Variabilidad genética obtenida a partir de marcadores AFLPs

Con el fin de avanzar en la comprensión de la base genética de caracteres de calidad y rendimiento de trigo candeal se abordó un enfoque de mapeo por asociación que, si bien debería completarse utilizando otros marcadores, permitió realizar un avance hacia el conocimiento de la estructura de la población y la asociación de marcadores AFLP anónimos con estos caracteres.

Los marcadores AFLP son locus específico a nivel de especie (Rouppe et al., 1997) y se corresponden a posiciones únicas en los genomas (Vos et al., 1995). Proveen muchas ventajas al ser marcadores neutrales, que no están sujetos a presión de selección, proporcionan información de todo el genoma del cultivo estudiado y no requieren información preliminar del genoma a caracterizar, por lo que se puede aplicar a cualquier especie. Además, utilizan moderadas cantidades de ADN y producen un gran número de bandas polimórficas, de manera altamente reproducibles y con un bue nivel de resolución, tanto en electroforesis como con métodos automatizados. Una vez estandarizados, pueden ser generados a gran velocidad y pueden ser usados para análisis genéticos de poblaciones, análisis de genética cuantitativa y filogenéticos.

133 Este estudio se realizó sobre 133 genotipos sembrados en tres ambientes de la principal región candealera de Argentina, el sudeste de la Pcia. de Buenos Aires durante la campaña 2011/2012. La mayoría de los genotipos utilizados en este análisis son cultivares tradicionales, modernos y líneas avanzadas provenientes de diferentes regiones geográficas donde se cultiva tradicionalmente este cereal. Cabe destacar que este estudio incluyó materiales argentinos, tradicionales y modernos, muchos de lo cuales se encuentran actualmente en uso.

A modo exploratorio se utilizaron diferentes combinaciones de cebadores de AFLP, que resultaron en la amplificación de 402 bandas, de las cuales 116 resultaron polimórficas. Esto confirma la eficacia de estos marcadores para detectar polimorfismos en simultáneo para un gran número de loci en todo el genoma en unos pocos geles (Vos et al. 1995).

Si bien los marcadores AFLP utilizados en esta tesis son anónimos, su uso permitió calcular el nivel de polimorfismo presente en la población, que fue en promedio de 35,8% para todos los genotipos y todas las combinaciones de cebadores. En trigo candeal, otros autores hallaron 34,3%, 26,5% y 14,7% loci polimórficos utilizando 3, 11 y 14 combinaciones de cebadores, respectivamente (Sciacca et al., 2010; Shoaib, 2005; Martos et al., 2005). En trigo pan, utilizando 19 genotipos y seis combinaciones de cebadores, los valores de polimorfismo alcanzaron un porcentaje de 91,2% al encontrar 262 bandas polimórficas de un total de 239 bandas (Vieira et al., 2007). Almanzá-Pizon et al. (2003) reportaron un nivel de polimorfismo de 59% y un valor similar de 47% fue reportado por Roy et al. (2004). En conjunto, estos resultados indican que los marcadores AFLP son eficientes en la detección de la variabilidad genética en el trigo.

Teniendo en cuenta que el trigo candeal es un cultivo que ha estado sometido a diversas fuerzas de selección y procesos de mejoramiento, que se traducen en una disminución de la variabilidad genética (Incirli y Akkaya, 2001), es posible contemplar un nivel de polimorfismo como el encontrado en esta colección de germoplasma. Sin embargo, es aún posible encontrar nuevos alelos que podrían aportar variabilidad genética para distintos caracteres de interés. Los resultados obtenidos a partir de los atributos analizados para las combinaciones de cebadores tales como el índice de contenido polimórfico (PIC) y el

134 índice del marcador (MI), han sido utilizados en varios estudios para evaluar el poder discriminante de los marcadores AFLP en el análisis de la variabilidad genética (Powell et al 1996; Bohn et al 1999; Muminovic et al 2004; Leela Tatikonda et al. 2009).

Los marcadores AFLP tuvieron alto poder de discriminación. En el presente estudio, los valores de PIC oscilaron entre 0,19 y 0,38, con una media de 0,29. Este está en el rango de los obtenidoa en investigaciones previas en trigo candeal, donde se obtuvieron valores de PIC de 0,39 para 41 cultivares comerciales, tradicionales y modernos (Medini et al., 2005), 0,24 para 63 variedades locales con 225 bandas polimórficas (Moragues et al., 2007) y 0,34 utilizando 24 cultivares y 186 bandas polimórficas (Martos et al., 2005). Los valores de PIC obtenidos han sido influenciados por dos aspectos: i) el análisis conjunto del polimorfismo de una población en el que se incluyen tanto poblaciones modernas – tradicionales como de mejoramiento: es de esperar que las poblaciones de mejoramiento presenten una reducción de la variabilidad, o cuello de botella, debido a un proceso de selección artificial; y, ii) el hecho de que este estudio incluye exclusivamente 6 combinaciones de AFLP: comparado con los similares resultados de estudios donde se incluye mayor cantidad de marcadores genotípicos (Ghislain et al., 2009), como por ejemplo marcadores codominantes y de última tecnología, se concluye que, utilizando mayor cantidad de marcadores el factor resolutivo de PIC puede incrementar, permitiendo encontrar un mayor número de formas alélicas. Por ejemplo, utilizando SNPs a gran escala.

