓN
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
DISEÑO EXPERIMENTAL
Criterios de inclusión
Criterios de exclusión
MATERIALES Y MÉTODOS
- Preparación del inóculos de M. bovis BCG
- Ensayo bactericida
- Cuantificación de nitritos (Ensayo de Griess)
- Ensayo de reducción del azul de tetrazolio
- Preparación de la muestra y extracción de RNA
- Síntesis de cDNA
- PCR tiempo real
Se incubó a 37°C y 5% CO 2 y se cultivó durante 24 h, se retiraron las células no adherentes y se añadió más medio de cultivo. Las células se lavaron y el medio se cambió cada tres días o, si era necesario, con medio RPMI suplementado con FBS al 10%. Se preparó una suspensión de las células recolectadas a 1 x 106 células/ml. Se tomaron 10 µl de esta suspensión y se colocaron en cada uno de los pocillos designados para el ensayo para dar una concentración final de 1 x 10 4 células/pocillo.
Las placas se incubaron a 37 °C y 5% de CO2 para permitir que los macrófagos se adhieran a la superficie. Una vez adheridos, se eliminó el sobrenadante de los pocillos y las células se infectaron con 100 µl de suspensión M. Placa 0 h, las células se lisaron colocando 100 µl Tritón al 1% (SIGMA), se pipeteó varias veces cuidando de tocar solo los bordes del pocillo y no el fondo, se sacó el tritón y se colocó en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. , 3 réplicas de este Se realizó el procedimiento de lisis. En una placa de 96 pocillos, se colocaron 100 µl de la suspensión de 5x105 células/ml en los pocillos que se determinó que el ensayo tenía 5x104 células/pocillo.
En una placa de 24 pocillos, se sembraron 5x10 células por triplicado en cada pocillo. Se incubaron durante 24 horas a 37°C y 5% de CO2 para permitir que las células se adhirieran. Una vez adherido, el sobrenadante se retiró de los pocillos y se infectó. las células con 500 µl de una suspensión de M. Se retiró el medio de cultivo de los pocillos, se añadieron 200 µl de Trizol y las células se lisaron inmediatamente mediante pipeteo repetido.
RESULTADOS
Los macrófagos obtenidos se estimularon con zimosán (10 partículas/célula) y LPS (10 y 100 ng/ml) para demostrar que los macrófagos estaban activos y funcionales. Se observó que los macrófagos estimulados con LPS (100 ng/ml) respondieron generando una mayor cantidad de NO, en comparación con los otros estímulos. Nuestros resultados muestran que los macrófagos de vacas sanas y expuestas (PPD-) cuando se infectan con M.
El propósito de este ensayo fue evaluar si los macrófagos de las vacas PPD-generaban mayores cantidades de radicales de oxígeno que los de las vacas PPD+ cuando se infectaban con M. Las estimulaciones se realizaron con M. Los resultados se analizaron utilizando la prueba de Mann Whitney y muestran una diferencia significativa. La Figura 12 muestra imágenes microscópicas, el panel “A” muestra macrófagos no estimulados, el panel “B” muestra macrófagos estimulados por LPS, algunos de los cuales se pueden ver agregados y de color azul pálido. , en el panel "C" se puede observar que los macrófagos infectados con M. bovis responden formando un mayor número de aglomerados y con una mayor intensidad de color azul.
No se mostró diferencia en la expresión de los genes TNF-α y CCL2 entre los macrófagos de vacas sanas expuestas y aquellas infectadas con tuberculosis (Figuras 13 y 14). Los macrófagos de vacas sanas expuestas mostraron una mayor expresión de iNOS, hasta una vez mayor, en comparación con los de vacas enfermas con tuberculosis (Figura 15), lo que se correlaciona con los resultados de producción de nitritos.
DISCUSIÓN
Algunos autores sugieren que los macrófagos humanos tienen un mecanismo antimicobacteriano independiente del NO (Chan et al. 2001; Liu et al. 2008), sin embargo, existen otras publicaciones en las que demuestran que los macrófagos humanos son capaces de generar NO, observando una correlación entre su generación y la inhibición del crecimiento intracelular del bacilo (Rich et al. 1997; Schon et al. 2004). Hay informes en modelos de ratón en los que no se observa una relación entre la eliminación de micobacterias y la formación de ROS (Chan et al. 1992).
En humanos se muestran datos contrastantes, ya que se encontraron mutaciones en el gen gp91phox en una población de jóvenes chinos, por lo que los autores sugieren que el estallido respiratorio es esencial para el control de la tuberculosis (Lau et al. 1998). En humanos, se ha demostrado que esta citocina desempeña un papel importante en el control de la infección, ya que su neutralización conduce a la reactivación de la tuberculosis (Mohan et al. 2001). Un metanálisis realizado en China no mostró asociación entre el TNF (polimorfismo -238G/A) y la susceptibilidad a la tuberculosis (Zhang et al. 2012).
También se ha demostrado una alta expresión sérica de esta quimiocina en pacientes con tuberculosis activa en comparación con pacientes con tuberculosis latente (Frahm et al. 2011). Se han realizado estudios en ganado que muestran una alta presencia de la enzima iNOS en ganglios linfáticos y granulomas pulmonares durante la infección con micobacterias (Pereira-Suarez et al. 2006).
CONCLUSIONES
PERSPECTIVAS
BIBLIOGRAFÍA
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ANEXOS
