Capítulo 3: MATERIALES Y MÉTODOS
3.2. MÉTODOS
3.2.4. Métodos analíticos
3.2.4.1. Humedad
Para la determinación de la humedad se emplearon pocillos de cristal previamente secos y tarados, en los que se añadió una cantidad conocida de muestra. Después de 24
h en la estufa a 105 °C, y una vez alcanzado el peso contante, se dejaron enfriar hasta temperatura ambiente. Por diferencia de peso se calculó el contenido en humedad.
3.2.4.2. Monosacáridos
Para analizar xilosa, manosa y galactosa es necesario neutralizar las muestras con carbonato de bario. Se empleó un equipo de HPLC Agilent Hewlett-Packard serie 1100, acoplado a un detector de índice de refracción (IR), operando a 35 °C y con una columna CARBOsep CHO 682 (Transgenomic, Glasgow, UK) de 300 × 7,8 mm, a 80 °C, con agua destilada como fase móvil a un flujo de 0,4 mL/min.
Para analizar glucosa, ramnosa y fucosa se utilizó un equipo HPLC Agilent Hewlett- Packard serie 1100 acoplado a un detector de índice de refracción con una columna Aminex HPX-87H (BioRad, Hercules, CA) de 300 × 7,8 mm, a 60 °C, con una disolución de H2SO4 de 0,003 M como fase móvil a un flujo de 0,6 mL/min.
Se emplearon patrones de Sigma de todos los monosacáridos de interés, preparados a concentración conocida, y se sometieron al mismo tratamiento que se realizó para las muestras previamente a la cuantificación por HPLC.
3.2.4.3. Oligosacáridos
Debido a la composición compleja de los oligosacáridos no resulta posible su cuantificación directa mediante la técnica de HPLC empleada para monómeros. Por eso, la concentración de oligómeros en las muestras se calculó de modo indirecto, a partir del aumento en la concentración de monómeros derivada de la realización de una hidrólisis ácida cuantitativa. Todas las muestras se neutralizaron y se filtraron con membranas de acetato de celulosa de 0,45 µm antes de proceder al análisis por HPLC.
Hidrólisis ácida cuantitativa
Con el fin de cuantificar los oligosacáridos presentes en las muestras, se realizó una hidrólisis ácida cuantitativa. Previamente, se desalinizaron las muestras, empleando membranas de diálisis Spectra/Por® Float-A-Lyzer G2 (SpectrumLabs, EEUU).
El procedimiento experimental que se llevó a cabo fue el siguiente: en un frasco roscado Pyrex de 100 mL, cuyo peso con tapa incluida se había determinado previamente, se pesó una alícuota de muestra de aproximadamente 5 g. Con la ayuda de una pipeta, se añadió H2SO4 hasta alcanzar una concentración del 4 % (p/v). Se
cerraron los frascos y se agitaron para lograr una completa homogeneización. A continuación, se introdujeron en la autoclave de sobremesa modelo MED12 (Grupo
Selecta, España) y se realizó un tratamiento de hidrólisis durante 20 min a 121 °C. Transcurrido este tiempo, y después de la despresurización de la autoclave, se retiraron los frascos y se dejaron enfriar en un baño de agua a temperatura ambiente. Una vez aclimatados, se secaron y se pesaron para determinar la existencia de posibles pérdidas por evaporación durante el tratamiento, que podrían dar lugar a una concentración de la muestra.
El análisis de las muestras tras la posthidrólisis se realizó del mismo modo que para los monosácaridos. La concentración de oligosacáridos (en gramos equivalente de monómeros/L) se obtiene según la ecuación 8.
[𝐴𝐴𝐴𝐴] = [𝐴𝐴]𝑝𝑝 − [𝐴𝐴] [ec. 8]
donde:
[AO] es la concentración de la especie A en los oligosacáridos (g equivalente en monómeros A/g extracto); [A]p es la concentración del monómero A tras la posthidrólisis (g monómero A/g extracto); [A] es la concentración inicial del monómero A en la fase liquida (g monómero iniciales A/g extracto).
3.2.4.4. Contenido en florotaninos totales
Se determinó colorimétricamente usando el reactivo de Folin-Ciocalteu (Sigma- Aldrich) y se expresó como equivalentes de floroglucinol (Sigma-Aldrich). Todos los análisis se realizaron al menos por triplicado y se presentan en base de materia seca.
