II. 4.3.3.4 Enterococos como microorganismos patógenos
II.4.4. BACTERIOCINAS (ENTEROCINAS) PRODUCIDAS POR MICROORGANISMOS
Hasta la fecha, se han aislado numerosas cepas de enterococos productores de enterocinas, principalmente E. faecium y E. faecalis y, en menor medida, E. avium, E. casseliflavus, Enterococcus
columbae, E. durans, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae y E. mundtii, a partir de una gran
variedad de alimentos, entre los que se incluyen leche, productos lácteos, carne y animales de granja y caza (por ej.: pollos, patos y palomas), embutidos crudos curados y otros productos cárnicos fermentados, vegetales frescos y fermentados, pescados, mariscos y derivados de la pesca (Tabla II.11) (Cintas et al., 1995; Aymerich et al., 1996; Franz et al., 1996; Casaus et al., 1997; Cintas et al., 1997; Ennahar et al., 1998; Floriano et al., 1998; Herranz et al., 1999, 2001c; Moreno et al., 2002; Sabia et
al., 2002; Foulquié-Moreno et al., 2003b; Nilsen et al., 2003; Yamamoto et al., 2003; Gómez et al.,
2004a, b; Achemchem et al., 2005; Alvarado et al., 2005; Citti, 2005; de Kawaadsteneid et al., 2005; Todorov et al., 2005; Todorov y Dicks, 2005; Zendo et al., 2005; Abriouel et al., 2006; Campos et al., 2006; Foulquié-Moreno et al., 2006; Martín et al., 2006; Sánchez et al., 2006, 2007b; Cocolin et al., 2007; Dimov, 2007; Nes et al., 2007), por lo que la bacteriocinogenicidad constituye un rasgo fenotípico muy común entre los enterococos de origen alimentario. Asimismo, se han aislado enterococos productores de enterocinas de preparaciones probióticas (Foulquié-Moreno et al., 2003b; Yermolenko et al., 2006), agua (Gálvez et al., 1998; Švec et al., 2001), leche materna (Martín, 2005; Fernández et al., 2006a), heces humanas (Kang y Lee, 2005; Nes et al., 2005), heces animales (Balla et
al., 2000; du Toit et al., 2000; Jennes et al., 2000; Mareková et al., 2003; Poeta et al., 2006, 2007;
Simonová y Lauková, 2007), ensilados (Ohmomo et al., 2000; Eguchi et al., 2001; Sparo et al., 2006), “pan de abeja” (Audisio et al., 2005), suelo (Yanagida et al., 2005), purines (Lauková et al., 1998b), glándula uropigial de abubilla (Martín-Platero et al., 2006), rumen (Nigutova et al., 2007) y muestras clínicas (del Campo et al., 2001; Tomita e Ike, 2005; de Kwaadsteniet et al., 2006; Inoue et al., 2006) (Tabla II.11).
De forma general, el espectro de actividad antimicrobiana de las enterocinas es amplio e incluye microorganismos patógenos, como L. monocytogenes, S. aureus, Cl. botulinum y Cl. perfringens, y microorganismos alterantes, como Cl. tyrobutyricum, además de otros enterococos y bacterias lácticas (Giraffa et al., 1995; 1997; Franz et al., 1999a; Cintas et al., 2001; Giraffa, 2003; Martínez et al., 2003; Foulquié-Moreno et al., 2006; Franz et al., 2007). Además, aunque generalmente las bacteriocinas son sólo activas frente a bacterias Gram-positivas (sección II.3.4.3), se ha descrito que la bacteriocina A5- 11 (A y B) (Batdorj et al., 2006), enterocina 012 (Jennes et al., 2000), EntAS-48 (Gálvez et al., 1989),
Tabla II.11. Bacteriocinas producidas por Enterococcus spp.
Clase Bacteriocina Subclase Especie y cepa productora Fuente Referencia original
Clase I
Citolisina (CylLL y CylLS) Ia2 E. faecalis Aislado clínico Gilmore et al. (1994)
Columbicina A -h E. columbae PLCH2 Animal de caza Martín et al. (2003)
Clase II
(paloma)
Bacteriocina 32 IIa E. faecium VRE200 Aislado clínico Inoue et al. (2006) Bacteriocina 43 - E. faecium VRE82 Aislado clínico Todokoro et al. (2006)
- E. durans L28-1 Suelo Yanagida et al. (2005) - E. gallinarum 012 Heces (avestruz) Jennes et al. (2000)
cina ST4V - E. mundtii ST4V Semillas de soja Todorov et al. (2005) cina ST15 - E. mundtii ST15 Semillas de soja de Kwaadsteniet et al. Bacteriocina T8 IIa E. faecium T8 Aislado clínico de Kwaadsteniet et al.
