Aislamiento de actinomicetos de muestras ambientales.

El trabajo pionero de Waksman no sólo demostró que los actinomicetos eran capaces de producir antibióticos útiles en medicina, sino que estimuló la búsqueda de nuevas cepas activas. Desde entonces se han aislado y analizado millones de cepas de actinomicetos en los laboratorios de investigación, principalmente de las compañías farmacéuticas, a la vez que se han desarrollado una amplia gama de medios de aislamiento que permitieron identificar y estudiar gran parte de las especies conocidas (Nolan y Cross, 1988). La definición de la composición de los medios de aislamiento es determinante para conseguir recuperar en cultivo la mayor diversidad microbiana de una muestra, evitando que predominen unas pocas especies de rápido crecimiento.

Los primeros métodos de aislamiento desarrollados hace décadas eran poco selectivos y favorecieron el aislamiento intensivo de cepas fácilmente cultivables de especies del género Streptomyces, el grupo mayoritario en cuanto al número de especies descritas entre los actinomicetos y uno de los taxones más prolíficos respecto a la producción de metabolitos secundarios. En décadas posteriores, se observó que otros géneros minoritarios también eran capaces de sintetizar nuevas moléculas y se desarrollaron otras estrategias de aislamiento para estas especies. De esta manera la aplicación de métodos específicos de aislamiento para otros géneros permitió comprobar que algunos de ellos, como los géneros Micromonospora, Nocardia, o Actinoplanes, antes considerados minoritarios, son en realidad muy numerosos y están muy extendidos en diferentes entornos (Nonomura y Ohara, 1971b). Posteriormente, se fueron desarrollando métodos específicos como pretratamientos de la muestra, medios de crecimiento especializados, largos tiempos de incubación que permiten el crecimiento de especies minoritarias como son los géneros Actinomadura, Microbispora, Microtetraspora, Streptosporangium, Thermomonospora o Thermoactinomyces entre muchos otros más (Nonomura y Ohara, 1971 a y b).

También se ha conseguido aumentar la selectividad de los medios de aislamiento al añadir concentraciones subinhibitorias de una amplia variedad de antibióticos que permiten inhibir selectivamente el crecimiento de otro tipo de bacterias competidoras. La superficie de una placa de aislamiento es un ambiente altamente competitivo donde los actinomicetos de crecimiento lento, presentes normalmente en las muestras de tierra en cantidades relativamente pequeñas, están en clara desventaja. La reducción del número de competidores, utilizando diferentes agentes antimicrobianos, ha permitido la identificación de nuevos taxones que no eran cultivados previamente o eran aislados con muy poca frecuencia.

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Además del simple sistema de dilución seriada y plaqueo de las muestras sobre distintos medios de cultivo selectivos se pueden aplicar diferentes pretratamientos a las muestras con el fin de enriquecer el aislamiento en ciertas especies, inducir la germinación de las esporas, dispersar mejor los agregados celulares en la muestra, etc. El pretratamiento con extracto de levadura está descrito como un activador de la germinación de esporas de actinomicetos (Hayakawa y Nonomura, 1989). El pretratamiento de las muestras con este compuesto y con un detergente como el SDS permite reducir el número de bacterias unicelulares en las placas de aislamiento y se ha aplicado con éxito para el aislamiento general de actinomicetos.

Gran parte de las bacterias existentes en el suelo están adheridas a partículas de tierra (arcillas especialmente) mediante cargas iónicas a través de cationes polivalentes. Muchos microorganismos se unen también a las partículas de la matriz del suelo mediante polisacáridos. Estas agregaciones de las esporas o propágulos de actinomicetos a las partículas de tierra puede evitarse por pretratamiento de las muestras con resinas como Chelex 100 y deoxicolato que permiten una mejor dispersión de la muestra y la detección de organismos presentes en muy pequeño número tras concentración por centrifugación diferencial (Herron y Wellington, 1990).