El reactivo de Folin-Ciocalteu se mezcló con agua en proporción 1:1 (v:v). Tres minutos después se añadieron 400 mL de Na2CO3 al 20 % (p/v) y se homogeneizó. Tras 45 min de incubación a temperatura ambiente en oscuridad, se midió la absorbancia a 730 nm frente a un blanco de agua destilada.
El contenido total en florotaninos se calculó a partir de la recta de calibrado para floroglucinol (Figura 13).
Figura 13. Recta de calibrado del contenido en floroglucinol. 3.2.4.5. Actividad antioxidante
Se seleccionaron tres métodos para la determinación de la actividad antioxidante, dos basados en la captación de radicales libres y otro basado en la medida del poder reductor.
Captación del radical DFPH
La actividad antioxidante de captación del radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DFPH), uno de los ensayos más universalmente empleados y más sencillos, se determinó por el método descrito por von Gadow y col. (1997). A 2 mL de una disolución 6·10-5 M de DFPH en metanol, se añadieron 0,05 mL de los extractos re suspendidos en metanol, y se midió la caída de absorbancia a 515 nm tras 16 min. La actividad antioxidante se calculó como el Porcentaje de Inhibición (PI) según la ecuación 9.
100 · ) (t Abs ) (t Abs - ) (t Abs (%) PI 0 16 0 = [ec. 9]
Para el cálculo de la CE50 (concentración de extracto que causa una inhibición al 50 % del radical DFPH) se dispone de los valores de Porcentaje de Inhibición (PI) para diferentes concentraciones del extracto en metanol. En la Figura 14 se muestra la correspondencia lineal entre la concentración de extracto de los licores de líquido de lavado en metanol y el porcentaje de inhibición del radical DFPH que proporcionan.
y = 26,913x - 0,022 R² = 0,9965 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0,035 0,040 Abs or ba nc ia Concentración de floroglucinol (mg/mL)
Figura 14. Efecto de la concentración de ácido gálico sobre el porcentaje de inhibición, PI, para el cálculo del valor de CE50.
Determinación del valor de TEAC (Actividad Antioxidante Equivalente a Trolox,
Trolox Equivalent Antioxidant Activity)
La actividad antioxidante equivalente a Trolox se determinó según el método descrito por Miller y Rice-Evans (1995). El radical catión ABTS (2,2'-azinobis (3-etil- benzotiazolina-6-sulfonato), ABTS•+) se produjo por la reacción de una disolución madre de ABTS 7 mM (Sigma Aldrich) con una disolución de persulfato potásico 2,45 mM. Se empleó el tampón salino fosfato (Phosphate buffer saline, PBS pH 7,4) que se preparó mezclando 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KH2PO4, 1,15 g de Na2HPO4, 0,2 g de KCl y 0,2 g de azida sódica en un volumen de agua de 1 L. La disolución de ABTS•+ se diluyó con PBS hasta una absorbancia de 0,70 a 734 nm, se equilibró a 30 °C, y se mantuvo en agitación constante durante 16 h en oscuridad. La determinación de actividad se realizó a 30 °C, midiendo la absorbancia a 734 nm después de 6 min. Para ello, se diluyó previamente el reactivo hasta que presentó un valor de absorbancia de 0,7. Posteriormente, se añadieron 20 µL de muestra a 2 mL de reactivo diluido, midiendo la absorbancia a los tiempos citados. Se realizó siempre un blanco (con el medio en que está diluida la muestra). La actividad se calculó como una función de la concentración de los extractos y de Trolox, y se expresó como TEAC (capacidad antioxidante equivalente Trolox) (Figura 15).
La recta patrón se preparó con Trolox (Fluka), que es un derivado hidrosoluble de la vitamina E. El valor de TEAC se calcula a partir de la ecuación 10.
y = 268021x + 3,5608 R² = 0,9891 0 20 40 60 80 100 0,0000 0,0001 0,0001 0,0002 0,0002 0,0003 0,0003 Po rc ent aj e de inhi bi ció n, P I ( % )
(
)
(
Abs - Abs 1)
Abs - Abs C TEAC reactivo muestra 10 t reactivo 1 C ∆ ∆ ∆ ∆ = = [ec. 10] donde:TEAC se expresa en mM de Trolox; C1 es la concentración de Trolox; Δabs reactivo es la diferencia de absorbancia a tiempo 0 y 10 min en el reactivo; Δabs es la diferencia de absorbancia a tiempo 0 y 10 mins en la muestra; ΔabsC1 es la diferencia en la muestra inicial sin reactivo.
