Análisis de la producción de peróxido de hidrógeno

Como se enunció anteriormente, una característica temprana de la HR es la generación rápida de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Lamb y Dixon, 1997). Por ello se decidió realizar tinciones con el colorante DAB, que se oxida en

presencia de H2O2 formando coloraciones marrones (ver Materiales y Métodos

3.12.2.). El ensayo se realizó utilizando hojas de plantas de tabaco, usada como modelo de plantas no hospedadoras, debido a la facilidad en el manejo y en la observación. La proteína Trx-6His-HrpE fue entonces infiltrada en hojas de plantas de tabaco a una concentración 5 M. Al mismo tiempo se realizaron los controles

necesarios para validar el ensayo, los que incluyeron la infiltración con buffer y con

la proteína Trx-6His como controles negativos, y con la bacteria Xac tipo salvaje como control positivo de HR. Luego de 4 horas de infiltración se colectaron las hojas y se realizó la tinción. Se detectaron coloraciones marrones en el tejido de tabaco

tratado con HrpE; indicando que la misma induce la producción de H2O2 en la planta.

Estas coloraciones se observaron principalmente en los vasos y en las nervaduras cercanas a la zona infiltrada (Figura 6.11). Para una mejor observación de las tinciones, se tomaron fotografías utilizando un microscopio óptico y un objetivo de aumento de 4X.

Figura 6.11. Tinciones con DAB para evidenciar la producción de H2O2 en tabaco tratado con HrpE. Se muestran imágenes representativas de los experimentos realizados. Los controles negativos realizados para este ensayo fueron Buffer (Tris 50 mM pH 8) y Trx (Trx-6_{His a una concentración 5 M en Tris 50 mM pH 8). El control positivo de HR realizado fue infiltrando con Xac} (X. axonopodis pv citri, suspensión a 108 _{UFC/ml). Las coloraciones marrones indicadas con flechas blancas son indicativas de} la presencia de H2O2 en hojas tratadas con Xac y HrpE. Estas coloraciones no se observaron en los controles negativos, tal como era esperado. La barra inferior indica 1 mm.

Por otra parte, el ensayo de tinción con DAB también se realizó en hojas de plantas de naranja con la intención de observar producción de ROS (H2O2) al

enfrentarlas a HrpE (ver Materiales y Métodos 3.12.2.). Para ello, Trx-6His-HrpE fue

infiltrada en hojas de plantas de naranja a una concentración 5 M. Como controles negativos se realizó la infiltración con buffer y con la proteína Trx-6His y, en este caso, se utilizó la bacteria Xcv como control positivo de HR. Luego de 8 horas de infiltración se colectaron las hojas y se realizó la tinción correspondiente. Así, se detectaron coloraciones marrones en las zonas tratadas con HrpE y con el control positivo, no siendo así con los controles negativos. Estas coloraciones se lograron observar a simple vista en las cercanías de la zona infiltrada. Para una mejor observación de las tinciones, además se tomaron fotografías de cada tratamiento realizado utilizando un microscopio óptico y un objetivo de aumento de 4X (Figura 6.12).

Figura 6.12. Tinciones con DAB para evidenciar la producción de H2O2 en naranja tratada con HrpE. (A) Fotografía de una hoja representativa del ensayo de tinción con DAB. Se indican las zonas donde se infiltraron las muestras con líneas de puntos. Se puede observar la coloración marrón característica de este colorante en las zonas donde se trataron las hojas con HrpE y Xcv. Los controles negativos utilizados fueron Buffer (Tris 50 mM pH 8) y Trx (Trx-6_{His a una concentración 5 M en Tris 50} mM pH 8). El control positivo realizado fue infiltrando con Xcv (X. campestris pv vesicatoria (suspensión a 108 _{UFC/ml). (B)} Microfotografías realizadas con un microscopio óptico y un aumento 4X para evidenciar mejor las tinciones observadas en (A). Se muestran imágenes representativas de los experimentos realizados. Se indican con flechas blancas los depósitos de colorante formados en los casos positivos para la tinción, HrpE y Xcv. La barra inferior en (A) indica 1 cm y en (B) 1 mm.