Se han desarrollado ciertos pretratamientos, descritos por Hayakawa y colaboradores (1991a y b), que permiten el aislamiento selectivo de actinomicetos pertenecientes a la familia Streptosporangiaceae (principalmente de los géneros Streptosporangium y Microbispora) y que están basados en el diferente grado de resistencia de las esporas a agentes tóxicos para las células como el cloruro de bencetonio o el gluconato de clrohexidina.

Otras estrategias de aislamiento están basadas en el conocimiento previo de la biología de los microorganismos que se quieren aislar y su comportamiento en el medioambiente. Este el caso de las cepas pertenecientes a la familia Micromonosporaceae (Actinoplanes, Dactylosporangium, Pilimelia, etc) que suelen encontrarse frecuentemente cerca de zonas húmedas de ríos y lagos con abundante vegetación. Las esporas de dichos actinomicetos que se forman dentro de esporangios, resisten largos periodos de desecación y son liberadas tras la hidratación de los esporangios. Las esporas tienen la capacidad de desarrollar flagelos en presencia de agua y son fuertemente atraídas por gradientes de ciertas sustancias como KCl, aminoácidos, compuestos aromáticos y azúcares, siendo la -colidina la que produce una mayor respuesta quimiotáctica. Uno de los métodos de enriquecimiento en bacterias de estas especies está basado en esta propiedad y en la posibilidad de concentrar el número de esporas estableciendo gradientes de -colidina respecto al medio acuático (Palleroni, 1980;

Hayakawa, 1991c). Posteriormente otro método describe un enriquecimiento selectivo en esporas mótiles mediante una centrifugación selectiva de dicha fracción enriquecida (Hayakawa et al., 2000).

Todos estos pretratamientos se combinan normalmente con la utilización de un amplio número de medios de aislamiento muy pobres en nutrientes, sin fuentes de carbono, compuestos de extractos de tierra, sales, ácidos húmicos, de manera que los organismos de rápido crecimiento (Streptomyces en su mayoría) no agoten los pocos recursos existentes e

19 inhiban el crecimiento de los restantes microorganismos minoritarios en un ambiente altamente competitivo. La utilización combinada de diferentes métodos y medios de cultivo lleva a la generación de un promedio de 12 a 20 condiciones distintas para cada una de las muestras en estudio, lo que permite incrementar la explotación de la diversidad microbiológica que pueda contener.

En la práctica, el número de colonias viables de actinomicetos que se seleccionan en el laboratorio a partir de una muestra varía en función de las características de la misma, como pueden ser sus propiedades físico-químicas así como las características de su hábitat, geografía, altitud, ecología, etc. Aunque una mayoría de cultivos corresponden al género Streptomyces, también se aislan muy frecuentemente cepas de los géneros Micromonospora, Actinoplanes y demás géneros relacionados, cepas de Nocardia, cepas de la familia Pseudonocardiaceae (Pseudonocardia, Amycolatopsis, Saccharopolyspora) y de las familias

Thermomonosporaceae y Streptosporangiaceae (Actinomadura, Microbispora,

Streptosporangium, Planobispora, Microtetraspora) (Embley, 1992; Lazzarini et al. 2000 y

2001; González et al., 2005). Con menor frecuencia se identifican otros géneros minoritarios. Un gran número de cepas son estériles en cultivo o presentan micromorfologías no asociables a ningún género descrito, por lo que se tiene que utilizar herramientas alternativas quimiotaxonómicas y moleculares que permitan su identificación y distinción.

Dado que los actinomicetos pueden colonizar casi cualquier sustrato, el interés se ha dirigido hacia la utilización de nuevas fuentes de aislamiento y de otros nichos ecológicos, incluyendo muestras de agua dulce, muestras marinas y sus sedimentos, invertebrados marinos como esponjas, artrópodos, raíces y líquenes, con el objetivo de aislar nuevas cepas y de estudiar su potencial para producir nuevos metabolitos secundarios (Goodfellow y Haynes, 1984; Goodfellow y Williams, 1986; Fenical, 1993; Fiedler et al., 2005; González et al., 2005)