Expresión del gen hpa1 dentro y fuera de la planta

La expresión de los distintos operones hrp se activan in planta por los reguladores transcripcionales HrpG y HrpX, cuyos genes se encuentran en otro lugar del cromosoma bacteriano (Koebnik et al., 2006). Muchos de los genes activados por estos reguladores poseen un elemento regulador cis conservado llamado Caja PIP (del inglés, Plant-Inducible Promoter), que tiene la secuencia consenso TTCGB- N4-15-TTCGB, donde B se refiere a cualquier base excepto adenina. Como modelo

de acción, se ha propuesto que HrpX se une a la caja PIP para inducir la expresión del gen ubicado corriente abajo (Koebnik et al., 2006).

Realizando un análisis in silico de la región promotora del gen hpa1, se encontró que la misma contiene una caja PIP perfecta ubicada a unos 159 bp corriente arriba del sitio de inicio de la traducción, conteniendo una región interna de 15 bp (subrayada), y siendo esta secuencia TTCGCCCGTACAAGCGCAATTTCGC. Para corroborar la funcionalidad de esta caja PIP, se decidió evaluar si el gen hpa1

es expresado durante el proceso patogénico, a través de la cuantificación del ARNm del gen. Para ello se extrajo el ARN total de células de Xac recuperadas a los 0, 1, 2 y 3 dpi de hojas de C. sinensis infectadas con el patógeno (ver Materiales y Métodos 3.14.3. y 3.14.4.). El análisis a través de qRT-PCR (ver Materiales y Métodos 3.14.6.) demostró que la expresión de hpa1 aumentó en el primer día, alcanzando valores significativamente diferentes en cada punto analizado; y que el gen fue altamente inducido a los 3 dpi (Figura 4.14). El acompañamiento del aumento en la expresión del gen hpa1 en relación al tiempo de infección, sugiere que Hpa1 tiene un papel en el proceso de patogenicidad.

Figura 4.14. Análisis de la expresión del gen hpa1 durante el proceso infectivo de Xac. Se extrajo el ARN total de Xac recuperada de las hojas de cítricos en los tiempos indicados, y se analizó la expresión de hpa1 por qRT-PCR. Las barras indican los niveles de expresión del gen en relación al día 0 después de la inoculación. Los valores representan las medias de tres experimentos independientes. Las barras de error indican las desviaciones estándar correspondientes.

La mayoría de las bacterias fitopatogénicas existen como epifitas (cualquier organismo que crece sobre otro usando al último solamente como soporte) sobre las estructuras de las plantas antes de la colonización, y la probabilidad de ocurrencia de la enfermedad se relaciona directamente con el tamaño de la población epifítica del patógeno (Hirano y Upper, 1983). Leben desarrolló una hipótesis, en la cual se plantea que el patógeno puede multiplicarse sobre las superficies de una planta sana, y por lo tanto proporcionar un inóculo con ausencia de enfermedad. Cuando las condiciones adecuadas prevalecen, se desarrolla la enfermedad. De esta forma, tales patógenos tendrían un hospedador, así como una fase no patógena de crecimiento (Leben, 1963). Las bacterias que se encuentran en la superficie de las hojas, probablemente tienen adaptaciones particulares que les permiten explotar los ambientes epifíticos. Estas son distintas de las bacterias que se encuentran en otros hábitats, tales como las inmediaciones del suelo, y son superiores a las de otros hábitats ya que toleran condiciones ambientales duras sobre la superficie de las hojas. Curiosamente, este tipo de características de adaptación pueden haberse desarrollado a expensas de las que promueven la supervivencia en otros hábitats, ya que varias especies epifíticas no tienen una buena supervivencia en el suelo (Beattie y Lindow, 1994). Por otra parte, se detectó también la expresión de genes del SST3 de Xanthomonas euvesicatoria sobre la superficie de hojas, lo que sugiere un papel para el SST3 en la supervivencia epifítica de estas bacterias (Zhang et al., 2009). En una publicación científica reciente, se reveló que la supervivencia de las cepas deficientes en el SST3 en la superficie de las hojas se reduce, apoyando la

hipótesis del papel del SST3 y sus proteínas efectoras en la promoción de la supervivencia bacteriana epifítica (Lee et al., 2012). En base a esta información, se decidió analizar si hpa1 es expresado durante el desarrollo epifítico de Xac en hojas

de C. sinensis a través de la cuantificación del ARNm del gen. Para ello se extrajo

ARN total de células de Xac recuperadas a los 0, 1, 3, 7, 10, 14 y 21 días de crecimiento epifítico (ver Materiales y Métodos 3.14.2. y 3.14.4.). El análisis a través de qRT-PCR (ver Materiales y Métodos 3.14.6.) demostró que la expresión del gen

hpa1 aumentó significativamente desde el primer día, alcanzando los valores más altos entre los 7 y los 10 días; valores que decayeron hasta los iniciales a los 21 días (Figura 4.15). Esto indica que la expresión de hpa1 es temprana en el proceso de supervivencia epifítica y sugiere que Hpa1 podría tener un papel muy temprano en el proceso de patogenicidad de Xac, comenzando en la fase epifítica de la bacteria.

Figura 4.15. Perfil de expresión de hpa1 en la supervivencia epifítica. Se extrajo ARN total de Xac recuperada de la superficie de hojas de cítricos en los tiempos indicados, y se analizó por qRT-PCR. Los puntos indican los niveles de expresión del gen

hpa1 en relación al día 0 de crecimiento. Los valores representan las medias de dos experimentos independientes. Las barras de error indican las desviaciones estándar.