Hpa1 es capaz de formar fibras de tipo amiloides in vitro

Oh y colaboradores, usando una variedad de técnicas como cromatografía de exclusión molecular, espectroscopía de dicroísmo circular, tinción con rojo congo, y resistencia a proteasas, demostraron que HpaG de Xag oligomerizaría primero como tetrámero, luego espontáneamente formaría fibrillas ricas en láminas , y finalmente fibras de tipo amiloides, y que la HR desarrollada por esta proteína en plantas no

hospedadoras es dependiente de esta estructura amiloide (Oh et al., 2007). Debido

a que Hpa1 es muy similar a HpaG de Xag (Figura 4.1), se decidió analizar la capacidad de Hpa1 para formar este tipo de estructuras. Para este fin, se realizó el ensayo de unión a rojo congo (CR).

El CR es un colorante ampliamente utilizado en la detección de fibras amiloides ya que, entre otras características, su espectro de absorción se ve modificado al unirse a este tipo fibras, mostrando un corrimiento hacia el rojo en este

caso (Klunk et al., 1999). Las interacciones entre el CR y las fibras amiloides han

sido previamente caracterizadas y se ha demostrado que dependen de la conformación secundaria de las estructuras amiloides, específicamente de las estructuras ricas en láminas . De hecho, las conformaciones de láminas típicas de fibras amiloides parecen ser el factor crucial en la unión del CR, ya que otras proteínas que carecen o contienen una proporción menor de láminas no se unen al

CR (Klunk et al., 1999). Se han propuesto varios modelos mutuamente excluyentes

para explicar la unión del CR a las láminas de las proteínas amiloides. Uno de ellos declara que el CR se encontraría en una posición perpendicular a la cadena principal del péptido de la proteína amiloide, interactuando con las cadenas aminoacídicas laterales cargadas positivamente. Otro, que el CR se encontraría paralelo a la cadena principal del péptido y se intercalaría entre dos láminas . Un tercer modelo predice que el CR se uniría directamente a las cadenas laterales de una sola lámina . El componente clave común a todos los modelos es la idea de que existe una interacción estequiométrica y saturable entre el CR y la fibra amiloide. Esta interacción conduce a un cambio en las características espectrales del colorante por razones que aún no se comprenden completamente. Sin embargo, el desplazamiento espectral inducido por esta interacción estequiométrica y saturable permite la cuantificación precisa y absoluta de la concentración del

1997).

Se procedió entonces a la realización del ensayo por espectroscopía de luz visible del CR sólo, y unido a posibles fibras amilodes de Hpa1 (ver Materiales y Métodos 3.5.6.), obtenidas agitando una solución de esta proteína por 30 horas utilizando una microbarra y un agitador magnético. Al igual que ocurre con otros

harpin (Oh et al., 2007), las fibras formadas por Hpa1 de Xac se unieron al colorante

presentando un desplazamiento hacia el rojo en su espectro, el cual mostró una diferencia máxima de la absorbancia respecto a la curva de CR sólo aproximadamente a los 540 nm (Figura 5.5 A). Por otro lado, se utilizó la proteína

Trx-6His como control, la que contrariamente a Hpa1, no se unió al colorante CR

(Figura 5.5 B). Este resultado sugiere que Hpa1 podría formar fibras del tipo amiloides.

Figura 5.5. Hpa1 forma fibras amiloides, reveladas por la unión a rojo congo (CR) y espectroscopía visible. Espectros de absorbancia de una solución de CR en ausencia (línea de trazos cortos) y presencia (línea de trazos largos) de posibles fibras de 6_{His-Hpa1 (A) y de Trx-}6_{His (B), corregidos respecto a los espectros de cada proteína sola, respectivamente. Las líneas de}

puntos indican, para cada proteína analizada, la diferencia entre el espectro de CR con proteína y CR sólo. Cada espectro mostrado es el resultado de la acumulación de tres corridas espectroscópicas. (C) Estructura de una molécula de rojo congo.

Otra forma de corroborar la formación de fibras amilodes, es realizando un ensayo de tinción con CR analizando, a través de microscopía de luz polarizada, el fenómeno de birrefringencia. En la década de 1920 Benhold y Divry establecieron que el CR se unía a estructuras amiloides en secciones de tejidos animales, y

demostraron que en estas condiciones el mismo presenta una birrefringencia verde- manzana característica bajo polarizadores cruzados. Desde entonces, esta birrefringencia característica se ha utilizado como método de diagnóstico para las enfermedades neurodegenerativas que se desarrollan a través de la formación de

fibras amiloides (Khurana et al., 2001). En este ensayo, y debido a la naturaleza

estructurada de estas fibras, las moléculas del colorante se orientan en una posición determinada. Cuando se incide luz polarizada sobre fibras amiloides teñidas con CR, se puede observar un color verde-manzana colocando un segundo polarizador (en el ocular) orientado a 90º del primero (ver Materiales y Métodos 3.5.7.). Así, se realizó

este ensayo con una muestra de fibras de 6His-Hpa1 y, como control, también se

realizó el ensayo con la proteína Trx-6His. De esta forma, sólo Hpa1 produjo el

efecto de birrefringencia verde-manzana esperado (Figura 5.6). Por el contrario, la proteína Tiorredoxina no tuvo tal efecto, aún cuando del ensayo para ésta se realizó con mayor cantidad de proteína (datos no mostrados).

Figura 5.6. Birrefringencia de Hpa1. Microfotografías de fibras de Hpa1 teñidas con CR y visualizadas con luz simple polarizada y con luz doble polarizada. Se observa detalladamente el efecto birrefringente característico verde-manzana esperado. La barra representa 40 m.

Se ha informado anteriormente que proteína harpin HrpZ de P. syringae forma

diversos oligómeros, hasta octámeros o decámeros (Chen et al., 1998; Tarafdar et

al., 2009), y que también puede formar grandes estructuras oligoméricas, de por lo

menos 16 unidades de monómeros (Haapalainen et al., 2011). Con la intención de

estructuras oligoméricas intermedias, se procedió a realizar un ensayo de filtración en gel utilizando una columna de exclusión molecular de muestras de fibras de la misma (ver Materiales y Métodos 3.5.3.). De esta forma, se logró determinar que las fibras de Hpa1 son de un tamaño muy superior al encontrado para la proteína purificada recientemente, determinándose además que aparentemente no están presentes otras estructuras oligoméricas superiores a la tetramética. Sólo se logra observar un pequeño “hombro”, indicativo quizás de la existencia de fibrillas. De hecho, se puede observar que casi toda la proteína se mueve por fuera de los poros de matriz, saliendo prácticamente en el volumen muerto de la columna. Se puede decir entonces que al llegar al estadío de fibras no existen oligómeros intermedios de bajo peso molecular, sino que es un conjunto heterogéneo de distintas estructuras de alto peso molecular. Si bien se observa un pequeño pico del peso molecular tetramérico en la muestra de fibras, el mismo es de una intensidad muy baja, lo que indica que el proceso de fibrilación es un proceso que conlleva a la pérdida casi total de las conformaciones oligoméricas de bajo peso molecular, al menos en el caso de Hpa1 (Figura 5.7).

Figura 5.7. Perfil de salida de la columna de exclusión molecular Superdex 200. Se sembró una alícuota de Hpa1 recombinante recientemente purificada (línea de trazo cortado), y una alícuota de fibras de Hpa1 (línea de trazo continuo). Se puede observar que no sólo cambian las intensidades de los picos para cada caso, sino también lo hacen las relaciones entre ellos.