APROVECHAMIENTO DE LAS FASES ACUOSAS PROCEDENTES DEL ALGA

4.1.1. Resumen

Este estudio de aprovechamiento de las fracciones acuosas procedentes del alga congelada ha servido para verificar que el almacenamiento de Sargassum muticum a baja temperatura es una alternativa para preservar sus características, particularmente el contenido en compuestos bioactivos antioxidantes. La utilización de biomasa de algas requiere de etapas previas de acondicionamiento térmico y mecánico de la materia prima para alcanzar unas características de humedad, tamaño de partícula, rotura de la pared celular, etc., de modo que pueda ser de interés para cada proceso de valorización propuesto. Dentro de este marco, el empleo de biomasa de S. muticum puede requerir de un paso previo de reducción de su contenido en agua. Cuando esta tarea se realiza por métodos mecánicos como el prensado, la cantidad de agua eliminada puede ser recogida generando una nueva corriente de desecho con una elevada carga orgánica. Esta fracción acuosa se convertiría en un residuo altamente contaminante, pero puede ser aprovechada para recuperar compuestos de alto interés nutra- o cosmecéutico.

En este estudio se propuso realizar un proceso de valorización de las fracciones acuosas obtenidas en las etapas de i) descongelación, ii) prensado y iii) autohidrólisis del sólido prensado, de tal manera que, en una cascada de varias etapas respetuosas con el medio ambiente, se lograse un aprovechamiento escalonado del alginato, y de las fracciones fenólicas y de polisacáridos.

Para ello, a partir del alga descongelada se obtuvieron tres corrientes acuosas: el líquido procedente del alga al ser descongelada (LD), que se separó naturalmente durante el proceso de descongelación sin realizar ningún tratamiento; el líquido resultante del prensar el alga (LP) y la fase líquida obtenida tras someter el sólido residual del prensado a extracción con agua caliente presurizada en condiciones subcríticas a 220 °C (autohidrólisis) y posterior filtrado a vacío (LAHAP). Como control para contrastar los resultados, se preparó el licor de autohidrólisis del alga después de ser descongelada en las mismas condiciones que la anterior (LAH).

Todas las corrientes se analizaron en cuanto a contenido fenólico y en polisacáridos, poder reductor, propiedades antirradicalarias y capacidad citotóxica in vitro frente a células de líneas tumorales.

En un siguiente paso, se separó el alginato mediante precipitación con cloruro cálcico. Para separar la fracción fenólica se propuso la extracción líquido-líquido con acetato de etilo. El valor más elevado de contenido fenólico se alcanzó en la corriente concentrada con acetato de etilo obtenida a partir de la fase separada mediante prensado (55 g eq. floroglucinol/100 g). Un gramo de este extracto presentó una capacidad de captación del radical ABTS equivalente a 0,5 g de Trolox. La mayor actividad citotóxica se observó frente a células tumorales de carcinoma de colon HCT-116, y correspondió al extracto acuoso obtenido mediante autohidrólisis a partir del alga entera, que no mostró toxicidad en células normales.

Este proceso multietapa configura una alternativa simple y prometedora para valorizar los distintos componentes del alga.

4.1.2. Estado de la cuestión

Dado que no es fácil erradicar el alga Sargassum muticum de los ecosistemas donde ha conseguido instalarse como alga invasora, cada vez cobra más fuerza la idea de la valorización de la biomasa extraída periódicamente como método de control de su expansión y crecimiento (Balboa y col., 2016). Los procesos de autohidrólisis o procesamiento con agua caliente presurizada permiten un elevado grado de solubilización del alga (González-López y col. 2012; Balboa y col., 2013 b) y la obtención de fracciones solubles ricas en compuestos fenólicos y de fucoidanos.

Puesto que esta alga invasora alcanza tamaños y volúmenes de biomasa sensiblemente superiores durante los meses de verano (Incera y col., 2010), en ese periodo se plantea su recogida y posterior congelación para permitir su aprovechamiento escalonado sin afectar el contenido en componentes fenólicos y su actividad antioxidante (Balboa y col., 2016). Durante la etapa de descongelación, se separa el líquido que se desprende de las paredes del alga que podría aprovecharse para i) concentrar los componentes de interés y, de esta manera, ii) evitar el impacto ambiental que podría causar su eliminación sin tratamiento.

