Métodos de fraccionamiento

3.2.3.1. Fraccionamiento con gel en columna abierta

Empaquetado de la columna (gel Sephadex)

Se utilizó una columna de vidrio cromatográfica (800 mm, Ø 40 mm) (Figura 11). Para ello, se preparó una suspensión de gel Sephadex LH-20 en metanol 25:75 (v:v), que se utilizó para empaquetar la columna. Este proceso se realizó de forma rápida para evitar la formación de burbujas de aire. A continuación, se hizo pasar disolvente durante 24 h para compactar el relleno con el grado de compactación deseado.

Figura 11. Cromatografía en columna abierta. En la parte de superior de la columna se puede ver el extracto. A su vez, en la parte superior de la columna se ha acoplado un reservorio de 500 mL para la fase móvil.

Fraccionamiento (gel Sephadex)

La fracción de tamaño molecular < 1 kDa del licor de autohidrólis, una vez liofilizada, se disolvió en un pequeño volumen de metanol y se añadió sobre el gel de la parte superior de la columna. A la columna se le hizo pasar una corriente de metanol con un

flujo de 1 mL/min. Las fracciones eluidas se recogieron cada 40 minutos en erlenmeyers y se concentraron en rotavapor para aumentar la concentración de compuestos.

Cromatografía en capa fina (CCF)

A cada fracción recogida según se indica anteriormente, se le hizo el estudio por cromatografía en capa fina (CCF o TLC) con el fin de agrupar las fracciones que presentaban las mismas características. Se utilizaron placas de gel de sílice de tamaño 5 cm x 5 cm en las que se iba aplicando la muestra en la parte inferior, utilizando un capilar de 1 µL. La corriente móvil fue una secuencia de disolventes de progresivo aumento de polaridad, que se consiguió con mezclas de metanol:diclorometano en diferentes proporciones, de 1:9 a 3:1 (MeOH:DCM, v:v).

Agrupación de las fracciones

Una vez examinados los cromatogramas de CCF, se mezclaron las fracciones que presentaban los mismos compuestos. Para eliminar el exceso de disolvente de cada fracción, se empleó el rotavapor R-114 (Büchi, Suiza) y se operó a 35 °C, manteniendo la temperatura con un baño de agua, para evitar la degradación de compuestos termolábiles presentes en las fracciones.

Análisis de las fracciones

La fracción número 2 se sometió al mismo proceso que se aplicó para el tratamiento de la fracción de tamaño molecular < 1 kDa del licor de autohidrólis. La única diferencia de este nuevo proceso radicó en el porcentaje de disolventes utilizado como fase móvil, pues para esta fracción se usó una mezcla de MeOH:DCM (1:1, v:v). En los cromatogramas en capa fina, la corriente móvil fue una mezcla de MeOH:DCM en diferentes proporciones, desde 1:8 a 1:6 (v:v).

Fraccionamiento por HPLC

La fracción 2, una vez separada como anteriormente se mencionó y a la vista de los últimos espectros por RMN de las subfracciones obtenidas., se decidió separar por HPLC las subfracciones 3 y 5.

En el caso de la subfracción 3, el fraccionamiento se llevó a cabo en un equipo Agilent Tecnologies 1200 Infinity, acoplado a una precolumna y a una columna semipreparativa (Supelco Discovery® HS F5, de 25 cm x 10 mm y 5 µm). La muestra se disolvió en una

mezcla acetonitrilo:agua (1:3) (v:v) a una concentración de 5 mg/mL, y se inyectó en 8 alícuotas. El protocolo se realizó a un flujo de fase móvil de 1 mL/min, con un gradiente de agua (A)-acetonitrilo (B): tiempo inicial 20 % B, 45 min 60 % B. Una vez finalizado el fraccionamiento, se procedió a juntar las fracciones separadas según los tiempos de salida.

En el caso de la fracción 5, el equipo usado para el fraccionamiento fue un Hewlett- Packard 1050, acoplado a un espectrómetro de masas Hewlett-Packard 5989B, con Electrospray 59987ᵃ.

Elucidación de compuestos

A cada una de las subfracciones de la fracción seleccionada (fracción 3) se les hizo su espectro por resonancia magnética utilizando el espectrómetro de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) 300 MHz (Bruker - Avance 300, Billerica, Massachusetts, EEUU).

