UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS EVOLUCIÓN DE LAS BACTERIAS ACIDO LÁCTICAS DURANTE LA
ELABORACIÓN DEL TOCOSH FRESCO, AISLAMIENTO Y CONCENTRACIÓN POR LIOFILIZACIÓN
TESIS
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
PRESENTADO POR LOS BACHILLERES:
FERNANDEZ LIMACHE, Abel ROMERO PAUCAR, Jessica
HUANCAYO - PERÚ
2020
ASESOR:
Dr. FREDY EMILIO YABAR VILLANUEVA
EVOLUCIÓN DE LAS BACTERIAS ACIDO LÁCTICAS DURANTE LA ELABORACIÓN DEL TOCOSH FRESCO, AISLAMIENTO Y CONCENTRACIÓN POR LIOFILIZACIÓN
A. FERNANDEZ Y J. ROMERO COMO TESISTAS, E. F. YABAR COMO ASESOR, RECONOCEN EL APOYO FINANCIERO DEL PROYECTO CONCYTEC-BANCO MUNDIAL “BIOPROCESAMIENTO DEL TOCOSH, PRODUCCIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS PROBIÓTICAS, BACTERIOCINAS Y SU APLICACIÓN EN LA BIOPRESERVACIÓN DE ALIMENTOS”, PROPUESTA N° 59983, A TRAVÉS DE SU UNIDAD EJECUTORA FONDECYT. [CONTRATO N° 170-2018-FONDECYT-BM- IA&DT-SE], CON EL OBJETIVO DE CUANTIFICAR LAS BACTERIAS ACIDO LÁCTICAS DURANTE LA FERMENTACIÓN CONTROLADA Y TRADICIONAL DE LA PAPA PARA LA OBTENCIÓN DE TOCOSH FRESCO, AISLAR Y CONCENTRAR POR LIOFILIZACIÓN.
“JUNTOS ESTAMOS TRANSFORMANDO EL PERÚ”
DEDICATORIA
A Dios, por darme la oportunidad de vivir, por ser mi guía.
A mi padre Juvenal, por ser el motor incansable de todos mis sueños.
A mi mamá Paulina, por ser mi mayor tesoro.
A mi hermana Rayda, mi fuerza para seguir adelante.
A mis hermanos Teófilo C., José M., Daniel y Saúl.
Y mis sobrinos: Jhordan, Juvenal, Maryori, Jhosibel, e Iván, ¡con todo mi amor!
Abel
Esta tesis se la dedico a Dios por haberme dado la vida, y a mis padres Melizerio León y Lida Doris, por ser los pilares más importantes de mi formación profesional y por demostrarme siempre su gran cariño e incondicional apoyo.
A mis hermanos Royer y Brayan Dani por la gran confianza depositada en mí.
A mi mamita Timoteo que desde el cielo guía mi camino.
Jessica
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios por darnos salud y sabiduría, darnos fuerzas para superar dificultades a lo largo de todas nuestras vidas.
Al Ing. Fredy Yábar Villanueva, como asesor. Y por sus recomendaciones en la presente investigación.
A los Ingenieros Luis Artica Mallqui, Vilma Julia Reyes, por sus recomendaciones.
A todas aquellas personas que de una u otra forma apoyaron esta iniciativa y así poder lograr mis anhelos.
6 ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS ... 9
ÍNDICE DE TABLAS ... 10
RESUMEN ... 11
ABSTRACT ... 12
I.INTRODUCCIÓN ... 13
II.REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ... 14
2.1 Antecedentes ... 14
2.2 Alimentos fermentados latinoamericanos ... 15
2.2.1 Tocosh... 16
2.3 Alimentos funcionales ... 17
2.3.1 Probióticos ... 17
2.4 Fermentación ... 19
2.4.1 Tipos de fermentación ... 19
2.5 Cinética de crecimiento de microorganismos en batch ... 20
2.5.1 Curva de crecimiento microbiano ... 21
2.5.2 Modelo cinético de crecimiento microbiano ... 23
2.6 Bacterias ácido lácticas (BAL) ... 23
2.6.1 Características generales de las BAL ... 24
2.6.2 Clasificación de BAL ... 24
2.6.3 Actividad enzimática en las BAL ... 28
2.6.4 Lactobacillus ... 29
2.6.4.1 Pruebas bioquímicas ... 30
2.6.4.1.1 Tinción gram... 30
2.6.4.1.2 Catalasa ... 30
2.6.4.1.3 Oxidasa ... 30
2.6.5 Aislamiento y recuento de BAL ... 30
2.7 Concentración de microorganismos ... 31
2.7.1 Liofilización de microorganismos ... 31
2.7.1.1 Proceso de conservación de microorganismos por liofilización ... 32
2.7.1.2 Crioprotectores en bacterias acido lácticas ... 36
III.MATERIALES Y MÉTODOS ... 37
3.1 Lugar de ejecución ... 37
3.2 Equipos y materiales ... 37
3.2.1 Equipos de laboratorio ... 37
3.2.2 Materiales ... 38
3.2.3 Materia prima ... 38
7
3.2.4 Insumos ... 39
3.2.5 Reactivos ... 39
3.2.6 Medios de cultivos ... 39
3.3 Métodos de análisis ... 39
3.3.1 Preparación de la muestra ... 39
3.3.2 Medición de parámetros ... 40
3.3.3 Preparación y dilución de las muestras ... 40
3.3.4 Preparación del medio de cultivo para BAL ... 40
3.3.5 Lectura e interpretación ... 41
3.3.6 Aislamiento de BAL ... 41
3.3.7 Determinación de la capacidad amiolítica de las BAL mediante la técnica en placa de agar almidón... 41
3.3.8 Análisis microbiológico de las BAL ... 42
3.3.8.1 Pruebas bioquímicas para caracterizar Lactobacillus spp ... 42
3.3.9 Concentración por liofilización de BAL del género Lactobacillus spp ... 42
3.3.10 Porcentaje de viabilidad de las BAL de género Lactobacillus spp. liofilizadas ... 42
3.4 Metodología experimental ... 43
3.4.1 Diagrama de flujo en la producción de tocosh ... 43
3.4.2 Diagrama de flujo en el proceso de liofilización de BAL del género Lactobacillus spp ... 44
3.5 Diseño experimental y análisis estadístico ... 45
3.5.1 Diseño experimental para el proceso de la fermentación ... 45
3.5.2 Diseño experimental para la liofilización ... 47
3.5.3 Análisis estadístico ... 47
3.5.3.1 Diseño experimental para el proceso de la fermentación ... 47
3.5.3.2 Diseño experimental para la viabilidad de BAL del género Lactobacillus spp. después de la liofilización ... 47
3.5.4 Modelo aditivo lineal para la evaluación del crecimiento de BAL durante la fermentación ... 48
3.5.5 Modelo aditivo lineal para la evaluación de la viabilidad de BAL del género Lactobacillus spp. después de su liofilización ... 49
IV.RESULTADOS Y DISCUSIONES ... 50
4.1 Crecimiento de BAL durante la fermentación ... 50
4.2 Análisis microbiológico de BAL aisladas del tocosh ... 53
4.2.1 Determinación de la capacidad amilolítica de las BAL ... 53
4.2.2 Pruebas bioquímicas para caracterizar las BAL del género Lactobacillus spp………54
8
4.3 Viabilidad de BAL del género Lactobacillus spp. después de ser liofilizadas ... 54
V.CONCLUSIONES ... 60
VI.RECOMENDACIONES... 61
VII.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 62
ANEXO A ... 69
ANEXO B ... 72
ANEXO C ... 74
ANEXO D ... 75
ANEXO E ... 85
9
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Curva de crecimiento bacteriano ... 21 Figura 2: Vía homofermentativa de la glucosa por BAL. ... 26 Figura 3: Vía homofermentativa de la glucosa por BAL. ... 27 Figura 4: Diseño del proceso de conservación de microorganismos por liofilización, desde el crecimiento de cultivo bacteriano hasta la recuperación de bacterias de las muestras liofilizadas. ... 32 Figura 5: Diagrama del punto triple del agua ... 34 Figura 6: Descripción global del proceso de liofilización. De 1-3 Congelamiento (1-2 presión atmosférica); 3-4 secado primario; 4-5 secado secundario. ... 34 Figura 7: Ciclo de liofilización dividido en sus tres etapas. ... 35 Figura 8: Sembrado en placas con las diferentes diluciones ... 41 Figura 9: Diagrama de flujo para la producción de tocosh de papa (variedad hualash) 43 Figura 10: Diagrama de flujo del proceso de liofilización de BAL ... 44 Figura 11: Diseño experimental para el proceso de fermentación en condiciones controladas ... 46 Figura 12: Diseño experimental para la liofilización ... 47 Figura 13: Variación del crecimiento de BAL durante 30 días con tres tratamientos. ... 52 Figura 14: Viabilidad de Lactobacillus spp. durante 4 semanas utilizando tres crioprotectores. ... 58