Los compuestos desprendidos presentes en la fase líquida de descongelación pueden proceder de la pared celular, o bien de las cepas bacterianas que colonizan la superficie del alga y que pueden ser responsables de la protección frente a la agresión de agentes externos. Villarreal-Gómez y col. (2010) encontraron efectos citotóxicos frente a células de carcinoma de colon HCT-116, con valores de CI50 entre 2,8 y 6,5 µg/mL en fracciones obtenidas a partir de un extracto producido a partir de algas que se habían lavado superficialmente con agua fresca. Estos autores sugirieron que los compuestos antifúgicos, antivirales y antibacterianos sintetizados por el alga podrían ser en realidad producidos por las bacterias que habitan en su superficie.

El prensado de las algas frescas (generalmente pardas o rojas) es un proceso frecuente para la producción de un escurrido con excelentes propiedades fertilizantes. El proceso consta únicamente de prensado y/o filtración, aunque opcionalmente puede realizarse además una etapa de molienda de la materia prima previa a su prensado. Este escurrido puede emplearse repartido sobre las hojas para sustituir a los fertilizantes minerales mejorando el rendimiento y calidad de diversas cosechas. Su eficacia se debe a la presencia de nutrientes, aminoácidos, vitaminas y reguladores del crecimiento de las plantas (Prasad y col., 2010; Ghosh y col., 2015; Singh y col., 2016; Pramanick y col., 2017).

4.1.3. Objetivo

En este estudio se pretende desarrollar y caracterizar un nuevo esquema de procesamiento para la separación de las diferentes fases acuosas del alga Sargassum

muticum.

Para este fin se han propuesto métodos mecánicos y procesamiento con agua caliente presurizada (autohidrólisis) en un proceso multietapa en cascada. No existen referencias en la bibliografía de que en estudios previos se haya aplicado el proceso de prensado de S. muticum o el proceso de autohidrólisis a la fracción sólida escurrida de la misma.

4.1.4. Materiales y metodología

4.1.4.1. Materiales de partida y reactivos

El alga Sargassum muticum usada en el estudio fue recolectada en la playa Mourisca, situada en la provincia de Pontevedra, España, durante el verano de 2016. Se procuró que las muestras recogidas estuviesen lo más limpias posible, y se reservaron en el congelador hasta su uso.

Para la precipitación de alginato se utilizó CaCl2 al 1 % (CaCl2 · 2H2O, Acros Organics, Bélgica). En la extracción líquido-líquido se utilizó acetato de etilo (Fisher Chemical, Loughborough, Leic, Reino Unido).

4.1.4.2. Metodología

Descongelado y prensado

El descongelado se produjo a temperatura ambiente, el líquido de descongelado (LD) se separó y se usó en los experimentos posteriores. Los sólidos descongelados se escurrieron a 2 MPa con una prensa hidráulica manual (Enerpac RC106, Wisconsin, EEUU) y la fase líquida separada (LP) se recogió y se almacenó en botes tipo duquesa en refrigeración hasta su uso.

Autohidrólisis

Para la autohidrólisis, los sólidos separados en el proceso de prensado o torta de prensado se pusieron en contacto con agua en una proporción 1:30 (p:p). La suspensión se calentó hasta llegar a una temperatura final de 220 °C en un reactor a presión (Parr Instruments series 4848, EEUU), con una capacidad de 3,7 L. Después de alcanzar la temperatura máxima, rápidamente se disminuyó la temperatura para enfriar. Una vez el reactor alcanzó la temperatura ambiente, la suspensión se filtró a vacío. Se repitió el mismo procedimiento con la muestra control, que fue el alga entera descongelada.