Figura 15. Recta de calibrado para la inhibición de ABTS, determinada como TEAC.
Poder antioxidante de reducción del hierro o FRAP (Ferric Reducing Antioxidant
Power)
La actividad antioxidante se determinó por el método descrito por Benzie y Strain (1996). El reactivo se prepara con 25 mL de tampón acetato 300 mM (pH 3,6), 2,5 mL de una disolución de TPTZ (2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-triazina) 10 mM en HCl de concentración 40 mM y 2,5 mL de FeCl3·6 H2O a 20 mM en agua destilada. El reactivo se prepara en el momento del análisis.
A 3 mL del reactivo FRAP se añaden 0,1 mL de la muestra. Se determina la actividad a temperatura ambiente y se mide la absorbancia a 593 nm a los 6 min de incubación, frente a un blanco con agua destilada. La recta patrón (Figura 16) se realizó con diversas diluciones de una disolución patrón de ácido ascórbico 1 mM (Merck).
El blanco se prepara con 25 mL de tampón acético-acetato de 300 mmol/L (pH 3,6),
y = 1,0165x + 0,0008 R² = 0,9997 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 Abs or ba nc ia
HCl y 20 mmol/L FeCl3 · 6 H2O en agua destilada. Las muestras se mezclan con 3 mL del reactivo, y la absorbancia se monitoriza a 593 nm y se comparan con la de disoluciones acuosas estándar de ácido ascórbico (Figura 16).
Figura 16. Recta de calibrado para la determinación del poder antioxidante de reducción del hierro, FRAP.
3.2.4.6. Medidas reológicas
Se prepararon suspensiones acuosas del alginato extraído a partir del líquido de prensado y del líquido de descongelado de Sargassum muticum y posteriormente separados por precipitación con CaCl2 (1 % p/p). Se empleó una concentración de biopolímero de 2 g/L, habitualmente empleada para este tipo de determinaciones (Torres y col., 2014). Utilizando un reómetro de esfuerzo controlado se definieron las características viscoelásticas (RheoStress 600, Alemania) con una geometría de placa cónica (35 mm de diámetro, ángulo de 2°) operando a 25 °C. Se realizaron curvas de flujo en estado estacionario de disoluciones acuosas de alginato a diferentes velocidades de cizallamiento (1-100 s−1). Los barridos de frecuencia "frequency sweeps" de las muestras citadas anteriormente se lograron en situaciones de viscoelasticidad lineal (1,5 Pa, 0.1-10 Hz).
3.2.4.7. Citotoxicidad
La citotoxicidad de diferentes muestras se determinó frente a cuatro líneas celulares tumorales humanas: adenocarcinoma epitelial de pulmón (A549), carcinoma de colon
y = 1,2865x + 0,0391 R² = 0,9978 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 Abs or ba nc ia
(HCT-116), adenocarcinoma de páncreas (PSN1), células de glioblastoma caucasiano (T98G), proporcionadas por la CECC (Colección Europea de Cultivos Celulares).
El medio empleado para su crecimiento fue RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) (Sigma-EEUU), al que para el cultivo de las líneas A549 y HCT-116 se le añadió un suplemento con 5 % de FBS (Suero fetal bovino, Sigma España), 1 % L-glutamina (LG, Sigma, EEUU) y 1 % penicilina/estreptomicina (P/S, Hyclone, Thermo Scientific, Reino Unido). Para el cultivo de las células PSN1 se suplementó con 10 % FBS, 1 % LG y 1 % P/S; y para el crecimiento de las células de la línea T98G se añadió un 10 % de FBS, un 1 % LG, 1 % P/S, 1 % piruvato sódico y 1 % de una disolución de aminoácidos.
Los extractos liofilizados (5 mg) se disolvieron en MeOH:DMSO (9:1, v:v) para preparar disoluciones de concentraciones en el intervalo 25-500 µg/mL. La incubación duró 48 h a 37 °C en pocillos de 3 x 104 células/mL, en una atmósfera de 5 % CO2.
El control positivo fue estaurosporina (Colección Biomar, AQUAe, León, Spain) y el blanco fue el medio específico sin las células. La viabilidad celular se calculó a partir del ensayo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difenil-tetrazol), descrito previamente (Casas y col., 2016). El valor CI50 se calculó como la concentración del extracto que inhibe el 50 % del crecimiento celular, en relación con el valor máximo de crecimiento obtenido con las células no tratadas.