(2006) Durancina L28-1B
Enterocina 012 Enterocina 1071ª (Ent1071A
y Ent1071B) IIb E. faecalis BFE 1071 Heces (cerdo) Balla et al. (2000) Enterocina 416K1 - E. casseliflavus IM
416K1 Embutido crudo curado Sabia et al. (2002) Enterocina Ab IIa E. faecium CTC492 Embutido crudo
curado (fuet) Aymerich et al. (1996) Enterocina A5-11 (EntA5-
11A y EntA5-11B) IIb E. durans A5-11 Producto lácteo fermentado Batdorj et al. (2006) Enterocina AS-48c IId E. faecalis S-48 Agua Gálvez et al. (1989)
Enterocina AS-48RJ IId E. faecium RJ16 Queso Abriouel et al. (2005)
Enterocina Bd IIe E. faecium T136 Embutido crudo
curado (chorizo) Casaus et al. (1997) Enterocina CRL35 IIa E. mundtii CRL35 Queso Saavedra et al. (2004b) Enterocina EJ97 IIc E. faecalis EJ97 Aguas
residuales
Gálvez et al. (1998) Enterocina GM1 - E. faecium GM1 Heces (neonato) Kang y Lee (2005) Enterocina HJ35 - E. faecium HJ35 Piel (humana) Yoon et al. (2005) Enterocina JS IIc E. faecalis DBH18 Heces (ánade) Sánchez et al. (2005) Enterocina K25 - Enterococcus spp. “Kimchi” Moon y Yung (2005) Enterocina L50e (EntL50A y
EntL50B) IIb, c E. faecium L50 Embutido crudo curado (chorizo) Cintas et al. (1998a) Enterocina M IIa E. faecium AL41 Aguas
residuales Mareková et al. (2007) Enterocina MR10†
(EntMR10A y EntMR10B) IIb E. faecium MR10-3 Glándula uropigial (abubilla)
Martín-Platero et al. (2006)
Enterocina MR99 - E. faecalis MR99 Ensilado Sparo et al. (2006) Enterocina ON-157 - E. faecium NIAI 157 Ensilado Ohmomo et al. (2000) Enterocina Pf IIa E. faecium P13 Embutido crudo
curado (chorizo)
Cintas et al. (1997) Enterocina PA1 - E. avium PA1 “Pan de abeja” Audisio et al. (2005) Enterocina Q IIc E. faecium L50 Embutido crudo
curado (chorizo) Cintas et al. (2000d) Enterocina RC714 IIa E. avium RC714 Aislado clínico del Campo et al. (2001) Enterocina RJ-11† IIc E. faecalis RJ11 Salvado de arroz Yamamoto et al. (2003)
Enterocina SE-K4 IIa E. faecalis K4 Ensilado Eguchi et al. (2001) Enterocina SF68 - E. faecalis SF68 Probiótico Foulquié-Moreno et al.
(2003b) Entero
Entero
(2005)
Enterocina ST311LD - E. faecium ST311LD Aceitunas Todorov y Dicks (2005) Enterocina T IIa E. avium Heces (neonato) Nes et al. (2005) Enterocina UQ31 - E. faecium UQ31 Queso Alvarado et al. (2005)
Enterococcina A 2000 - E. faecium A 2000 Queso Pantev et al. (2002)
Enterococcina EFS2 - E. faecalis EFS2 Queso Maisnier-Patin et al.
(1996)
Enterococcina V583 - E. faecalis - Swe et al. (2007)
Hiracina JM79 IIa E. hirae DCH5 Animal de caza
(ánade) Sánchez et al. (2007a) Munditicina KSg
Tabla II.11. (continuación)
Clase Bacteriocina Subclase Especie y cepa productora Fuente Referencia original
Clase III
Bacteriocina 41 - E. faecalis Y1714 Aislado clínico Tomita e Ike (2005) Enterocina 388C - E. casseliflavus Embutido crudo
curado Sabia et al. (2004) Enterocina Bc-48 - E. faecalis S-48 Agua López-Lara et al.