Precipitación del alginato

La precipitación de alginato se llevó a cabo mediante la adición de CaCl2 al 1 % a las cuatro fases acuosas presentadas (licor de descongelado, licor de prensado y licor de

autohidrólisis del sólido prensado y del alga entera), en una centrífuga durante 10 min (Rotixa 50RS, Hettich Zentrifugen, Alemania). El alginato fue separado de la fase

líquida y se secó en estufa (Selecta, España) a 30 °C. El líquido se reservó en refrigeración hasta su uso.

Extracción líquido-líquido

Se propuso una extracción líquido-líquido con acetato de etilo en una proporción acetato de etilo:fase acuosa sin alginato (LDP y LPP) en un ratio 3:1 (v:v). La mezcla mantuvo en agitación constante en un agitador orbital (Innova 4000, New Brunswick Scientific Co., EEUU), a 170 rpm y a temperatura ambiente durante 24 h. A continuación, se transfirió a un embudo de decantación para la separación de la fase orgánica y la fase acuosa por gravedad.

Métodos de análisis

En las muestras obtenidas se analizó el contenido en compuestos fenólicos totales por el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu, como se describe en el apartado 3.2.4.4. Los resultados se expresaron como equivalentes en floroglucinol.

El contenido en mono- y oligosacáridos se determinó por cromatografía líquida, según se describe en los apartados 3.2.4.2 y 3.2.4.3.

La actividad antioxidante se determinó como poder reductor del Fe(III), que se describe en el apartado 3.2.4.5, y como capacidad de captación del radical α,α-difenil-β

-picrilhidrazilo (DFPH) y del radical catión (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6- sulfónico) (ABTS).

Las características viscoelásticas de los alginatos se determinaron con un reómetro de esfuerzo controlado (RheoStress 600, Haake, Alemania) según se describe en el apartado 3.2.4.6.

La citotoxicidad frente a determinadas líneas tumorales, adenocarcinoma de pulmón (A549), carcinoma de colon (HCT-116), adenocarcinoma pancreático (PSN1), y glioblastoma (T98G) se evaluaron tal como se describe en el apartado 3.2.4.7.

4.1.5. Resultados y discusión

4.1.5.1. Rendimiento del proceso multietapa de valorización de Sargassum muticum

La Figura 17 muestra el esquema general del proceso multietapa general propuesto para el aprovechamiento del alga Sargassum muticum. Los datos presentados se refieren a 65 g de alga fresca.

Figura 17. Diagrama de flujo de las primeras etapas de separación por descongelación y por prensado de las fracciones acuosas de Sargassum muticum.

Descongelado

Para el líquido de descongelado (LD), la Figura 18 muestra los siguientes pasos del proceso. En este caso se hizo una precipitación del alginato con cloruro cálcico y una extracción líquido-líquido con acetato de etilo. La Tabla 2 resume los valores de contenido seco, contenido fenólico, poder reductor y capacidad de captación del radical DFPH.

Figura 18. Diagrama de flujo del líquido de descongelado.

El rendimiento de la fase líquida que se separó del alga después de ser descongelada fue de 13 % con respecto al peso del alga inicial (b.s.). Esta muestra contenía 3,47 g de floroglucinol equivalente por cada 100 g (b.s.). A pesar de ser un valor bajo, y

Sargassum muticum

65 g

Líquido de descongelado (LD) 8,52 g Sólido que se sometió a

prensado Líquido prensado (LP) 7,9 g Sólido se sometió a autohidrólisis 48,1 g Líquido de descongelado (LD) Precipitación con cloruro cálcico y centrifugación Sólido: Alginato cálcico 0,32 g Líquido de descongelado sin alginato (LDP) Extracción líquido-líquido con acetato de etilo Fase orgánica (LDPO) 0,01 g Fase acuosa (LDPA) 0,31 g

considerando que el proceso ensayado en nuestro estudio no requiere de disolventes tóxicos, se encuentra en el intervalo de los encontrados en otros extractos de este alga recogida en la misma costa (Montero y col., 2016), y también se ha planteado con otros residuos industriales, como el licor escurrido por prensado del bagazo de uva (Cruz y col., 2004). Las propiedades antioxidantes para la fase líquida de descongelado fueron limitadas. El poder reductor resultó ser débil, 0,83 g eq. ácido ascórbico/100 g; la capacidad antirradicalaria frente al radical catión ABTS fue equivalente a 2 mM Trolox/100 g, y también fue bajo el valor del porcentaje de inhibición frente a DFPH (34 %).