6.3.3. Análisis de la deposición de calosa

Una de las respuestas que forman parte de la defensa innata de las plantas es la producción de depósitos de calosa, lignina y otros compuestos que fortifican la pared celular (Ligterink et al., 1997). A fin de analizar los niveles de deposición de calosa en tejidos de plantas, tanto no hospedadoras como hospedadoras, infiltrados con la proteína HrpE, se realizó una tinción con el colorante Azul de Anilina, el cual produce fluorescencia al estar unido al polisacárido cuando es excitado con luz UV (ver Materiales y Métodos 3.12.3.). Así, el ensayo de tinción se realizó utilizando hojas de plantas de pimiento, tabaco y tomate como modelos de plantas no

hospedadoras, y con hojas de naranja como hospedadora. Se infiltró Trx-6His-HrpE

a una concentración 5 M. Además se realizaron los controles necesarios para validar el ensayo. Como controles negativos se realizó la infiltración con buffer y con la proteína Trx-6_{His a una concentración 5 M y, según el caso de cada tipo de}

planta, se utilizó la bacteria Xac o Xcv, suspendida a 108 UFC/ml como control positivo. Luego de 8 horas de infiltración se colectaron las hojas y se realizó la tinción correspondiente.

En todos las especies de plantas evaluadas, los depósitos de calosa se observaron sólo con los tratamientos realizados con HrpE y con los respectivos

controles positivos, no observándose en los tratamientos con la proteína Trx-6_{His a}

una concentración 5 M o con buffer. En los casos de plantas no hospedadoras, los

depósitos se encontraron mayoritariamente ubicados contorneando las paredes celulares vegetales; hecho que en el caso de naranja no fue del mismo modo, observándose solamente depósitos aislados (Figura 6.13). Además, se cuantificaron los depósitos de calosa midiendo la fluorescencia en las imágenes obtenidas tomando en cuenta al menos 30 fotos de diferentes campos dentro de la zona

analizada, y cuantificándose el porcentaje de pixels coloreados, tomados a partir de

una intensidad determinada, sobre el total de pixels que conforman la foto (Luna et

al., 2011). La intensidad de fluorescencia utilizada fue la obtenida como promedio de

la encontrada en los controles negativos para cada caso. De esta forma, se logró graficar cuánto mayor fue la deposición de calosa en los distintos tratamientos, con respecto a sus respectivos controles negativos (Figura 6.13). En conjunto estos resultados estarían indicando que la proteína HrpE es reconocida por las plantas e induce la deposición de calosa, generando una respuesta inmune basal mucho más

fuerte en los casos de plantas no hospedadoras con respecto al caso de plantas hospedadoras.

Figura 6.13. Tinción con Azul de Anilina para detectar depósitos de calosa generados en respuesta a HrpE en pimiento, tabaco, tomate y naranja. (A) Se muestran imágenes representativas de los experimentos realizados. Se observa la deposición de calosa como fluorescencia de color azul en las paredes de las células vegetales en los tratamientos realizados con Trx-6_His- HrpE y los controles positivos para cada especie de planta no hospedadora, y en forma de depósitos aislados para el caso de naranja. En todos estos casos las muestras se tomaron y analizaron 8 horas luego de la infiltración. (B) Para cada caso analizado, también se graficó el porcentaje de depósitos de calosa sobre la superficie total de cada foto. Las barras representan el promedio obtenido tomando en cuenta al menos 30 campos representativos de cada tratamiento obtenidos a partir de 3 ensayos independientes, normalizados con respecto al tratamiento con buffer. Las barras de error indican las desviaciones estándar en el caso del tratamiento control, y el error propagado en los casos de los tratamientos deseados. Las barras inferiores representan 20 m.

6.4. Análisis de la expresión transcripcional de genes involucrados en