(1991)
E. faecalis DPC5280 Hickey et al. (2003)
Enterolisina A - E. faecalis LMG2333 Leche cruda Nilsen et al. (2003) Bacteriocinas no purificadas a homogeneidad
Enterocina 100-101-102 - E. faecium 100 Suelo Kato et al. (1993, 1994) Enterocina 226NWC - E. faecalis 226 Cultivo iniciador Villani et al. (1993) Enterocina 01 - E. faecium NA01 Leche fermentada Olasupo et al. (1994)
Enterocina 3587 - E. faecium 3587 Queso Dimov (2007) Enterocina E-760 - E. durans/faecium
/hirae NRRL B-30745
Heces (pollo) Line et al. (2008) Enterocina EF2019 - E. faecium EF2019 Heces (conejo) Simonová y Lauková
(2007)
Enterocina EL1 - E. faecium NA01 - Lyon et al. (1995)
Hiracina S - E. hirae - Siragusa (1992)
Entre las bacteriocinas caracterizadas con idéntica secuencia aminoacídica a las que se señalan con una letra en superíndice se incluyen: aenterocina de E. faecium B2 (Moreno et al., 2002).
benterocina 1146 de E. faecium DPC1146 (O’Keeffe et al., 1999), enterocina 81 de E. faecium WHE 81 (Ennahar et al., 2001), enterocina 900 de E. faecium BFE 900 (Franz et al., 1996), enterocina BC25 de E. faecium BC25 (Morovsky et al., 2001), enterocina CCM 4231 de E.
faecium CCM 4231 (Lauková y Czikková, 1998), enterocina CTC492 de E. faecium CTC492 (Aymerich et al., 2000b), enterocina EFM01
de E. faecium EFM01 (Ennahar y Deschamps, 2000), enterocinas de E. faecium P21 y L3 (Herranz et al., 2001c; Yermolenko et al., 2006) y bacteriocina 15 de E. faecium N15 (Losteinkit et al., 2001).
centerocina EFS2 de E. faecalis EFS2 (Maisnier-Patin et al., 1996), enterocina 4 de E. faecalis INIA 4 (Joosten et al., 1996), enterocina 7C5 de E. faecium 7C5 (Torri Tarelli et al., 1994; Folli et al., 2003) y bacterocina 21 de E. faecalis OG1X (Tomita et al., 1997).
denterocina 900 de E. faecium BFE 900 (Franz et al., 1996), enterocina CTC492 de E. faecium CTC492 (Aymerich et al., 2000b), enterocina 81 de E. faecium WHE 81 (Ennahar et al., 2001), enterocina RZS C5 de E. faecium RZS C5 (Foulquié-Moreno et al., 2003b) y enterocina RZS C13 de E. faecium RZS C13 (Foulquié-Moreno et al., 2003b) y enterocinas de E. faecium P21 y L3 (Herranz et al., 2001c; Yermolenko
et al., 2006).
eenterocina I de E. faecium 6T1a (Floriano et al., 1998), enterocina de E. faecium B2 (Moreno et al., 2002) y enterocina F58 de E. faecium F58 (Achemchem et al., 2005).
fenterocinas de E. faecium B1 y B2 (Moreno et al., 2002) y enterocinas de E. faecium AA13 y G16 (Herranz et al., 1999).
gmunditicina AT06 de E. mundtii AT06 (Bennik et al., 1998; Saavedra et al., 2004b), munditicina QU2 de E. mundtii QU2 (Zendo et al., 2005) y péptido maduro de la enterocina CRL35 (Saavedra et al., 2004b).
hNo determinado/disponible. †Los autores no han estudiado la presencia de extensión N-terminal en estas bacteriocinas.
enterocina CCM4231 (Lauková et al., 1993; Lauková y Czikková, 1998), enterocina GM-1 (EntGM-1) (Kang y Lee, 2005), enterocina HJ35 (Yoon et al., 2005), enterocina MR99 (EntMR99) (Sparo et al., 2006), EntMR10 (EntMR10A y EntMR10B) (Martín-Platero et al., 2006), EntST4V (Todorov et al., 2005), enterocina ST15 (de Kwaadsteniet et al., 2005) y enterocina ST311LD (Todorov y Dicks, 2005), todas ellas sin purificar, inhiben a bacterias Gram-negativas. Por otra parte, se ha descrito que EntCRL35 (Wachsman et al., 2003) y EntST4V producida por E. mundtii ST4V (Todorov et al., 2005) tienen actividad antiviral.