Después de precipitar con CaCl2, el contenido seco fue muy similar al anterior, representando el 8,7 % del alga inicial. El contenido en compuestos fenólicos se redujo de 3,47 a 2,75 g equivalentes en floroglucinol por cada 100 g de extracto. La captación de radicales libres, al igual que en el extracto de la fracción descongelada, fue limitada. De modo análogo el poder reductor fue ligeramente más débil, 0,75 g de ácido ascórbico/100 g; la capacidad antiradicalaria frente a ABTS fue equivalente a 2 mM Trolox/100 g; y se mantuvo en un valor bajo el poder de inhibición frente a DFPH, con un porcentaje de inhibición del 48 %.

Tabla 2. Contenido seco, contenido fenólico, poder reductor y propiedades antirradicalarias de los líquidos de descongelado y de prensado, y de sus correspondientes corrientes después de la precipitación de alginato y de la extracción líquido-líquido con acetato de etilo. Contenido seco (g/100 mL) Contenido fenólico (g eq. PG/100 g extracto) Poder reductor (g AA/100 g extracto) TEAC (mol Trolox/ 100 g extracto) Captación de DFPH (% inhibición) LD 8,36 3,47 0,83 0,002 33,67 LDP 8,92 2,75 0,75 0,002 47,79 LDPA 9,32 2,1 0,42 0,002 48,55 LDPO 0,02 8,39 29,48 0,446 28,66 LP 7,44 2,47 0,67 0,003 54,68 LPP 8,32 2,17 0,60 0,003 55,44 LPPA 9,21 1,57 0,28 0,002 27,72 LPPO 0,02 55,63 23,90 0,479 21,68

La realización posterior de una etapa de purificación con acetato de etilo permitió recuperar menos del 1 % de los compuestos solubles totales. El contenido en fenoles de ese extracto ascendió a 8,4 gfloroglucinol/100 g extracto. A pesar del enriquecimiento logrado, este es un valor más bajo de lo esperado y podría deberse a que la corriente de descongelado contiene mayoritariamente compuestos con alto peso molecular o poliméricos. Los compuestos fenólicos de estas características no son solubles en la fracción de acetato de etilo, que sí podría solubilizar fenoles monoméricos y flavonoides, y la fase acuosa restante se espera que aún contenga los polifenoles poliméricos insolubles en acetato de etilo (Pinelo y col., 2006).

La fase acuosa tras la extracción con acetato de etilo mostró mayor actividad reductora y de captación del radical ABTS, pero menor potencia frente al radical DFPH. El valor de contenido fenólico encontrado en la fracción extraíble en este disolvente encaja en el intervalo de valores encontrado por otros autores empleando disolventes orgánicos (Tanniou y col., 2014). Otros investigadores observaron que la mayoría de los compuestos fenólicos extraídos con metanol a partir de Ascophyllum nodosum, separados y purificados por extracción líquido-líquido con acetato de etilo, ultrafiltración tangencial y diálisis, presentaron un peso molecular mayor de 50 kDa, y se comportaron como potentes agentes antirradicalarios (Audibert y col., 2010).

Prensado

Para el líquido de prensado, la Figura 19 muestra los pasos que se siguieron en el proceso. En este caso también se hizo una precipitación del alginato con cloruro cálcico y una extracción líquido-líquido con acetato de etilo.

Figura 19. Diagrama de flujo del proceso realizado al líquido de prensado, procedente de una cantidad de alga de partida equivalentes a 65 g de materia fresca.