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Composición química del tocosh ... 17 Tabla 2: Métodos para medir el crecimiento microbiano ... 20 Tabla 3: Taxonomía de Lactobacillus ... 25 Tabla 4: Factores y niveles del diseño de experimento del crecimiento de BAL durante la fermentación. ... 48 Tabla 5: Factores y niveles del diseño de experimento de la viabilidad de BAL (Lactobacillus spp.) después de su liofilización. ... 49 Tabla 6: Crecimiento de BAL durante el tiempo de fermentación expresado en ufc/g. ... 50 Tabla 7: Crecimiento de BAL durante el tiempo de fermentación expresado en log ufc/g. ... 50 Tabla 8: Análisis de kruskal-walls de ufc de BAL con respecto a la interacción del tiempo y tratamiento. ... 51 Tabla 9: Comparación múltiple no paramétrica, comparaciones entre parejas de tratamientos ... 51 Tabla 10: Resultados de las pruebas bioquímicas para caracterizar Lactobacillus spp. 54 Tabla 11: Lactobacillus spp. viables antes de la liofilización expresada en ufc/g. ... 55 Tabla 12: Lactobacillus spp. viables antes de la liofilización expresada en log ufc/g. ... 55 Tabla 13: Lactobacillus spp. viables después de la liofilización expresada en ufc/g. ... 55 Tabla 14: Lactobacillus spp. viables después de la liofilización expresada en log ufc/g. 56 Tabla 15: Viabilidad de Lactobacillus spp. ... 56 Tabla 16: Análisis de kruskal-walls para la viabilidad de Lactobacillus spp. con respecto a la interacción del tiempo y tratamiento. ... 57 Tabla 17: Comparación múltiple no paramétrica, comparaciones entre parejas de tratamientos (crioprotectores) ... 57
11 RESUMEN
Los resultados de la investigación correspondientes al número de colonias de bacterias ácido lácticas durante la fermentación de papa variedad hualash, son los siguientes: para el tratamiento P1 (papa + agua) el número de colonias en los 5 primeros días fue de 9 x 105 ufc/g, para los 30 días aumento a 74 x 105 ufc/g; para el tratamiento P2 (papa + agua + fuente de carbono: 2,5 % + fuente de nitrógeno: 1,5 g/L) el número de colonias en los 5 días fue de 29 x 104 ufc/g aumentando de manera significativa a los 30 días a 19 x 106 ufc/g; para el tratamiento P3 (papa sin cáscara + agua + fuente de carbono: 2,5 % + fuente de nitrógeno: 1,5 g/L) en los 5 días fue de 11 x 103 ufc/g y para los 30 días fue de a 73 x 105 ufc/g. En el análisis de varianza a un nivel de significancia de 0,05 se obtiene que el tratamiento P2 presenta mejores resultados en colonias de estas bacterias. Se caracterizó a las BAL del género Lactobacillus spp. con las pruebas bioquímicas de la catalasa y oxidasa los cuales resultaron ser negativas, para la prueba de tinción Gram ser positivo.
Por otro lado, en la conservación durante 4 semanas de bacterias acido lácticas (Lactobacillus spp.) por liofilización, utilizando 3 crioprotectores (L1, L2 y L3), se llegó a determinar que el porcentaje de viabilidad para estos tratamientos disminuye de la siguiente forma; para L1 (almidón) de 87.3792 % a 87.3335 %, para L2 (goma de tara) de 86.6237 % a 86.5424 % y para L3 (maltodextrina) de 88.3570 % a 88.2990 %.
PALABRAS CLAVES: Tocosh, Bacterias ácido lácticas, Colonias, Crioprotectores, Liofilización, Pruebas bioquímicas.
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ABSTRACT
The results of the investigation correspondin to the number of colonies of lactic acid bacteria dring the fermentation of potato variety hualash, are as follows: for treatment P1 (potato + water) the number of colonies in the first 5 days was 9 x 105 ufc/g, for the 30 days increase to 74 x 105 ufc/g; for the P2 (potato+ water + carbon source:2.5 % + nitrogen source: 1.5 g/L) treatment the number of colonies in the 5 days was 29 x 104 ufc/g, increasing significantly at 30 days to 19 x 106 ufc/g; for the P3 (peeled potato+ water + carbon source:2.5 % + nitrogen source: 1.5 g/L) treatment in the days it was 11 x 103 ufc/g and for the 30 days it was 73 x 105 ufc/g. In the analysis ofvariance at a significance level of 0,05, it is obtained that the P2 treatment presents better results in colonies of lactic acid bacteria.
Lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus spp. with the biochemical tests of catalase and oxidase which tumed out to be negative, for the Gram stain test to be positive. On the other hand, in the conservation for 4 weeks of lactic acid bacteria (Lactobacillus spp.) by lyophilization, using 3 cryoprotectants (L1, L2 y L3) it was determined taht the percentage of viability for treatments decreases in the following way; for L1 (starch) from 87.3792 % to 87.3335 %, for L2 (tara gum) from 86.6237 % to 86.5424 % and for L3 (maltodextrin) from 88.3570 % to 88.2990 %.
KEY WORDS: Tocosh, Lactic bacteria, Colonies, Cryoprotectants, Lyophilization, Biochemical tests.
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I. INTRODUCCIÓN
La fermentación alimentaria es un método biotecnológico que ha surgido históricamente de la necesidad de preservar los alimentos. La fermentación permite que los nutrientes sean de sencilla asimilación; los alimentos que pueden ser fermentados son: la leche, la carne, vegetales, tubérculos y cereales. Los cultivos de bacterias ácido lácticas son usados en las industrias como iniciadores para la producción de gran variedad de alimentos fermentados.
El tocosh es un producto de los andes realizado de papa nativa, pasando por un proceso de fermentación durante 6 meses; siendo considerado como nutraceutico, debido a su contenido de alcaloides, esteroides y aminoácidos. Este alimento contiene propiedades medicinales, actuando como un antibiótico natural (Penicilina). Por otro lado, el tocosh es considerado como alimento probiótico, ya que su consumo confiere un efecto beneficioso sobre la salud; estos microorganismos permanecen viables y activos en el alimento durante el paso por el tracto gastrointestinal que garantiza su potencial benéfico en el huésped. Las bacterias ácido láctico, son un grupo heterogéneo conformado por cocos y bacilos no esporulados, Gram positivos. Estas bacterias son consideradas como microorganismos beneficiosos ya que aportan características sensoriales a los productos fermentados, y con esto mejoran la calidad y seguridad del producto.
Dentro de los métodos de conservación de microorganismos está la liofilización, este método es adecuado para prolongar la vida útil de las bacterias. Durante el proceso de la liofilización no todas las cepas podrían sobrevivir; esto se debe a la pérdida de la viabilidad celular en el secado por congelación, la desnaturalización de macromoléculas y el agua eliminada afectan las propiedades de macromoléculas hidrófilas en la célula. Para incrementar la viabilidad de los microorganismos se adiciona agentes crioprotectores;
reduciendo así los daños que se puede producir en las células microbianas en todo el proceso de liofilización.
