Asignación poblacional

La asignación de individuos a una población K específica, realizada utilizando el programa Structure, con el modelo “admixture”, infiere que cada individuo posee alguna fracción de su genoma en cada una de las K poblaciones, es decir que los genotipos pudieran haber estado mezclados ancestralmente por lo que cada individuo ha heredado alguna fracción del genoma de sus ancestros.

Este análisis mostró un aumento continuo de la bondad de ajuste para el estadístico Ln [P (D)], en comparación con el número de poblaciones K, es decir que, aunque hubo convergencia entre el número de iteraciones y el número posibles de K, no se logró establecer el número de poblaciones K después de la asignación probabilística. Por lo tanto, para determinar el K óptimo que representa la estructura poblacional de los genotipos de trigo tetraploide se utilizó la metodología ∆K (delta K) de Evanno et al., (2005) que permite un mejor ajuste para el valor K . Este test permitió determinar que ∆K presenta un punto de inflexión (máxima verosimilitud) en K = 6. Es decir, que existen seis subgrupos poblacionales. Es de esperar que exista una marcada estructura entre los genotipos provenientes de cruzamientos en poblaciones de mejoramiento. En este caso, la estructura

139 que presenta la población de 118 genotipos indica una diferenciación debido a que se incluyen líneas y variedades de mejoramiento argentinas y de diferentes orígenes geográficos. A la fecha los estudios de estructura poblacional en trigo han identificado subgrupos dentro de sus poblaciones de estudio (Macaferri et al., 2005, Somers et al. 2007, Reimer et al. 2008, Macaferri et al. 2010, Macaferri et al. 2011, Pozniak et al 2012, Vanzetti et al 2013, Macaferri et al. 2014), proponiendo el uso de estas poblaciones para metodologías de mejoramiento como el mapeo por asociación. Sin embargo, estas investigaciones fueron realizadas con marcadores codominantes, y colecciones de germoplasma diferentes por lo que el uso de este tipo de marcador AFLP dominante en el germoplasma analizado en esta tesis, quizá podría generar un número diferente de grupos a los obtenidos en otras investigaciones.

4.8 Desequilibrio de ligamiento

.

El DL se refiere a asociaciones no aleatorias entre los alelos de distintos loci y constituye la base conceptual de cualquier estudio de mapeo por asociación. La distancia sobre la cual el DL persiste va a determinar el número y la densidad de marcadores, así como el diseño experimental que se ajuste mejor para el mapeo por asociación. Debido a ello, es importante conocer en primera instancia el DL y determinar el alcance del mismo en el trigo candeal.

Las dos medidas comúnmente usadas para cuantificar DL son el coeficiente de desequilibrio estandarizado (D’) (Lewontin 1964) y la correlación de frecuencias alélicas al cuadrado (r2) (Hill y Weir 1994), siendo esta última la más empleada por presentar menor varianza en muestras pequeñas. Se considera un bloque en DL cuando todos los pares de loci adyacentes presentan un r2> 0,3 (Stich et al., 2005). Además de los valores de polimorfismo y de variabilidad alélica los resultados indicaron que los 116 marcadores polimórficos AFPL detectaron siete pares de loci en DL entre 6612 comparaciones.

Considerando el objetivo de mapeo asociativo, la manera mas apropiada de cuantificar el DL fue calculando el valor de r2, que también es un indicador de la correlación entre el marcador y el carácter (Gupta et al 2005, Oraguzie et al 2006, Abdallah, et al 2003). El valor de r2 varía entre 0 y 1 y es igual a 1 cuando solo dos haplotipos están presentes. r2 es

140 afectado por la taza de mutación y recombinación, mientras que D es afectado por el historial de mutaciones (Flint-García et al 2003l, Gupta et al 2005, Oraguzie, et al 2006, Gaut et al 2003). La mutación y la recombinación son los fenómenos que tienen mayor impacto. La mutación genera el material de partida para la creación de sitios polimórficos que estarán en DL. En cambio, la recombinación es el principal factor que provoca una disminución del DL intra-cromosómico, y la segregación independiente disminuye el DL inter-cromosómico (Flint-Garcia et al., 2003). El sistema de apareamiento también determina los niveles de DL, por ejemplo, en especies de reproducción autógama o de auto- polinización el DL tiende a ser mayor que en especies de polinización cruzada (Flint-Garcia et al., 2003).