La variedad de las bacteriocinas producidas por los enterococos es más amplia que la descrita para otros géneros de bacterias lácticas, habiéndose caracterizado (bioquímica y/o genéticamente) más de 50 bacteriocinas diferentes (Tabla II.11) (Franz et al., 1999a, 2007; Nes et al., 2007). La mayoría de las enterocinas son péptidos antimicrobianos pequeños, termoestables y sin aminoácidos modificados postraduccionalmente, que pertenecen a la clase II (no lantibióticos) (sección II.3.4.1), y dentro de ésta a la: (i) subclase IIa (del tipo pediocina), como EntA (Aymerich et al., 1996), EntP (Cintas et al., 1997), enterocina SE-K4 (EntSE-K4) (Eguchi et al., 2001) y EntCRL35 (Saavedra et al., 2004b),; (ii) subclase IIb (sistemas de dos péptidos), como EntL50 (EntL50A y EntL50B) (Cintas et al., 1998a),
enterocina 1071 (Ent1071 [Ent1071A y Ent1071B]) (Balla et al., 2000), y EntMR10 (EntMR10A y EntMR10B) (Martín-Platero et al., 2006); (iii) subclase IIc, como EntL50 (EntL50A y EntL50B) (Cintas et al., 1998a), EntQ (Cintas et al., 2000d), EntEJ97 (Sánchez-Hidalgo et al., 2003) y, probablemente, enterocina RJ-11 (E RJ-11) nt (Yamamoto et al., 2003), enterocina JS (EntJS) (Sánchez
et al., 20 5) y EntMR10 (EntMR10A y EntMR10B) (Martín-Platero 0 et al., 2006); (iv) subclase IId,
como EntAS-48 (Gálvez et al., 1989) y enterocina AS-48RJ (A iouel et al., 2 5) y (v) subclase IIe,br 00 como EntB (Casaus et al., 1997). No obstante, se han descrito enteroc as con aminoácidoin s modificados postraduccionalmente (clase I, lantibióticos), como Cyl (Gilmore et al., 1994; Booth et al.,
1996; Cox et al., 2005) y la colu bicm ina A (Martín et al., 200 ), así como en erocinas con tam3 t año molecular de hasta 34 kDa, pertenec entes a la clai se III, como EnlA (Nilsen et al., 2003) (Tabla II.11).
Los genes que codifican las enterocinas pueden estar loca ados en: (i) unliz plásmido, como en el caso de la bacteriocina 32 (Inoue et al., 2006), bacteriocina 41 (Tomita e Ike, 2005), bacteriocina Bc- 48 (Martínez-Bueno et al., 1992), bacteriocina T8 (de Kawaaddsteniet et al., 2006), Cyl (Gilmore et al., 1994), EntL50 (EntL50A y EntL50B) producida por E. faecium L50 (Criado et al., 2006a), EntQ (Criado et al., 2006a), enterocina 226NWC (Salzano et al., 1992), enterocina 388 (Sabia et al., 200C 4), Ent416K1 (Sabia et al., 2002), Ent1071 (Ent1071A y Ent1071B) (Balla et al., 2000), EntAS-48
(Martínez-Bueno et al., 1990), EntCRL35 (Saavedra et al., 2004b), EntEJ97 (Sánchez-Hidalgo et al., 2003), EntMR99 (Sparo et al., 2006), enterocina ON-157 (Ohmomo et al., 2000 y EntSE-K4 (Do) i et
al., 2002) o (ii) el cromosoma, como en el caso de EntA (Ennahar et al., 2001), EntB (Ennahar et al.,
2001), EntL50 (EntL50A y EntL5 B) pr0 oducida por E. faecium B2 (Moreno e al., 2002), EntMRt 10 (EntMR10A y EntMR10B) (Martín-Platero et al., 2006) y EntP (Herranz, 2001 Moreno et al., 2002; ; Criado et al., 2006a). No obstante, la localización de los genes que codifican una bacteriocina puede variar según la cepa productora (sección II.3.4.7), como se ha descrito en los casos de: (i) EntL50 (EntL50A y EntL50B), cuya agrupación génica se localiza en los plásmido pCIZ1 (aprox., 50 kb) de E. faecium L50 (Cintas et al., 1998a; Criado et al., 2006a), pEF (aprox., 23 k de E. faecium 6T1 b) 1 (Floriano et al., 1998), en el plásmido de 22 kb de E. faecium F58 (Achemchem et al., 2005) y en el cromosoma de E. faecium B2 y E. faecium BFE1072 (du Toit et al., 2000; Mor no et al., 2002) y e (ii) EntAS-48, cuya agrupación génica se localiza en el plásmido pMB2 de E. fae ium S-48 (Martínez-c
