1.3. Biodiversidad microbiana y bioprospección.
1.3.3. Diversidad microbiana.
El término “diversidad biológica” fue acuñado por Elliot Norse y colaboradores (1986) y puede aplicarse para definir la diversidad según el nivel de complejidad, bien a nivel genético para definir la diversidad entre especies, a nivel de especie para determinar el número de especies, y a nivel ecológico para estudiar la diversidad de la comunidad.
La medida más sencilla de la biodiversidad es la riqueza de especies, es decir, el número de especies presentes en un área o hábitat determinado. La riqueza de especies, también conocida como diversidad-α, define la riqueza de un conjunto de organismos que potencialmente interactúan; de forma parecida, la diversidad-γ mide la diversidad dentro de un área pero relacionada con un área mayor como un bioma o bioregión. La diversidad-β es una medida de la diversidad entre áreas y puede expresarse como un índice de similitud. Otra medida de la biodiversidad, con mayor información ecológica, es la abundancia de especies. La rareza de una especie viene dada según el tamaño de la población local (grande o pequeña), especificidad del hábitat (amplio o estrecho) y por el tamaño geográfico (grande o pequeño).
El concepto de “especie” es un tema de discusión recurrente en taxonomía. Las especies son entidades prácticas para las que los límites pueden variar dependiendo del concepto aplicado, bien sea éste biológico, fenético, filogenético o evolutivo (Hull, 1997).
El término “especie” puede emplearse para referirse a una categoría taxonómica que se corresponde a un concepto abstracto desprovisto de cualquier localización espacio-temporal o bien a una entidad colectiva concreta formada por organismos reales localizados en el espacio y en el tiempo, es decir, un taxón (Van Regenmortel, 1997). Los taxones, nombrados como clases naturales de organismos, son el resultado de dos procesos: (i) los procesos evolutivos que han originado la diversidad biológica y (ii) la capacidad mental humana que reconoce y da nombre a los patrones recurrentes (Hey, 2001). La delimitación de las especies se ha optimizado por medio del desarrollo de métodos microbiológicos que revelan tanto las propiedades genómicas como fenotípicas de los procariotas.
Las primeras definiciones de especies bacterianas se fundamentaban con frecuencia en grupos monotéticos que se reconocían por un conjunto único y exclusivo de características que son suficientes y necesarias para la definición del grupo y que son invariables (Goodfellow et al., 1997b). La rigidez de esta definición tuvo como consecuencia que algunas cepas que variaban en caracteres clave no podían identificarse como miembros de un taxón existente. Esto dio lugar a menudo a confusiones en la nomenclatura en donde una especie dada podía clasificarse simultáneamente bajo varios nombres diferentes, como es el caso de la sobreespeciación del género Streptomyces (Goodfellow et al., 1997b). Con el desarrollo de la taxonomía numérica (Sneath y Sokal, 1973) el concepto de especie evolucionó abandonando la aproximación monotética hacia una politética o fenética, en donde las especies estaban delimitadas en base a un gran conjunto de caracteres independientes, cada uno de los cuales puede ocurrir también fuera de una clase determinada y por tanto, no son
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exclusivos de esa clase (Van Regenmortel, 1997). El éxito para delimitar una especie en tales términos es directamente dependiente de la cantidad de caracteres que se usen. Generalmente se acepta que una especie de procariotas es “un grupo de cepas que tienen un alto grado de similitud global y que difieren considerablemente de los grupos de cepas emparentadas con respecto a muchas características independientes” o “una colección de cepas que muestran un alto grado de similitud global, comparados con otros grupos de cepas relacionados” (Colwell et al., 1995). La taxonomía numérica es un sistema fenético basado en similitudes fenotípicas globales que establece unidades taxonómicas operacionales (OTUs).
Una mayoría de análisis fenéticos están basados en datos fenotípicos, en gran parte en propiedades bioquímicas. El fenotipo de las bacterias se estudia extensamente con frecuencia mediante el uso de marcadores quimiotaxonómicos tales como los perfiles de ácidos grasos, poliaminas y quinonas (Goodfellow y Minnikin, 1985). El objetivo de la clasificación fenética es crear conjuntos de cepas agrupadas, establecidas como una jerarquía de especies y géneros en base a sus similitudes globales (Young, 2001). Los datos fenotípicos incluyen tanto datos de un solo carácter como datos de caracteres múltiples.
El estudio de Williams y colaboradores (1983b y 1983c) fue un hito de la taxonomía numérica y de la sistemática de Streptomyces. En dicho estudio, examinaron 162 caracteres que comprendían características morfológicas, pigmentación, actividad antimicrobiana, resistencia a antibióticos, la utilización de compuestos orgánicos como única fuente de carbono y de nitrógeno, y la realización de una serie de pruebas bioquímicas, degradativas y de crecimiento. Posteriormente, Kämpfer y Kroppenstedt (1991) actualizaron el sistema de clasificación de Williams y colaboradores ampliando a 329 el número de caracteres fisiológicos a identificar e incluyendo un mayor número de cepas de Streptomyces (Goodfellow et al. 1992)
La inclusión de características genómicas al conjunto de caracteres usados para delimitar las especies ha impulsado importantes cambios y ha influido a la hora de definir una especie (Stackebrandt et al., 2002). En particular, la adopción de la hibridación del ADN genómico total, como un método estándar para la definición de una especie, permitió correlacionar los valores de hibridación del ADN y los datos quimiotaxonómicos y fenotípicos (Goodfellow et al., 1997b). Se estableció que los organismos que tienen valores de reasociación de ADN-ADN del 70% o menores, y/o un ΔTm de 5ºC o menos deben
considerarse especies distintas, si además está corroborado por alguna característica fenotípica (Stackebrandt y Gobel, 1994).