Así, el presente trabajo de investigación planteó como objetivo general Cuantificar las bacterias ácido lácticas durante la fermentación controlada y tradicional de la papa para la obtención de tocosh fresco, aislar y concentrar por liofilización: y como objetivos específicos.1) Cuantificar las bacterias acido lácticas existentes en el proceso de fermentación controlada de la papa para la obtención de tocosh fresco. 2) Cuantificar las bacterias ácidas lácticos existentes en el proceso de fermentación tradicional de la papa para la obtención de tocosh fresco. 3) Aislar y concentrar por liofilización las cepas puras de bacterias ácido láctica presente en la fermentación controlada de la papa para la obtención de tocosh fresco.
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II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Antecedentes
Yábar & Reyes (2017), en su investigación, Caracterización fisicoquímica y microbiológica del tocosh de papa (solanum tuberosum) durante su elaboración, llegando a obtener los siguientes resultados: el tocosh es un producto resultado de la fermentación, ocurriendo cambios fisicoquímicos, incrementándose su humedad en un 22,16 %, variando su pH de 5,5 a 3,6 y la acidez se elevó de 0,088 a 0,485 % de ácido láctico, facilitando el desarrollo de la flora microbiana del tocosh. Los microorganismos aerobios mesófilos viables aumentaron de 18 x 103 a 36 x 106 ufc g-1, los hongos y levaduras de 24 x 10 a 44 x 103 ufc g-1 disminuyendo en la etapa final a 50 x 10 ufc g-
1. El recuento de BAL, van desde 15 x 103 hasta 66 x 108 dentro de ellas los Lactobacillus brevis – Lactobacillus acidophilus se incrementaron de 102 ufc g-1 a 36 x 104 ufc g-1.
Quillama, Dávila, Medina, Avalos, & Paredes, (2012a) en la investigación Evaluación de la biodiversidad láctica de Tocosh, alimento Fermentado tradicional del Perú, indican que la papa, es un tubérculo de los andes utilizado para la elaboración de Tocosh; a lo largo del proceso de fermentación o putrefacción están presentes las bacterias lácticas. Las muestras de tocosh utilizadas, fueron oriundos de Huánuco, Ancash y Junín; estas muestras fueron sembradas en los medios Man Rogosa Sharpe (MRS) y M17 pH 6.5 e incubadas a 30°C por 72 horas en situaciones de microaerofilia.
Lograron aislar 250 cepas de bacterias lácticas de 25 muestras analizadas, donde determinaron que el 80% correspondió al género Lactobacillus y 20% a Pediococcus.
De 73 cepas de Lactobacillus, se logró identificar 47.9% de Lactobacillus plantarum, 21.9% de Lactobacíllus alimentarius, 13.7% de Lactobacillus casei, 8.2% de Lactobacillus brevis, 5.5% de Lactobacillus reuterii y 2.8% de Lactobacillus fermentum.
Con esta investigación se consiguió evidenciar la presencia de bacterias lácticas en un 100 % de muestra de tocosh, lo cual se indica su activa contribución en el proceso de fermentación como cultivo iniciador y/o controlador biológico.
Quillama, et al. (2012b) en la investigación Selección de Cepas Nativas de Bacterias Lácticas con Capacidad Antagonista para su uso en la Fermentación de Tocosh, llegando a la siguiente conclusión: las bacterias lácticas tienen capacidad fermentativa y antagonismo en la obtención de tocosh de papa; los productos metabólicos generados son los ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, reuterina y bacteriocinas,
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contribuyendo con la conservación de los alimentos. Se reactivaron cultivos puros de bacterias lácticas del tocosh en medio MRS pH 6.5 a 30 °C por 24 horas en condiciones de microaerofilia.
2.2 Alimentos fermentados latinoamericanos
Todo alimento fermentado ha sido modificado, ya sea por la actividad de microorganismos o enzimas. Estos alimentos son agradables que se elaboran a partir de materia cruda o tratada térmicamente más la ayuda de microorganismos, los cuales se incluyen mediante un proceso; obteniendo características sensoriales respecto al sabor, aroma, textura y consistencia (Ramírez et al., 2011).
A lo largo de los siglos, una de las formas de conservación en la antigüedad es como alimento fermentado. La fermentación bacteriana se da en distintos alimentos, donde estos microorganismos presentan actividades fisiológicas, se pueden usarse como cultivos iniciadores para producir alimentos en condiciones controladas (Wacher, 2014). La generación y producción de alimentos fermentables con el uso de las técnicas ancestrales permite aportar aminoácidos libres, carbohidratos altamente asimilables como alimentos alternativos para disminuir la desnutrición crónica (Solano et al., 2014).
Uno de los productos alimenticios andinos fermentados tradicionalmente es la chicha, una bebida fermentada a base de maíz del noroeste de Argentina; el tocosh es un alimento tradicional de las tierras altas de los Andes centrales peruanos (Yépez et al., 2017).
Una de las técnicas tradicionales andina de conservación in situ, es el tocosh, en quechua es togosh, siendo el resultado de la fermentación bacteriana de alimentos andinos como la papa, maíz, olluco o aracacha; siendo una alternativa de consumo para prevenir o curar algunas enfermedades ya que estos productos cuentan con propiedades nutritivas y terapéuticas (Sandoval et al., 2015).
La biotecnología fermentativa ancestral, es aplicada en la papa, cuya trasformación se conoce como tocosh lo cual ha sido materia de estudio desde el enfoque nutricional y bromatológico, con alto contenido de carbohidratos (80,01 %), proteínas (3,91 %) y bajo contenido de grasas (Solano et al., 2014).
El tocosh es el resultado de una técnica tradicional que proviene de la época incaica en el Perú consumido como tocosh api, una variante es la mazamorra de consistencia
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menos espesa; combate infecciones y cicatriza heridas. El tocosh se realiza de maíz, olluco, yuca y la más conocida de papa; los principales departamentos de producción son Ancash, Cuzco, Huánuco y Junín (E. Rodríguez, 2019).
2.2.1 Tocosh
El tocosh se obtiene mediante la fermentación bacteriana de productos andinos como la papa, depositados en pozas elaborados en la tierra, cubierta con paja o ichu y con piedras para presionarlos mecánicamente dentro de la corriente de agua proveniente de un manantial. El tocosh es una práctica tradicional andina de conservación en el lugar (Sandoval et al., 2015). El tipo de papa que comúnmente se utiliza para la elaboración de tocosh es la variedad hualash. En los primeros meses hay la probabilidad de formación de espuma, esto por el resultado de la fermentación por la cual pasa la papa (Zúñiga, 2018).
El tocosh es elaborado por proceso de fermentación, colocando los tubérculos en una poza de agua, protegidas por paja cerca de una corriente de agua por un promedio de tiempo de 6 meses; durante el proceso de fermentación – putrefacción la papa se reduce de tamaño, pero no la cáscara, consiguiendo así un olor particular casi desagradable. Por poseer propiedades curativas es consumido para problemas con los bronquios, problemas digestivos y óseos, ya que contiene penicilina (antibiótico) en su forma natural, fortificando el sistema inmunológico. También cabe mencionar que es un potente antimicrobiano (Vilca, 2014).
El tocosh es un alimento tradicional andino, es el resultado de la fermentación – putrefacción que sufre la papa, durante este proceso ocurren cambios fisicoquímicos. Durante el proceso de putrefacción se da el crecimiento microbiano, favorecido por el aumento de acidez de 0.088 a 0.485 % (Yábar
& Reyes, 2017).
El nombre tocosh significa arrugado y fermentado; las comunidades campesinas elaboran el tocosh con papas amargas para el consumo directo, para su elaboración se requiere un hoyo de 60 cm aproximadamente de profundidad cerca de un riachuelo, cubriendo el fondo y las paredes con ichu y se acomoda la papa, luego es tapado con ichu y piedras para que los tubérculos se mantengan dentro del hoyo; dejándola así por un mes y medio en proceso de fermentación – putrefacción, después de transcurrir aquel
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tiempo se procede a secar por tres días en sombra, para luego ser almacenado en ichu (Arratea & Mamani, 2017).
2.2.1.1 Composición química
La tabla 1 se presenta la composición del tocosh de papa variedad Yungay.