3.2.3.2. Adsorción-desorción en continuo Activación de la resina

Continuando con estudios anteriores del grupo (Casas y col., 2016) se emplearon tres tipos de resina para este estudio, Sepabeads SP700 y PuroSorb™ PAD910 y PAD950. Las resinas se activaron utilizando 2 volúmenes de metanol por volumen de resina. La suspensión se mantuvo en el agitador orbital Innova 4000 (New Brunswick Scientific Co., EEUU) durante 15 minutos a 25 °C y 175 rpm. Una vez terminado este tiempo, se lavó con 5 volúmenes de agua destilada antes de su uso.

Cinéticas de adsorción

Para calcular la capacidad de adsorción de las resinas para los compuestos fenólicos presentes en el licor de prensado se hicieron las cinéticas correspondientes utilizando las tres resinas, SP700, PAD910 y PAD950. Para ello se añadieron en frascos Erlenmeyer 10 mL de licor de prensado con diferentes cantidades de resina. Se sometieron a agitación durante una hora a 175 rpm y 25 °C. Se tomaron las muestras correspondientes a períodos intermedios y se filtraron para separar la fase líquida, que se analizó para conocer su contenido en florotaninos, expresados como equivalentes en

floroglucinol (Ct). La concentración de compuestos fenólicos adsorbidos en el tiempo t en una unidad de masa de resina (qt, mg/g) se calcula por la ecuación 7.

W V C C q 0 t t ) - ( = [ec. 7] donde C0 y Ct son las concentraciones de florotaninos en la disolución acuosa (mg/L) en el momento inicial y en el momento t, respectivamente, V es el volumen de disolución añadida en el matraz (L), y W es el peso de resina húmeda (g). Los experimentos se realizaron por triplicado.

Operación en columna

Empaquetado de las resinas en la columna

Se utilizó una columna de vidrio graduada de diámetro 1,3 cm y altura 41 cm para el estudio de la adsorción y desorción en operación semicontinua, operando con caudal continuo de alimentación. Se llenó con una cantidad conocida de resina SP700 y se compactó antes de la operación.

Adsorción-desorción

Un volumen conocido del licor de descongelado o del licor de prensado del alga se hizo pasar por la columna empaquetada. Una vez finalizada la adsorción, la columna se lavó con 5 volúmenes de agua destilada por volumen de lecho, para arrastrar los componentes no adsorbidos que pudieran quedar entre el relleno. Posteriormente, se bombeó etanol al 68 % como agente eluyente, para desorber los componentes adsorbidos en la columna. Cada fracción se caracterizó para conocer su contenido fenólico.

Estudio de la capacidad de adsorción en columna

El estudio de la capacidad de adsorción de la muestra del licor de prensado y del licor de descongelado se llevó a cabo con la resina Sepabeads SP700, acoplado al sistema Biologic DuoFlow TM _{de Bio Rad (Figura 12). Éste dispone de un detector Quadtec UV-} visible que permite la medida en línea de la absorbancia de la corriente de salida de la columna a diferentes longitudes de onda, y un colector de fracciones Biofrac, que permite la separación de las distintas fracciones. Los licores se almacenaron en una botella de vidrio de 500 mL. El montaje consistió en rellenar una columna de vidrio con

(1-3 mL/min) y se recolectaron fracciones eluidas de 2 mL, que se guardaron en tubos de ensayo. El seguimiento del proceso se hizo por lecturas de absorbancia para determinar el contenido fenólico.

Figura 12. Equipo (Biologic DuoFlowTM_{) utilizado en la adsorción en continuo. Está formado} por una estación de bombeo, un detector Quartec y un colector Biofrac. El software que controla el proceso es el Biologic Duo Flow de Bio Rad. Se puede ver el detalle de la columna de color marrón durante la operación.

La eficiencia de la adsorción de los compuestos fenólicos adsorbidos por la columna se determinó mediante la evaluación de las curvas de rotura obtenidas de la representación gráfica de la relación entre la concentración de la muestra en cada momento de recogida respecto al valor inicial (C/C0) frente al tiempo del proceso. El tiempo de rotura se determina cuando la relación C/C0 alcanza un valor del 10 %. El tiempo de saturación, también conocido como tiempo de agotamiento, se establece cuando la relación Ct/C0 alcanza un valor entre el 90-95 % del influente.