Análisis de los constituyentes de la pared celular.

La determinación de la composición de la pared celular es un elemento esencial en la clasificación quimiotaxonómica de las bacterias gram-positivas al contener distintos tipos de péptidoglicano que puede ser específico de género o de especie. Entre los componentes de la pared celular se estudian los isómeros del ácido diaminopimélico, la composición de azúcares y los ácidos teicoicos.

35 a.- Isómeros del ácido diaminopimélico.

En quimiotaxonomía existen dos parámetros claves en la identificación de los actinomicetos: el isómero del ácido diaminopimélico presente en la pared celular (Becker et al., 1965), y los azúcares de diagnóstico presentes en el hidrolizado de la célula entera (Lechevalier y Lechevalier, 1970).

El péptidoglicano está formado por glicano, un polímero en el que se alternan unidades de N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico y por un péptido que une la cadena de glicano. La variación del péptido proporciona una información taxonómica, especialmente en los actinomicetos. Por el contrario, el glicano del peptidoglicano no presenta tanta variación. El ácido 2,6-diaminopimélico (DAP) está ampliamente distribuido y las bacterias contienen generalmente sólo uno de los isómeros, la forma LL o la forma meso (DL). La determinación del tipo de isómero del DAP, a partir de células enteras, constituye una de las determinaciones clave en el análisis de la pared celular de bacterias gram positivas, ya que permite distinguir entre géneros que presentan meso-DAP y otros géneros, como Streptomyces, que contienen LL-DAP.

b.- Composición de azúcares de células enteras.

La composición en azúcares suele proporcionar una información útil para la clasificación e identificación de actinomicetos. La pared celular bacteriana contiene otros tipos de azúcares, además de la glucosamina y el ácido murámico del péptidoglicano. El patrón de azúcares obtenido a partir de células enteras divide a los actinomicetos que contienen meso- DAP en cuatro tipos. El tipo A se caracteriza por la presencia de arabinosa y galactosa sin xilosa. El tipo B tiene madurosa y no presenta arabinosa ni xilosa. El tipo C no tiene azúcares característicos, mientras que en las cepas de tipo D se encuentran xilosa y arabinosa. La presencia de madurosa es un marcador importante para algunos géneros de actinomicetos, como por ejemplo los géneros Actinomadura, Streptosporangium y Microbispora (Lechevalier y Lechevalier, 1970)

1.4.1.3.Análisis de proteínas celulares totales.

Numerosos estudios han demostrado que una alta similitud del perfil de proteínas suele generalmente corresponder y ser indicativo de una alta homología de hibridación del ADN. Por tanto, una gran ventaja de esta técnica es que, una vez que dicha correlación se ha establecido para un determinado taxón, puede reemplazar, al menos en parte, a los experimentos de hibridación del ADN (Vauterin et al., 1992; Lanoot et al., 2002). Como en el caso de los ácidos grasos, las cepas deben crecerse en condiciones altamente estandarizadas, permitiendo de este modo la comparación de los perfiles normalizados de proteínas y como consecuencia la creación de bases de datos para la identificación de cepas

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totales se ha realizado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) en condiciones altamente estandarizadas.

Análisis mediante MALDI-TOF

Entre los análisis quimiotaxonómicos para la identificación de microorganismos está cobrando cada vez más importancia el análisis de los perfiles de proteínas mediante MALDI- TOF, debido a la especificidad y el rápido análisis. Al contrario que los métodos basados en el ADN, la detección de los espectros de masas no requiere secuencias genómicas o de proteínas de referencia. Además, la espectrometría de masas MALDI-TOF aplicada en microbiología permite analizar diferentes biomarcadores en microorganismos intactos, convirtiéndose en una importante herramienta aplicada a las ciencias biológicas y al diagnóstico y sustituyendo muchos de los métodos convencionales para la clasificación e identificación de especies de bacterias (Claydon et al., 1996; Fenselau y Demirev, 2001;

Bright et al., 2002).

La espectrometría de masas MALDI-TOF permite registrar iones biomarcadores en un amplio rango de m/z (lípidos, proteínas, ADN, ARN). Sin embargo, las proteínas proporcionan los biomarcadores más característicos de los microorganismos, utilizándose los de un rango de 4000-20000 Da para realizar el fingerprinting de microorganismos. En E.coli todas las proteínas proceden del interior de la célula y el 50% son proteínas ribosomales (Pineda et al., 2003).

La técnica del MALDI-TOF requiere una pequeña muestra (<1 ul, una única colonia con un límite de detección de 103 células) depositada sobre una placa de análisis antes de la adición de la matriz y el análisis. Además, el láser asegura la desorción/ionización de sólo las proteínas intactas protonadas. La separación de las masas se realiza mediante el análisis de TOF que es un método rápido y el espectro de masas se realiza en su mayoría por la detección de iones positivos (Maier

y

Los patrones de masas de proteínas (la señal y la intensidad de las masas) detectados por espectrometría de masas mediante MALDI-TOF pueden analizarse eficazmente en grandes números y alto procesamiento usando métodos de “clustering” jerárquicos en poco tiempo (Sauer et al., 2008; Petersen et al., 2009). En los espectros de masas obtenidos usando células enteras, lo habitual es detectar hasta 30 picos, predominantemente en el rango de masas moleculares de 4.000 a 13.000 Da. Se ha visto que este número de picos es suficiente para la identificación de bacterias a nivel de género y especie para muchos patógenos bacterianos presentes en alimentos u otros patógenos de importancia clínica, tales como Escherichia coli, Campylobacter, Salmonella, Pseudomonas, Yersinia, y Listeria (Smole

et al., 2002; McElvania et al., 2013; Balážová et al., 2014), así como cepas de Actinobacterias

(Verroken et al., 2010; Hsueh et al., 2014) y para evaluar la diversidad de cepas ambientales (Dieckmann et al., 2005).

Una plataforma comercial para la clasificación e identificación de microorganismos basada en el análisis de perfiles de proteínas por medio de la espectrometría de masas

37 MALDI-TOF es la desarrollada por Bruker Daltonics (MALDI-TOF/BiotyperTM). Esta plataforma analiza las muestras de forma automática e identifica los microorganismos por comparación de los perfiles de proteínas obtenidos con los de una base de datos que contiene más de 5600 cepas con perfiles de referencia (Maier

y