Otro de los parámetros evaluados fue el índice del marcador. Los valores de este índice variaron entre 1,9 y 10,6, con un promedio de 5,77 entre las combinaciones de AFLP. Martos et al (2005) en trigo candeal con resultados similares determinaron el valor de MI en 4,43. El parámetro MI en este estudio exhibió una correlación positiva con PIC de 0,69 (r2 = 0,69, p < 0.005). Prevost & Wilkinson (1999) informaron que esta correlación positiva entre los valores de PIC/MI es útil si se quiere seleccionar combinaciones de cebadores con poder discriminante, los cuales pueden ser utilizados en estudios de diversidad genética o como posibles marcadores SCAR como los desarrollados por Jae-Han et al., (2014). Estos índices han sido ampliamente utilizados en estudios de variabilidad en diferentes especies vegetales y en conjunto son una herramienta útil para diferenciar

135 cultivares o realizar estudios evolutivos, filogenéticos o de variabilidad (Gupta et al., 2013; Laurentin and Karlovsky, 2007; Pecina-Quintero et al., 2013; Sehgal et al., 2009; Sharma et al., 2011; Stodart et al., 2005).

Las combinaciones de cebadores que produzcan un único fragmento en un cultivar especifico pueden ser usadas para desarrollar marcadores (STS) que permiten identificar cultivares individuales (Fernández et al., 2002). Los fragmentos compartidos y similares pueden ser valiosos en estudios evolutivos porque dan información acerca de alelos simplesiomorficos ancestrales. En ese contexto, la combinación de cebadores que identificó bandas únicas para discriminar entre las poblaciones argentinas e italianas fue P41M39.

Las combinaciones que resultaron ser más informativas para diferenciar genotipos de trigo candeal fueron P41M31, P41M39 y P40M43. Las 116 bandas polimórficas y los relativos buenos valores de los atributos de los marcadores estudiados en el presente estudio sugieren que los AFLP son marcadores que permiten discriminar, clasificar y hacer análisis de variabilidad genética en trigo candeal. Cabe destacar que pueden ser una herramienta potencial para el genotipado de un gran número de muestras de colecciones de germoplasma y, como consecuencia, son una herramienta productiva para realizar mapeo por asociación. Una desventaja de este tipo de marcador es que son anónimos y de posición desconocida en el genoma del trigo candeal. Sin embargo, esta tesis propone ubicar en el mapa de secuencia aquellas combinaciones de AFLP que detecten una asociación significativa entre el marcador y alguno de los caracteres evaluados. Actualmente se encuentran disponibles las secuencias de los cromosomas de trigo pan (IWGSC) y de trigo candeal (CREA, Italia, grupo del Dr. Luigi Cattivelli, con quien nuestro grupo tiene colaboración). Sería entonces una buena estrategia extraer las bandas de los geles, secuenciarlas y realizar un análisis de Blast con los mencionados genomas.

Los resultados relacionados con el número de alelos y su frecuencia, obtenidos con el uso de combinaciones de AFLPs dentro de la población de candeal estudiados, indican un número promedio de 1,7 alelos por locus. El número de alelos efectivos en promedio fue de 1,5. El índice de diversidad de Shannon arrojó un valor bajo, de 0,4 y la heterocigosidad promedio fue de 0,28. Es decir que fue baja, pero se mantiene dentro de los parámetros

136 esperables, teniendo en cuenta que es una especie homogenizada y con fuerte presión de selección sobre caracteres de rendimiento y calidad. Sin embargo, el trigo candeal porta variabilidad dentro de su genoma (Maccaferri et al, 2014).

Teniendo en cuenta los patrones totales de bandas por poblaciones, incluyendo el set de bandas polimórficas, la heterocigosidad media esperada para cada población varió en un rango de 0,199 a 0,340. Con respecto a la identidad y distancia genética de Nei para cada población, el patrón entre las poblaciones fue consistente, siendo las poblaciones de Argentina e Italia las más parecidas entre sí. Esto se debe fundamentalmente a que los materiales argentinos derivan de los italianos. A partir de los años ´90, empresas e investigadores argentinos se reunieron con el fin de promover el cultivo (Seghezzo y Molfese, 2001), permitiendo que se produjera el desarrollo de variedades que principalmente fueron obtenidas por cruzamientos con variedades Italianas y del CIMMyT. Es por esto que las variedades argentinas modernas derivan de las italianas modernas y de las del CIMMyT. Así mismo, estos valores de identidad y heterocigosidad se deben a que este germoplasma contiene dentro de si un 31,3% de accesiones argentinas, un 25,4% de accesiones italianas, 14,4% de accesiones provenientes del CIMMyT, 14,4% de accesiones provenientes de Francia, 11,8% de accesiones provenientes de WANA y 2,5% de accesiones de EE.UU.

Soleimani et al. (2002) en su investigación de diversidad genética con variedades modernas de trigo candeal, realizada con marcadores AFLP, concluyeron que la variación genética dentro de los cultivares modernos es alta a pesar de la fuerte presión de selección y deriva genética debida al trabajo de los programas de mejoramiento, concluyendo que las estimaciones de diversidad genética realizadas con AFLPs pueden proporcionar información valiosa para los fitomejoradores (Shoaib y Arabi, 2006).