Tabla 1: Composición química del tocosh
Componentes Cantidad % (Base húmeda) Humedad
Proteína Grasa Ceniza Fibra
Carbohidrato
36,20 0,96 0,38 1,12 2,51 58,83 Fuente: Ccapa (2017)
2.3 Alimentos funcionales
Se llama alimentos funcionales a todo alimento natural o procesado, que contienen compuestos biológicamente activos, conocidos o desconocidos, que en pequeñas cantidades son beneficiosas para la salud (Yépez, 2018).
Estos alimentos ayudan a prevenir diferentes enfermedades o que sean beneficiosos para la salud; dentro de estos alimentos están los probióticos (Bautista, 2017).
2.3.1 Probióticos
Los probióticos son microorganismos vivos que en cantidades adecuadas otorgan un beneficio a la salud del huésped. Las especies de Lactobacillus y Bifidobacterium son usadas habitualmente como probióticos; estas bacterias se utilizan para conservar alimentos por fermentación, ya que cumple dos funciones, como agente para la fermentación y otorga beneficios a la salud (Daschner, 2015).
Todo microorganismo vivo se considera como probiótico cuando se consume en cantidades apropiadas y estas benefician a la salud del huésped (Bautista, 2017).
Una gran parte de probióticos pertenecen a BAL, siendo utilizadas en la industria alimentaria elaborando alimentos fermentados y complementos para promover la salud (Ramírez et al., 2011).
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2.3.1.1 Beneficios de los microorganismos probióticos
o Facilita la digestión de la lactosa: Los probióticos, al encontrarse en el intestino liberan β-galactosidasa actuando sobre la lactosa hidrolizándola hasta glucosa y galactosa, evitando así los síntomas de flatulencia, dolor abdominal y diarrea a personas intolerantes al carbohidrato y al consumir leche (Salazar & Montoya, 2003).
o Proteger contra enfermedades gastrointestinales: El consumo de alimentos con probióticos ayuda a la recuperación del equilibrio de microbiota intestinal nativa, evitando la cohesión de algunos virus, bacterias contagiosos, los cuales son causantes de la inflamación de las mucosas del estómago, la diarrea, el síndrome de colon irritable (Salazar & Montoya, 2003).
o Proteger contra infecciones del tracto urogenital: El consumo de mezclas probióticas restaura la microbiota natural urogenital benéfica, desplazando así a los causantes de la inflación en vagina y uretra (Salazar & Montoya, 2003).
o Protege de las infecciones respiratorias: Los probióticos incrementa la actividad fagocítica de macrófenos alveolares actuando sobre microorganismos infecciosos existentes en las vías respiratorias (Salazar & Montoya, 2003).
o Previene las infecciones en heridas quirúrgicas: Los probióticos del tipo Lactobacillus fermentum, imposibilitan la adhesión de patógenos a las superficies de la células en heridas, mediante la mucosidad de proteínas (Salazar & Montoya, 2003).
Para poder aprovechar los efectos favorables de los probióticos, la persona debe de consumir como complemento alimentos que contengan ingredientes prebióticos (Salazar & Montoya, 2003).
El tocosh es un producto usado para el posparto, resfrío neumonía, como antibacteriano, para prevenir las infecciones gastrointestinales, entre otros.
Además es considerado como probiótico de muy bajo costo (Sandoval et al., 2015).
En la fermentación, la papa consigue su poder bactericida y las propiedades durante este proceso; siendo considerado como alimento
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probiótico, aumentando la flora intestinal, y mejorar la digestión y el sistema inmunológico (Ccapa, 2017).
2.4 Fermentación
La fermentación es un proceso metabólico de bacterias y levaduras, encargados de trasformar compuestos químicos orgánicos, fundamentalmente azúcares, en sustancias orgánicas simples (etanol, ácido láctico y ácido butírico) (Puerta, 2010).
La fermentación es un proceso llevado a cabo por microorganismos en condiciones aeróbicas y anaeróbicas generando energía y obteniendo características físico- químicas. Este proceso se potencia deliberadamente el crecimiento de microorganismos que consumen una cierta cantidad de sustrato, lo cual da paso a su enriquecimiento, por medio del cultivo los productos de su metabolismo (Bailon, 2012).
En la fermentación los microorganismos específicos tienen el poder de realizar cambios en la materia prima por la acción de enzimas microbianas en el sustrato orgánico; a su vez impiden el desarrollo no deseado de otros microorganismos, esto se debe a la producción de productos (ácido láctico, etanol, ácido acético, entre otras) como consecuencia de la acción metabólica en la materia prima. Después del tiempo de fermentación de alimentos, una de las ventajas es la conservación del producto final por un largo periodo en comparación con la materia prima, evidenciándose cambios en sabor y aroma (Vega, 2008).
Los microorganismos más predominantes en el proceso de fermentación en alimentos son las levaduras y bacterias ácido lácticas (Saccharomyces, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus y Pedioccus) (Vega, 2008).
2.4.1 Tipos de fermentación: Según Vilca (2014) (como se citó en Braverman, 2000):
o Fermentación acética o Fermentación alcohólica o Fermentación butírica o Fermentación láctica
La fermentación láctica comprende el uso de bacterias ácido láctico (Lactobacillus), lo cual estas bacterias desproteinizan y descalcifican al material, obteniendo como producto final la quitina. El género de bacterias
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Lactobacillus sin grampositivas no esporuladas, por lo general anaerobias que tiene la capacidad de generar ácido láctico por fermentación láctica de la lactosa y otros azúcares, habitualmente Lactobacillus se utiliza para la producción de alimentos fermentados (Marcia et al., 2011).
2.5 Cinética de crecimiento de microorganismos en batch
El crecimiento microbiano es el incremento ordenado de todos los componentes de un microorganismo; este aumento se da por la multiplicación celular que se lleva a cabo por fisión binaria. Las concentraciones microbianas son calculadas en números de células viables por volumen unitario de cultivo, el intervalo de tiempo para la duplicación del número de células se denomina tiempo de generación, en cuyo caso el tiempo necesario para la duplicación de la masa celular se denomina tiempo de duplicación (Pedraza & Poveda, 2020).
Existe dos métodos para medir el crecimiento microbiano, el método directo (miden directamente las células o masa microbiana) y el método indirecto (relacionan algún parámetro del cultivo que permite deducir el crecimiento microbiano (Pedraza &
Poveda, 2020).
Tabla 2: Métodos para medir el crecimiento microbiano
Determinación del Número de
células
Vivas y muertas
Recuento en cámara
Recuento indirecto en portaobjetos Contador automático de partículas Nefelometría
Vivas
Recuento en medio sólido Filtración sobre membrana
Determinación de la masa
celular
Directos
Determinación de peso seco Estimación de proteínas
Indirectos
Turbidimetría
Acumulación de metabolito Consumo de un nutriente Fuente: Pedraza & Poveda (2020)
El crecimiento microbiano tipo batch consiste en cultivar células en un envase con una concentración inicial, lo cual no sufre ningún cambio al adicionar nutrientes, manteniéndose el volumen constante. El operador tiene control sobre las condiciones ambientales tales como el pH; la temperatura, entre otros; el proceso llega a su fin cuando el 100 % del sustrato ha sido consumido por la biomasa (Guilera, 2016).
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Al sembrar microorganismos en un medio de cultivo apropiado, estos inician a multiplicarse, hasta que los componentes del medio de cultivo se agoten y con esto se detiene el crecimiento de estos microorganismos. A este tipo de cultivo se conoce como Cultivo batch, ya que se siembra una cierta cantidad de microorganismos en un volumen dado de medio de cultivo (Feraudy, 2011). Los biorreactores se emplean para operaciones a pequeña escala, y se puede emplear para trabajar durante largos periodos de tiempo (Zorro et al., 2019).
Según Guilera (2016) las características principales del biorreactor tipo batch son:
o Su operación es muy sencilla.
o La reacción química se desarrolla en un sistema cerrado.
o Todos los reactivos son agregados al inicio de la operación.
o Este tipo de reactor se utiliza para estudios cinéticos de laboratorio.