La representación gráfica del DL de a pares entre dos loci fue muy útil para estimar los patrones de DL a partir de las combinaciones de AFLP. El DL se representó de a pares en una parcela triangular con un código de color basado en el nivel de significancia de DL entre los pares de locus (r2, o el valor de D y el valor-p,) esto permitió visualizar el bloque de loci (bloque rojo) en DL significativo. Los bloques rojos de haplotipos cerca de la diagonal del triángulo indican la presencia de un alto nivel de DL entre los loci que generan estos bloques. Esto significa que ha habido un limitado o ningún patrón de recombinación desde la formación del bloque en DL. Es decir, estos pares de loci segregan y si están vinculados a algún carácter la asociación entre este par de loci y el carácter será fácilmente detectable con un buen fenotipado.

Los bloques en DL son de gran interés en el mapeo asociativo debido a que simplifican los esfuerzos de mapeo de caracteres complejos (Zhang, et al 2002) y permiten determinar el número de marcadores que se deberían utilizar para cubrir de manera eficiente el genoma. Es decir, a mayor número de bloques en DL, menor será el número de marcadores moleculares necesarios para encontrar asociaciones marcador – carácter.

Para estimar el tamaño de los bloques en DL, el valor de r2 es usualmente graficado en relación a la distancia genética (cM), de esta forma es posible calcular e inferir cuan rápido decae el DL. La rápida caída del DL en relación a la distancia genética indica que la magnitud de DL se conserva con el ligamiento y es proporcional a la recombinación (Stich, et al., 2005, Gupta, et al., 2005). En trigo tetraploide se ha informado que el DL decae

141 aproximadamente entre 2 -3 cM (r2 <0,2) (Somers et al,. 2007) y 20 cM aproximadamente (r2 <0,2, Maccaferri et al. 2005, 2015). Este valor es fluctuante a través del genoma y los factores que lo incrementan pueden ser la generación de mutaciones, el sistema de polinización, aislamiento genético, la estructura poblacional, el efecto fundador, la mezcla génica, la presión de selección y los rearreglos genómicos (Gupta et al., 2005, Oraguzie et al., 2007). La disminución del DL generalmente se debe a elevadas tasas de recombinación, mutación, fecundación cruzada y conversión génica (Flint-Garcia et al., 2003; Gupta et al., 2005, Oraguzie et al., 2007). Teniendo en cuenta que el trigo candeal ha sido objeto de fuertes presiones de selección a lo largo de su historia, se ha demostrado que el germoplasma elite posee un alto nivel de DL (Macaferri et al., 2010; 2014, 2015), que podría ser explotado de forma beneficiosa en estudios de asociación.

Si bien se observó DL significativo entre algunos marcadores dentro de la población de MA y, a la vez, es posible que los mismos estén asociados con caracteres de calidad y rendimiento, estos AFLP son anónimos y no fue posible estimar la distancia genética entre los bloques en DL ni conocer la ubicación de los marcadores y caracteres con asociaciones significativas. Es posible que la presencia de DL entre los marcadores AFLP y el carácter pueda estar dada por factores como deriva génica reciente.

Estos AFLP podrían ser empleados dentro de un programa de selección asistida por marcadores en trigo candeal, donde primero sería necesario validar su funcionalidad partiendo por ejemplo de: i) el análisis del patrón de bandeo o de la secuencia que amplifican, en cuanto a su grado de asociación con los caracteres de interés evaluados en esta tesis; y, ii) un análisis más detallado de su ubicación genética y física dentro del genoma.

Como se mencionó, 42 locus estuvieron en DL, dentro de esos, tres locus presentaron valores de r2 > 0,684 y los restantes 39 valores de r2 > 0,138 a 0,321, con un promedio de r2= 0,237. Esto sugiere que las combinaciones de AFLP analizadas detectaron DL en la población, donde se visualizó la conformación de seis bloques en DL con ubicación desconocida. Estos resultados concuerdan con los informados por Macaferri et al., (2010;

142 2014) y Laidò et al. (2014), quienes realizaron estudios de mapeo por asociación en trigo candeal con valores similares de DL.

En este trabajo, los resultados obtenidos sobre DL deben considerarse como un resultado positivo, dado que los AFLP son dominantes en comparación con los multialélicos SSR, los AFLP únicamente distinguen dos alelos, disminuyendo su capacidad informativa. Sin embargo, los AFLP mostraron ser una herramienta valiosa para este tipo de estudios porque permitieron obtener mucha información en poco tiempo y en forma económica. El registro de marcadores mapeados en un germoplasma o colección de accesiones, permite un análisis mucho más detallado del DL a nivel genómico, cromosómico e inclusive dentro de regiones candidatas. En relación al uso de AFLP y su aplicación en DL y mapeo QTL, se considera que los mismos ofrecen una buena cobertura del genoma y con frecuencia se agrupan en torno a las regiones centroméricas (Alonso-Blanco et al., 1998; Peters et al., 2001).