Líquido de prensado (LP) Precipitación con cloruro cálcico y centrifugación Sólido: Alginato cálcico (1,10 g) Líquido de descongelado sin alginato (LPP) Extracción líquido-líquido con acetato de etilo Fase orgánica (LPPO), 0,02 g Fase acuosa (LPPA)

Para los líquidos de prensado, tras la posterior extracción con acetato de etilo, el rendimiento de la fase orgánica fue del orden de 400 veces inferior al rendimiento de la fase acuosa. El contenido en fenoles se redujo de 2,47 a 2,17 g eq. floroglucinol/100 g, de modo similar a la tendencia encontrada con los líquidos de descongelado. Esto se debe a que parte de los compuestos fenólicos pudieron pasar a la fase orgánica durante la extracción con acetato de etilo.

La etapa de prensado separa la fase líquida que normalmente es utilizada por su contenido en compuestos con valor fertilizante, así como factores de crecimiento y vitaminas. Dado que se empleó el alga entera y sin haberle realizado tratamientos térmicos previos, el rendimiento volumétrico del prensado fue solo ligeramente superior al de la anterior etapa, la de descongelado. Tampoco se observaron valores muy diferentes en las propiedades antioxidantes y en la proporción soluble en acetato de etilo.

Al prensar 65 g de alga, el líquido desprendido contenía cerca de 8 g de sólidos, representando un 12 % de rendimiento y el producto secado contenía 2,5 % fenoles y las propiedades antioxidantes fueron comparables a las encontradas en el líquido de descongelado. El poder reductor resultó más débil, 0,67 g eq. de ácido ascórbico/100 g; la capacidad antirradicalaria frente a ABTS fue equivalente a 3 mM Trolox eq. /100 g, y el valor de la capacidad de captación del radical DFPH fue ligeramente mayor (55 %) al de los licores de descongelado. Después de extraerle el alginato, las propiedades fueron similares a los valores del líquido de descongelado.

El líquido de prensado libre de alginato, se extrajo con acetato de etilo; una vez separada y secada, la fase orgánica contenía un 56 % en fenoles y 1 g de este producto presentó un poder reductor de 0,24 g de equivalentes de ácido ascórbico y una captación del radical ABTS equivalente a casi 5 mM de Trolox. Sin embargo, como el rendimiento con acetato de etilo fue bajo, los estudios posteriores de citotoxicidad solo se aplicaron a la fracción acuosa.

Autohidrólisis

Para el sólido del alga entera y para el procedente del alga después de ser prensada, las Figuras 20 y 21 muestran los pasos que se continuaron haciendo en el proceso y en

antioxidantes de las fracciones procedentes de extracción con agua en condiciones subcríticas (autohidrólisis) y precipitación de alginato con cloruro cálcico.

Figura 20. Diagrama de flujo del sólido del alga entera sometida a una extracción por autohidrólisis a 220 °C, procedentes de una cantidad de alga de partida equivalentes a 65 g de materia fresca.

Figura 21. Diagrama de flujo del sólido del alga prensada sometida a una extracción por autohidrólisis a 220 °C, procedentes de una cantidad de alga de partida equivalentes a 65 g de materia fresca.

Tabla 3. Contenido seco, contenido fenólico, poder reductor y propiedades antirradicalarias de los licores de autohidrólisis, y sus correspondientes corrientes después de realizar la precipitación del alginato y la extracción líquido-líquido con acetato de etilo.

Contenido seco (g/100 mL) Contenido fenólico (g eq. PG/100 g extracto) TEAC (mol Trolox/100 g extracto) Poder reductor (g AA/ 100 g extracto) Captación de DFPH (% Inhibición) LAHAP 1,01 12,10 4,33 0,20 84,09 LAHAPP 2,13 5,36 1,91 0,10 83,73 LAH 1,29 8,65 3,24 0,20 84,86 LAHP 2,45 4,17 1,48 0,10 83,63

LAHAP: licor de autohidrólisis de alga prensada, LAHAPP: licor de autohidrólisis de alga prensada sin alginato, LAH: licor de autohidrólisis de alga entera, LAHP: licor de autohidrólisis de alga entera sin alginato