La fermentación aeróbica tipo bach puede ser calificada como sistema cerrado; se realiza el sembrado de los microorganismos en medio de cultivo estéril en el fermentador, y la incubación en condiciones óptimas. En el tiempo de fermentación existe cuatro fases de crecimiento que recurre el microorganismos (Durango, 2007).
2.5.1 Curva de crecimiento microbiano
Figura 1: Curva de crecimiento bacteriano
Fuente: Pedraza & Poveda (2020)
2.5.1.1 Fase de latencia
Esta fase representa el tiempo de adaptación al ambiente nutricional de las bacterias, listos para reiniciar el ciclo celular.
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2.5.1.2 Fase de crecimiento exponencial
Representa el periodo donde existe mayor nutriente y las bacterias incrementan su número exponencialmente.
Es la fase donde las células se reproducen a velocidad máxima sin limitaciones; el incremento de las células se describe como la reproducción del número de células por unidad de tiempo. La velocidad de crecimiento es independiente de la concentración de sustrato (Durango, 2007).
𝑑𝑥
𝑑𝑡 = 𝜇𝑥 … 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 1
La velocidad de crecimiento específico (μ), generalmente es una función de tres parámetros: la concentración del sustrato limitante (S), la tasa de crecimiento máxima (𝜇𝑚𝑎𝑥), y la constante específica de sustrato (𝐾𝑠), en cuya concentración se obtiene la mitad de la máxima velocidad específica de crecimiento (𝜇 = 0.5𝜇𝑚𝑎𝑥); esta relación puede ser expresada por medio de la ecuación de Monod (Ecuación 2) (Durango, 2007).
𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑆
𝐾𝑆+ 𝑆 … 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 2
En este punto se consigue el valor máximo de μ a niveles de saturación de sustrato, cuando aumenta la densidad de población decrece la concentración del sustrato limitante del crecimiento, causando un descenso de μ (Durango, 2007).
El tiempo de duplicación celular o tiempo de generación, es el tiempo requerido para una célula se divida o para que la población de un organismo se duplique en número (Liz López, 2016).
𝑡 =𝑙𝑛2
𝜇 … 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 3
2.5.1.3 Fase de declinación del crecimiento
Es la fase donde el número de células en el cultivo no varía.
2.5.1.4 Fase endógena
En esta fase los nutrientes que quedan en las células muertas se difunden hacia el exterior para proporcionar alimento a las células vivas sobrantes (Pedraza & Poveda, 2020).
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2.5.2 Modelo cinético de crecimiento microbiano 2.5.2.1 Modelo de Amrane y Prigent
En 1994, estos escritores diseñaron un modelo cinético no estructurado para representar la producción de ácido láctico a partir de lactosa; siendo de fácil convergencia y simplicidad para los datos experimentales con los parámetros calculados (Calderón, 2017). La ecuación 4, representa la ecuación de Amrare y Prigent.
𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥( 1 1 + 𝑐𝑒𝑑𝑡
𝜇𝑚𝑎𝑥− 𝑐
) … 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 4
La ecuación 5 muestra el modelo de Amrare y Prigent para crecimiento microbiano.
𝑑𝑋
𝑑𝑡 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 1 1 + 𝑐𝑒𝑑𝑡
𝜇𝑚𝑎𝑥− 𝑐
𝑋 … 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 5
La expresión integrada de análisis de la ecuación de Amrare y Pringet se muestra en la ecuación 6.
𝑋 = 𝑋0𝑒𝑥𝑝 {𝜇𝑚𝑎𝑥[𝑡 −1
𝑑𝑙𝑛 (1 + 𝑐
𝜇𝑚𝑎𝑥(𝑒𝑑𝑡− 1))]} … 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 6
X, 𝜇𝑚𝑎𝑥, t, d y c representan biomasa (ufc/ml), tasa de crecimiento específica (h-1), tiempo (h) y constantes propias del modelo cinético y el proceso fermentativo.
El modelo de Amrare y Prigent, es el adecuado para el modelado de las fases de latencia y crecimiento exponencial en un proceso fermentativo, en cuanto a la comparación entre modelos cinéticos de tipo primario.
2.6 Bacterias ácido lácticas (BAL)
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son un grupo de microorganismos utilizados para la elaboración de alimentos fermentados, añadiéndoles características sobre su sabor, aroma y textura. Durante el proceso de fermentación las BAL producen compuestos bioactivos (gama-aminobutírico) beneficios para la salud, actuando como un antihipertensivos, antidepresivos, hipoglucémicos y relajantes (A. Santos et al., 2018).
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Las BAL tienen la capacidad para fermentar carbohidratos en ácido lácticos; lo cual es utilizado principalmente por la industria alimentaria (Novik et al., 2017).
Por sus propiedades metabólicas las BAL son de importancia en la industria alimentaria; los metabolitos generados por estas bacterias son los ácidos orgánicos, sustancias preservantes y vitaminas, entre otros (Parra, 2010).
Las BAL desdoblan carbohidratos y producen ácido láctico y otros metabolitos (León et al., 2006). Estas bacterias están constituidas por bacterias no esporuladas, Gram positivos y que metabolizan azúcares para originar fundamentalmente ácido láctico (Estela et al., 2007).
2.6.1 Características generales de las BAL
Son un grupo de microorganismos que agrupan a varios géneros con características morfológicas, fisiológicas y metabólicas en común; en su gran mayoría las BAL son cocos o bacilos Gram positivos, no esporulados, no móviles, anaeróbicos o aerotolerantes; oxidasa y catalasa negativas, carecen de citocromos, producen ácido láctico como principal producto de la fermentación de carbohidratos; también estas bacterias son ácido tolerantes pudiendo crecer algunas a valores de pH tan bajos como 3.2, y otras a valores tan altos como 9.6, y en su gran mayoría crecen a un pH entre 4 y 4.5 (Ramírez et al., 2002).
Las BAL son bacterias anaeróbias facultativas, de catalasa y coagulasa negativa, tolerantes a condiciones ácidas y en su ADN posee un bajo contenido de guanina y citosina (Gutiérrez et al., 2017).
Estas bacterias son bacilos grampositivos y cocos caracterizados por la ausencia de catalasa, también son tolerantes a valores de pH bajos y falta de formación de esporas; las BAL no requieren de oxígeno para su crecimiento, sin embargo, pueden crecer en su presencia (Novik et al., 2017).
2.6.2 Clasificación de BAL
Las BAL pertenecen al phylum o reino Firmicutes, lo cual alcanza alrededor de 20 géneros, entre ellas se menciona a Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pedicoccus, entre otros; siendo el género Lactobacillus el más grande (Parra, 2010).
25 Tabla 3: Taxonomía de Lactobacillus
TAXONOMÍA Dominio Bacteria Reino Firmicutes Clase Bacilli
Orden Lactobacillales Familia Lactobacillaceae Género Lactobacillus Especie L. acidophilus
L. bulgaricus L. casei L. plantarium
Fuente: Parra (2010)
Las BAL se clasifican según la fermentación de azúcares (hexosas y pentosas), estas pueden ser homofermentativas o heterofermentativas.
2.6.2.1 Homofermentativas
Este tipo de fermentación está conformado por Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus y Stretococcus, lo cual utilizan la ruta Embden–Meyerhoff - Parnas convirtiendo 1 mol de glucosa en 2 moles de ácido láctico; de la glucosa se genera el 85 % de ácido láctico (Parra, 2010). Las bacterias homofermentativas u homolácticas metabolizan las hexosas a través de la ruta glucolítica, para dar como un probable resultado el ácido láctico (Montano et al., 1992) (Figura 2).
Glucosa o Fructosa → 2 Láctico 2.6.2.2 Heterofermentativas
En este grupo se hallan Lactococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus; estas bacterias al no contar con la enzima aldosa, se fermenta 1 mol de glucosa para originar 1 mol de ácido láctico (solo un 50 % de ácido láctico), 1 mol de etanol (o ácido acético), 1 mol de CO2 y 1 mol de ATP (Parra, 2010). Las bacterias heterofermentativas o heterolácticas, difieren la glucolisis, donde se genera 3 moles de NADH; para poder recuperar el equilibrio redox, 1 mol se oxida en la etapa del piruvato, y si no existe aceptadores de electrones alternos, el acetilfosfato se reduce a etanol oxidándose los otros 2 moles de NADH, si por el contrario existe aceptadores se forma ácido acético como producto final (Montano et al., 1992) (Figura 3).