Un punto de inflexión en la sistemática bacteriana ocurrió al introducir la secuencia del gen 16S ARNr en los análisis cladísticos para delinear árboles genealógicos (filogenéticos) (Woese, 1987). En el caso de los microorganismos, las inferencias filogenéticas dependen casi por completo de la evidencia indirecta suministrada por el análisis de los datos de secuencia que se considera expresan tasas de cambio genético (mutación de las bases nucleotídicas) con el tiempo, usándose para inferir relaciones históricas fiables. Al contrario que la taxonomía numérica, la sistemática filogenética (cladística) revela, o intenta revelar, relaciones evolutivas dentro de un grupo de organismos y utiliza la composición en bases del
25 ADN, homología del ADN, fingerprinting genómico y secuenciación de genes para establecer tales relaciones.
La secuencia del gen 16S ARNr carece de poder de resolución a nivel de especies de procariotas, tal y como se definen por la similitud del ADN-ADN, pero permite la identificación de la posición filogenética de nuevos organismos (Ludwig y Schleifer, 1994; Stackebrandt y Gobel, 1994; Mehling et al., 1995a). Uno de los parámetros indispensables que debe suministrarse en las descripciones de nuevas especies es el de la secuencia completa del gen 16S ARNr (Stackebrandt et al., 2002).
La definición de especie en procariotas definida anteriormente puede lograrse por la aplicación simultánea de un conjunto de técnicas dirigidas al conocimiento de la diversidad de las cepas bajo estudio, siguiendo la denominada aproximación polifásica (Colwell, 1970;
Vandamme et al., 1996). El camino más adecuado para definir una especie es la aplicación de los resultados de los análisis fenéticos, filogenéticos y genotípicos (Rosselló-Mora y Amann, 2001; Staley, 2006;Tindall et al., 2010). Una especie es una categoría que delimita un grupo de cepas individuales genómicamente coherente que comparten un alto grado de similitud en muchos caracteres independientes, probadas comparativamente bajo altas condiciones estándar (Stackebrandt et al., 2002).
La aproximación polifásica.
Hoy en día, existe un gran número de técnicas para la identificación y clasificación de procariotas. La clase de información que cada técnica produce está directamente relacionada con su poder de resolución, y el uso correcto de la información es esencial para garantizar la adecuada clasificación de un taxón. Es por tanto de primordial importancia entender a qué nivel suministran información estos métodos y darse cuenta de su complejidad técnica, es decir, de la cantidad de trabajo, tiempo y coste económico que requieren.
Los datos genómicos se obtienen de los ácidos nucleicos (ADN y ARN) mediante diversos métodos, algunos de ellos ya clásicos como la determinación del contenido en porcentaje de G+C, la hibridación ADN-ADN o el análisis de la secuencia del gen 16S ARNr, o por métodos de caracterización basados en el ADN tales como RFLP, LFRP (low-frequency restriction pattern analysis), RAPD, AFLP, Rep-PCR y ARDRA entre otros.
La información del fenotipo se obtiene por el uso de análisis fenotípicos clásicos incluyendo los estudios quimiotaxonómicos. Entre los análisis fenotípicos clásicos tenemos la morfología (macro y micromorfología) y caracteres fisiológicos y bioquímicos. Los marcadores quimiotaxonómicos hacen referencia a aquellos constituyentes químicos de las células que son útiles para caracterizar a los procariotas, incluyendo componentes tales como la composición de la pared celular, ácidos grasos celulares, quinonas isoprenoides y poliaminas. En las Figuras 1 y 2 tenemos una representación esquemática de varias técnicas utilizadas en una aproximación polifásica así como el nivel de resolución taxonómica de las mismas (basado en Vandamme et al., 1996).
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Por tanto, el término de especie debe usarse sólo cuando la caracterización se ha realizado con fundamentos polifásicos, mientras que términos como OTUs y filotipo deben usarse para entidades basadas en la fenética o en la secuencia de genes, respectivamente.
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Figura 1. Representación esquemática de varios componentes celulares y técnicas con
información fenotípica y genotípica utilizadas en una aproximación polifásica (basado en
Vandamme et al., 1996).
ARNm
PROTEÍNAS
AR
Nt
23S
16S
5S
ADN
ADN
ADN TOTAL: % MOL G+C RFLP, PFGE HIBRIDACIONES ADN-ADN FRAGMENTOS DE ADN: PCR-Fingerprinting (ARDRA, RAPD, AFLP, rep-PCR, etc) Sondas de ADNSecuenciación de ADN