Sólido se sometió a autohidrólisis

(220 °C)

Sólido (37 g)

Líquido (LAH) Precipitación con cloruro cálcico y centrifugación Sólido: Alginato (0,015 g) Líquido (LAHP) Sólido que se sometió a autohidrólisis (220 °C) Sólido (45,2 g)

Líquido (LAHAP) Precipitación con cloruro cálcico y centrifugación

Sólido: Alginato (0,005 g) Líquido (LAHAPP)

4.1.5.2. Características reológicas de los alginatos

En la Figura 22 se muestran las características viscosas y viscoelásticas, determinadas a 25 °C, del alginato precipitado a partir de los líquidos de descongelado (LD) y de prensado (LP) obtenidos a partir de S. muticum. Estos biopolímeros extraídos en ambas etapas muestran un comportamiento newtoniano a bajos valores de esfuerzo cortante. En la región de adelgazamiento por cizalladura por encima de 10 s-1 _{se observó reducción} de la viscosidad. En ninguna de las muestras estudiadas se apreció comportamiento de histéresis. Para el mismo valor de esfuerzo cortante, la viscosidad aparente se incrementó para el alginato obtenido como fase LDP. Este comportamiento podría sugerir que la extracción mecánica por prensado favorecería la liberación de diversos tipos de alginatos con distinto peso molecular. Los módulos elástico y viscoso corroboran esta hipótesis, mostrando valores menores para los alginatos precipitados del líquido de descongelado (LD).

El cálculo del módulo de almacenamiento y del módulo de pérdida se realizó según las ecuaciones 11 y 12. El cociente entre el esfuerzo y la correspondiente deformación elástica, presenta una parte real se denomina módulo de almacenamiento y otra imaginaria o módulo de pérdida.

𝑀𝑀ó𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑎𝑎𝑑𝑑𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑑𝑑𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑑𝑑𝑎𝑎𝑡𝑡𝑑𝑑: 𝐺𝐺′₌ 𝜎𝜎0

𝜀𝜀0cos 𝛿𝛿 [ec. 11]

𝑀𝑀ó𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑝𝑝é𝑟𝑟𝑑𝑑𝑎𝑎𝑑𝑑𝑎𝑎: 𝐺𝐺′′ ₌𝜎𝜎0

Figura 22. Características viscosas (arriba) y viscoelásticas (abajo) de disoluciones acuosas de alginato (2,0 g/L) precipitado a partir de los líquidos de descongelado (DL) de S. muticum (cuadrados) y de los líquidos de prensado, DLP (rombos) a 25 °C. En la representación inferior los símbolos oscuros representan el módulo de almacenamiento o elástico y los claros el módulo viscoso o de pérdidas.

0,01 0,1 1 1 10 100 Vi sc os ida d apa re nt e (P a s) Velocidad de cizalla (s-1₎ 0,001 0,01 0,1 1 10 0,1 1 10 M ód ul o vi sc os o y m ód ul o el ás tic o ( Pa) Frecuencia (Hz)

En todos los casos, ambos módulos se incrementaron con el aumento de la frecuencia. El módulo de almacenamiento o elástico (G’) mostró una dependencia con la frecuencia de aproximadamente de unos 3 órdenes de magnitud, mientras que el módulo viscoso o de pérdida (G’’) mostró una dependencia de unos 2 órdenes de magnitud.

En los alginatos analizados se comprobó el comportamiento viscoelástico típico de las disoluciones de este biopolímero en el régimen semi-diluido que presenta interacciones entre las moléculas (Torres y col., 2013). La viscosidad aparente y los módulos de almacenamiento y viscoso mostraron valores menores (aproximadamente la mitad) que los encontrados en disoluciones de alginato sódico comercial (Imeson y col., 2010). Sin embargo, estos valores fueron similares a los obtenidos por otros autores para disoluciones de alginato (Garrett y col., 2017; Gómez-Ordoñez y col., 2010) preparadas con un contenido biopolimérico similar.

4.1.5.3. Efecto de la etapa de autohidrólisis sobre los polisacáridos