Glucosa →Láctico + Etanol + CO2
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3 Fructosa → 2 Manitol + Láctico + Acético + CO2
Figura 2: Vía homofermentativa de la glucosa por BAL (adaptada de Mora & García, 2007).
Fructosa 1,6-difosfato Glucosa
Glucosa 6-fosfato
Fructosa 6-fosfato
Glucocinasa ATP
ADP
Fosfoglucoisomerasa
ATP ADP Fosfofructocinasa
Fructosa-1,6-difosfato aldolasa
Fosfoglicerato cinasa
Gliceraldehído 3-fosfato
2 1,3-Difosfoglicerato NAD+ NADH
ADP ATP 2 3-Fosfoglicerato
Dihidroxiacetona fosfato Triosafosfatoisomerasa
Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
Fosfoglicerato mutasa
2 2-Fosfoglicerato
2 Fosfoenolpiruvato Enolasa
H2O
Piruvato cinasa
ADP ATP 2-Piruvato
NADH NAD+ 2 Lactato
Ganancia neta = 2ATP 2 lactatos por molécula de glucosa fermentada.
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Figura 3: Vía homofermentativa de la glucosa por BAL (adaptada de Mora & García, 2007).
Xilulosa 5-fosfato PENTOSAS
Fosfocetolasa
Glucosa
ATP ADP Glucocinasa
Glucosa 6-fosfato NAD+ NADH 6-Fosfogluconato
NAD+ NADH 6-Fosfogluconato deshidrogenasa
CO2
Ribulosa 5-fosfato Ribulosa fosfato-3-epimerasa
Pi
Gliceraldehído 3-fosfato
NADH
Pi NAD+
1,2-difosfoglicerato ADP ATP
Gliceraldehído-3- fosfatodeshidrogenasa
Fosfoglicerato cinasa 3-fosfoglicerato
Fosfoglicerato mutasa
2-fosfoglicerato
Fosfoenolpiruvato Enolasa
Acetaldehído
CoA NAD+
NADH Acetil-CoA
Acetil-fosfato
Pi CoA
Acetaldehido hidrogenasa
NADH NAD+ Alcohol deshidrogenasa
Etanol
Lactato NAD+
NADH Piruvato Piruvato cinasa
Lactato deshidrogenasa
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Las especies de Lactobacillus que están presentes en la fermentación heteroláctica son: plantarum, ramnosus, coryneformis, curvatus, casei, paracasei, brevis, buchneri, fermentun, kéfir, reuteri, leuconostoc. Por otro lado, las especies de Lactobacillus que están presentes en la fermentación homoláctica son: acidophilus, helveticus, delbrueckii subsp delbrueckii, debrueckki sups lactic, delbrueckii subsp bulgaricus, lactis, thermophilus (Parra, 2010).
Las BAL también se clasifican en dos grandes grupos según la temperatura de crecimiento, mesófilas y termófilas.
2.6.2.3 Mesófilas
La temperatura ideal de incubación es de 20-25 °C, el volumen de cultivo líquido es 1-2 %, el tiempo de incubación es de 18-20 horas, y la acidez final de 0,8 %. Las especies que conforman este grupo son: Lactococcus lactis subs lactis, Lactococcus lactis sub cremoris, Lactococcus lactis. Se utilizan para la elaboración de quesos semi madurados (Blanco et al., 2006).
2.6.2.4 Termófilas
La temperatura ideal de incubación es de 40-45 °C, el volumen de cultivo líquido es de 2-3 %, el tiempo de incubación es de 2-4 horas, su acidez final 0,9 %. Las especies que conforman el grupo son: Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum. Se utiliza para la elaboración de yogurt y quesos madurados (Blanco et al., 2006).
2.6.3 Actividad enzimática en las BAL
La actividad amilolítica no es común entre las BAL, pero en algunos estudios se ha reportado su aislamiento de matrices amiláceas fermentadas representado alrededor del 10 % de la población total de las BAL; esta propiedad es particularmente importante en aquellos procesos tradicionales que no incluyen el paso de pregelatinización antes de la fermentación, por lo que la concentración de azúcar libres se encuentra en niveles muy bajos (Yépez, 2018). El almidón es una de las principales reservas de carbohidratos en los alimentos, también es una de las fuentes de energía y de carbono más importante para apoyar la fermentación láctica tras su hidrólisis, lo que lleva a las BAL amilolíticas tienen un papel muy relevante en la microbiota haciendo disponibles los sustratos necesarios para su crecimiento y el de las BAL no amilolíticas (Yépez, 2018).
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Para la determinación de la actividad amilolítica de las BAL, se tiene que inocular estos microorganismos en cajas de Petri con agar nutritivo enriquecido con 0.1 % p/v de almidón soluble, incubadas a 37 °C durante 48 horas; posteriormente se adicionó al cultivo microbiano una cantidad de solución de yodo (Kl – 5 % p/v y I 2 % p/v). La presencia de un complejo helicoidal entre amilosa y yodo, da lugar al típico azul profundo de dispersiones de almidón teñidos con yodo. La formación de halos claros o transparentes mayores a 1mm de radio alrededor del crecimiento demostraron la actividad amilolítica; a mayor halo mayor actividad, por lo que la distancia de la zona desde el borde de la colonia hasta el límite externo, demuestran la capacidad del microorganismo de hidrolizar dicho sustrato (Chiquiza et al., 2016).
La capacidad de las cepas de BAL para degradar el almidón se realizó con cultivos los activos tras su crecimiento en medio MRS durante 24 h; alícuotas de 5 μmL del cultivo se inocularon en placas de MRS – almidón y se incubaron a 30 °C durante 48 h. La actividad amilolítica se reveló al verter sobre el cultivo crecido la solución de lugol y observar una decoloración del medio alrededor del mismo (Yépez, 2018).
2.6.4 Lactobacillus
Pertenecen a las bacterias ácido láctico, bacterias Gram-positivas, microorganismos anaerobios, tienen como característica común la producción de ácido láctico a partir de la fermentación de carbohidratos, generando también como sub productos alcohol y dióxido de carbono (Jurado & Jarrín, 2015). Alrededor de 80 especies fueron reconocidas, los cuales están agrupadas en 3 grandes grupos, basándose en sus características fermentativas; el primero está conformado por especies homofermentativas estrictas, el segundo por especies heterofermentativas facultativas y el tercer por especies heterofermentativas estrictas (Mora & García, 2007).
Por lo general resisten mejor las condiciones de acidez que las otras bacterias ácido lácticas, crecen sin dificultad en un pH alrededor 4-5; permitiendo un aislamiento selectivo a partir de muestras naturales (Mora & García, 2007).
El género de Lactobacillus son considerados benefactores por su capacidad de digerir las proteínas, carbohidratos y grasas de los alimentos, propiedad que permite en la absorción de nutrientes esenciales como minerales, aminoácidos y vitaminas del organismos huésped (Jurado & Jarrín, 2015).
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Los Lactobacillus son bacterias en forma de bacilos 0,5 – 1,2 x 1,0 – 10,0 μm, generalmente se asocian a cadenas cortas, la temperatura adecuada de crecimiento de los Lactobacillus es entre 30 – 40 °C (Estela et al., 2007). Los Lactobacillus son fermentadores produciendo una gran diversidad de ácidos, siendo el principal el láctico (Salazar & Montoya, 2003).
2.6.4.1 Pruebas bioquímicas 2.6.4.1.1 Tinción gram
Este tipo de tinción es definida como tinción diferencial y fue desarrollada por el científico Hans Christian Gram en 1884. Para esta prueba se hace uso de dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grupos: bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas. El primer grupo da una coloración azul oscuro a morado, mientras que el segundo grupo da una coloración rosa o roja (Luis López et al., 2014). Los Lactobacillus son bacterias Gram positivas (Gutiérrez et al., 2017).
2.6.4.1.2 Catalasa
Es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno; los Lactobacillus son catalasa negativos, ya que no son capaces de degradar el peróxido de hidrogeno (Sierra & Guillen, 2017).
2.6.4.1.3 Oxidasa
La enzima bacteriana citocromo C oxidasa permite detectar la presencia de microorganismos capaces de oxidar rápidamente al colorante redox.
Para el género Lactobacillus la prueba de la oxidasa resulta ser negativa (Sierra & Guillen, 2017).
2.6.5 Aislamiento y recuento de BAL
Para calcular la carga microbiana se realizan diluciones de la muestra en agua peptonada al 0.1 %, e inoculadas en agar MRS, siendo incubadas a 30 °C ± 2 °C por 72 horas, en condiciones aerobiosis y sin agitación; a partir de los recuentos, se realizan aislamientos para obtener cultivos puros (Sossa et al., 2009). Para el aislamiento de las BAL se utiliza el medio selectivo MRS, este cultivo es apropiado para el desarrollo solo de este tipo de bacterias. (G.
Rodríguez, 2007). El recuento en placa es una técnica de cuantificación, caracterizándose por ser la más exacta para procesos microbiológicos, en comparación con otros métodos; ya que el recuento se da solo “células viables” (Calderón, 2017).
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Para lograr la separación de microorganismos es la inmovilización de las células microbianas en la superficie de los medios de cultivos; las nuevas colonias permitirá separarlas en un medio de cultivo estéril, considerándoles como “puros” por poseer un solo tipo de microorganismos.
2.7 Concentración de microorganismos
Los métodos de conservación permiten almacenar hasta un 90 % de microorganismos viables durante un periodo de tiempo, manteniéndose estables y sin cambios morfológicos, fisiológicos o genéticos. Las características del microorganismo a conservar debe de estar libre de microorganismos contaminantes, su velocidad de crecimiento debe de ser alta (Barragán & Lesmes, 2009).
Los métodos de conservación para microorganismos se clasifican según los factores de tiempo y características fisiológicas de la cepa; estos grupos son: métodos a largo plazo, a corto plazo y los métodos alternativos (Arencibia et al., 2008). Los métodos de conservación a largo plazo paralizan el crecimiento de células microbianas, asegurando al máximo la estabilidad genética(García & Uruburu, 2000). Los dos grupos pertenecientes a los métodos de conservación a largo plazo son por congelamiento y liofilización (Arencibia et al., 2008).
2.7.1 Liofilización de microorganismos
La conservación de microorganismos a largo plazo se da por medio del secado por congelación o secado térmico (Gao & Li, 2016). Este método es usado a menudo para la preservación y almacenamiento de muestras biológicas (Ávila et al., 2015). La liofilización es un método utilizado para la conservación de microorganismos, manteniendo su viabilidad a temperatura ambiente por largos periodos de tiempo (Dos Santos, Pacheco, A.P. da Silva, Rosenthal, & Castro, 2015).
El modo de preservación de cultivos iniciadores o probióticos ayuda a mantener viables a las células bacterianas durante su uso, almacenamiento, trasporte y manejo a largo plazo; los métodos convencionales para su preservación es la congelación y la deshidratación de los cultivos; para la deshidratación de bacterias se hace uso de la liofilización, donde se lograr un alto nivel de células viables conservando sus propiedades (Vera et al., 2019).
Este método consiste en eliminar por sublimación, bajo situaciones de alto vacío, el agua de las células congeladas para interrumpir su metabolismo y
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poder ser conservadas a temperaturas ambientes por amplios periodos de tiempo (Ávila et al., 2015).
La liofilización es efectiva, cuando los microorganismos permanecen viables por un periodo de tiempo, sin embargo, las tasas de supervivencia después de llevarse a cabo este proceso y en su almacenamiento dependerá del género y la especie del microorganismo, los parámetros de liofilización, estado fisiológico de las células y condiciones de rehidratación (Grauer et al., 2015).
No todas las cepas podrían sobrevivir y la tasa de viabilidad cuantitativa son bajos como al 0.1 %; esto se debe a la pérdida de la viabilidad celular en el proceso de congelación es probablemente la formación de cristales de hielo, la desnaturalización de macromoléculas y el agua eliminada afectan las propiedades de macromoléculas hidrófilas en la célula (Kahar et al., 2016).
Durante de la liofilización las bacterias Gram negativas muestran por lo general menor supervivencia en comparación con las Gram positivas (Grauer et al., 2015).
2.7.1.1 Proceso de conservación de microorganismos por liofilización
Figura 4: Diseño del proceso de conservación de microorganismos por liofilización, desde el crecimiento de cultivo bacteriano hasta la recuperación de bacterias de las muestras liofilizadas.
Fuente: Castañeda (2015)
CRECIMIENTO DE CULTIVO BACTERIANO
FORMULACIÓN
CONGELACIÓN
SECADO PRIMARIO
SECADO SECUNDARIO
SELLADO
ALMACENAMIENTO
REHIDRATACIÓN
PROCESO DE LIOFILIZACIÓN
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2.7.1.1.1 Crecimiento de cultivo bacteriano
El medio de cultivo para el crecimiento de bacterias puede ser sólidas y líquidas; en esta etapa se da la incrementación de bacterias para ser utilizado según su requerimiento.
2.7.1.1.2 Formulación
Es la mezcla de células con cualquier solución protectora (lioprotector), esta solución ayuda a sobrevivir a las bacterias durante y después de la liofilización (Castañeda, 2015).
La formulación es necesaria para mejorar la eficiencia de la liofilización, obteniendo un producto seco con las características esperadas (Grauer et al., 2015).
2.7.1.1.3 Congelación
El congelado ideal se da cuando la concentración de solutos es mínima evitando así el estrés osmótico, se puede congelar a -12 °C, -20 °C o -80
°C, durante 5 horas. En este etapa se logra la inmovilización de componentes en solución, reduciendo la desnaturalización del producto por calor en el secado y a la hora de ampliar el vacío previniendo la ebullición evitándose la formación de espuma (Grauer et al., 2015).
Cuando se congela la formulación, el agua del medio acuosos forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la región intersticial entre los cristales de hielo (Castañeda, 2015).
2.7.1.1.4 Secado primario
En esta etapa, la presión se reduce y la temperatura de la formulación congelada es elevada, dando lugar a la sublimación y migración de vapor de agua desde el congelado hacia el condensador del liofilizador; sin embargo la temperatura de interface debe estar por debajo de la temperatura eutéctica para minimizar el daño de la muestra (Castañeda, 2015).
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Figura 5: Diagrama del punto triple del agua
Fuente: Grauer et al. (2015)
2.7.1.1.5 Secado secundario
Llamado también desorción isotérmica, en esta etapa comienza el incremento de temperatura conservando una baja presión para disminuir el contenido de agua residual al nivel deseado (Grauer et al., 2015).
Figura 6: Descripción global del proceso de liofilización. De 1-3 Congelamiento (1-2 presión atmosférica); 3-4 secado primario; 4-5 secado secundario.
Fuente: Castañeda (2015)
Líquido Sólido
Gas
Punto triple
(0.01°C, 0.00603 atm)
0°C 100°C 1.0
Temperatura
Presión (atm)
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Figura 7: Ciclo de liofilización dividido en sus tres etapas.
Fuente: Grauer et al. (2015)
2.7.1.1.6 Sellado
El producto final si es posible se debía sellar al vacío, o de forma hermética tan pronto (Castañeda, 2015).
2.7.1.1.7 Almacenamiento
Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente, lo cual no asegura una larga vida útil del producto. Las mejores condiciones de almacenamiento para células bacterianas es a una temperatura de 4 °C en la oscuridad (Castañeda, 2015).
2.7.1.1.8 Rehidratación
Este proceso involucra la adición de una cantidad conocida de diluyente a la torta seca. Para la rehidratación se utiliza medios de cultivos nutritivos no selectivos (agua peptonada) para la recuperación de microorganismos, y así poder evitar el estrés osmótico que pueden causar las soluciones diluidas (Castañeda, 2015).
La liofilización es actualmente la técnica más adecuada y ampliamente utilizada para la conservación de BAL; este proceso impone estrés ambiental a las células bacterianas, como congelación, secado, exposición prolongada a actividades de poca agua y rehidratación. Algunos factores que influyen en la supervivencia microbiana son: la resistencia intrínseca de las cepas, la concentración inicial de los microorganismos, las condiciones de crecimiento, el medio de secado, los agentes protectores utilizados, la velocidad de
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congelación, las condiciones de almacenamiento (temperatura, atmósfera, humedad relativa) y la rehidratación (Edward et al., 2011).
2.7.1.2 Crioprotectores en bacterias acido lácticas
La liofilización es un método para la preservación de bacterias probióticas, levaduras y hongos esporulantes, ya que reduce su actividad de agua; por otro lado, el secado excesivo puede disminuir la viabilidad y estabilidad de microorganismos. Durante el proceso de la liofilización y el almacenamiento de microorganismos probióticos mejora cuando se le añade crioprotectores (Bagad et al., 2017).
Los crioprotectores protegen a las células de los daños causados durante el proceso de la liofilización y también durante el almacenamiento. Algunos disacáridos thehalosa, lactosa, maltosa y sacarosa) y la leche descremada, demostraron su eficiencia como agentes crioprotectores (Ávila et al., 2015).
Los crioprotectores contienen disacáridos no reductores, alcoholes de azúcar, polisacáridos, aminoácidos, proteínas, betaina, glicerol, lactosa, leche descremada y dimetil sulfóxido (Bagad et al., 2017).
Los crioprotectores protegen la viabilidad de los probióticos durante la deshidratación, la leche descremada, proteína de suero, glucosa, maltodextrina y trehalosa, son algunos que cumplen esta función (Kandil & El Soda, 2015).
Dentro de esto compuestos que actúan como crioprotectores están la leche descremada, suero, glicerol, maltosa, lactosa, fructosa, glucosa, aminoácidos, entre otros (Grauer et al., 2015).
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Lugar de ejecución
La investigación se desarrolló en los laboratorios de Microbiología de Alimentos y Control de Calidad de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional del Centro del Perú.
3.2 Equipos y materiales
3.2.1 Equipos de laboratorio
o Autoclave, Marca: WITEG, Modelo: WAC 60, Capacidad: 10 litros.
o Incubadora, Marca: MEMMERT, Modelo: SingleDISPLAY, Capacidad: 32 litros.
o Destilador, Marca: GFL, Modelo: D-30938, Capacidad: 5 litros.
o Balanza analítica, Marca: OHAUS, Modelo: PA224, Capacidad: 220 gramos.
o Contador de colonias, Marca: BOECO Germany, Modelo: CC-1, Capacidad:
1 Placa
o Estufa, Marca: MEMMERT, Modelo: SingleDISPLAY, Capacidad: 32 litros.
o Agitador tipo vortex, Marca: VELP, Modelo: W-236, Capacidad: 1 Tubo de prueba.
o Microscopio, Marca: EUROMEX, Modelo: ISCOPE, Capacidad: 1 Porta objeto.
o Liofilizador, Marca: LIOBRAS, Modelo: L101, Capacidad: 9 Placas.
o Ultracongelador, Marca: EQUITEC, Modelo: EVF LTUF408, Capacidad: 250 litros.
o Agitador magnético, Marca: VEIP, Modelo: AREC/F20500011, Capacidad: 1 Vaso precipitado.
o Centrifugador, Marca: CENTURION SCIENTIFIC, Modelo: PRO- ANALYTICAL.C2006, Capacidad: 6 Tubos falcon.
o Mechero bunsen
38 3.2.2 Materiales
o 60 Placas Petri
o 15 Tubos de ensayo con tapa
o 3 Frascos microbiológicos con tapa rosca de 150 mL o 3 Matraces de 500 mL
o 6 Vasos de precipitación de 250 mL
o 2 Micropipeta de 10 – 100 μL y 100 – 1000 μ o 1 Gradilla de tubos
o 1 Rejilla de asbesto o Asa de kolle
o Puntas
o Triángulo de trigalski o Pizeta de 1000 mL o Papel aluminio o Algodón o Papel kraft o Porta objeto
3.2.3 Materia prima
o Tocosh obtenido por la fermentación de la papa variedad hualash de forma tradicional (P1).
o Tocosh obtenido por la fermentación de papa variedad hualash más glucosa y fuente de nitrógeno (P2).
o Tocosh obtenido por la fermentación de papa pelada variedad hualash más glucosa y fuente de nitrógeno (P3).
39 3.2.4 Insumos
o Almidón soluble
o Goma de tara E – N° 417
o Maltodextrina (10 DE GMO FREE) – FRUTAROM
3.2.5 Reactivos
o Indicador rojo de metilo o Safranina
o Lugol
o Aceite de inmersión
o Peróxido de hidrogeno 3 % o Reactivo de Kovacs
o Agua destilada o Alcohol
3.2.6 Medios de cultivos
o Agar MRS (Man, Rogosa y Sharpe) Calidad: ACC.ISO 15214 o Caldo MRS (Man, Rogosa y Sharpe) Calidad: ACC.ISO 15214 o Peptona de carne: Calidad ACS, ISO
3.3 Métodos de análisis
3.3.1 Preparación de la muestra
La papa (Solanum tuberosum) de la variedad hualash fueron adquiridos en el anexo de Villa Retama, distrito de Shunqui, provincia de Dos De Mayo del departamento de Huánuco, teniendo en cuenta que todas las papas estén en buenas condiciones.
3.3.1.1 Preparación de tocosh – P1 (Papa + agua)
Se obtuvieron 250 gramos de papa variedad hualash, los cuales fueron lavados y puestos en un recipiente con agua de manantial (el volumen de
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agua es el doble de la masa de la papa), para su fermentación putrefacción durante 30 días a temperatura del medio ambiente.
3.3.1.2 Preparación de tocosh - P2 (Papa + agua + tratamiento – FC:
glucosa 2,5 % + FN: fosfato de amonio 1,5 g/L)
Se obtuvieron 250 gramos de papa variedad hualash, los cuales fueron lavados y puestos en un recipiente con agua de manantial (el volumen de agua es el doble de la masa de la papa), añadiéndole glucosa al 2,5 % (fuente de carbono) más fosfato de amonio 1,5 g/L (fuente de nitrógeno), para su fermentación – putrefacción durante 30 días a temperatura del medio ambiente.
3.3.1.3 Preparación de tocosh - P3 (Papa sin cáscara + agua +
tratamiento – FC: glucosa 2,5 % + FN: fosfato de amonio 1,5 g/L) Se obtuvieron 250 gramos de papa variedad hualash los cuales fueron lavados y pelados para luego ser puesto en un recipiente con agua de manatial (el volumen de agua es el doble de la masa de la papa), añadiéndole glucosa al 2,5 % (fuente de carbono) más fosfato de amonio 1,5 g/L (fuente de nitrógeno), para su fermentación – putrefacción durante 30 días a temperatura del medio ambiente.
3.3.2 Medición de parámetros
Se procedió a cuantificar las colonias de bacterias acido lácticas cada 5 días del tocosh P1, P2 y P3; con el cual se observa la evolución de estas bacterias durante 30 días.
3.3.3 Preparación y dilución de las muestras
Se preparó la solución peptonada 1 gramo en 1000 mL; para la dilución denominada 10-1 el volumen del diluyente es 9 veces la muestra más 10 gramos de la muestra (tocosh P1, P2 y P3). Utilizando la dilución 10-1 o llamado también solución madre se preparan las diluciones siguientes (10-2,10-3,10-4 y 10-5).
3.3.4 Preparación del medio de cultivo para BAL
Se utilizaron como medios de cultivo el agar MRS y caldo MRS para el aislamiento de las bacterias acido lácticas obtenidas durante la fermentación – putrefacción de la papa variedad hualash. Se preparó el agar MRS con las especificaciones dadas en el envase, el agar preparado se colocó en placas Petri para su posterior utilización.