Bueno et al., 1990) y en el cromosoma de E. faecium RJ16 (Abriouel et a ., 2005). Asimismo, l
recientemente se ha descrito que los determinantes genéticos que codifican EntP se localizan en el plásmido pCIZ1 y cromosoma de E. faecium L50 (sección II.4.4.1.2) (Criado, 20 6). 0
Desde el punto de vista tecnológico e higiénico-sanitario, las enterocinas son sustancias antimicrobianas interesantes para la industria alimentaria ya que ienen un gran p tencial de aplicación t o en tratamientos combinados para la conservación de alimentos fermentados, refrigerados y/o pasteurizados, debido a su potente actividad frente a microorganismos patógenos y/o alterantes presentes en los alimentos (especialmente frente a Listeria spp.) y algunas de su a s propiedades que les confieren ventajas, frente a otras bacteriocinas, como bioconservantes alimentarios. Entre estas propiedades se incluyen las siguientes: (i) estabilidad en condiciones extremas, como las que tienen lugar dur nte la fermentación de lo producto cárnicos y lácteos, (ii) actividad antimicrobiana a bajas a s s
temperaturas durante largos periodos de tiempo, (iii) producción y estabilidad en leche en el rango de temperaturas 30−37ºC, (iv) resistencia a la renina, (v) compatibilidad con las bacterias lácticas empleadas como cultivos iniciadores, (vi) actividad anti-Listeria en leche, (vii) estabilidad al calor y
(viii) estabilidad en un amplio rango de valores de pH, si bien son más activas a valores ácidos (Giraffa, 1995; Cintas et al., 20 b; Gira00 ffa, 2003; Martínez et al., 2003). Debido a este interés tecnológico, se han desarrollado n merososu estudios que demuestran la eficacia del empleo de algunas enterocinas como aditivos alimentarios (Tab
nes potencia rocinas ditivos alim
nc
la II.12).
Tabla II.12. Aplicacio les de las ente como a entarios
Enterocina Aplicación Refere ia
Enterocina 226 NWC Queso “Mozzarella” Villani et al. (19 3) 9 Enterocina 4 S tema lácte (1
Sistema cárn l. (200
Z mo l. (2005)
S tema vege 0 Sidra y zumo (200
C nservas vegetales Lucas et al. (2006
4231 “Leche” de s Lauková y Czikko is o modelo Rodríguez et al. 997) Enterocina AS-48 ico modelo Ananou et a
Grande et a 5) u is tal modelo de manzana Grande et al. (20 Grande et al. 6a) 6a) CM o ) Enterocina C oja vá (1999) Productos lácteos Lauková et al. (1999a)
i “Hornád” Lauková et al. (1999b)
Salam
“Brynzda” (producto lácteo eslovaco) Lauková y Czikková (2001) Enterocina CRL35 Queso de cabra Farías et al. (1999)
Sistema cárnico modelo Vignolo et al. (2000)
Enterocina CTC492 Productos cárnicos Aymerich et al. (2000b) Carne de cerdo tratada térmicamente Aymerich et al. (2002)
Adaptado de Foulquié-Moreno et al. (2006) y Criado (2006).
II.4.4.1. ENTEROCINAS PRODUCIDAS POR Enterococcus faecium L50
E. faecium L50 es una cepa aislada de un embutido crudo curado español (chorizo) elaborado
artesanalmente sin la adición de cultivos iniciadores (Cintas, 1995; Cintas et al. 1995). Esta cepa presenta dos plásmidos (pCIZ1 [aprox., 50 kb] y pCIZ2 [aprox., 7,4 kb]) y su actividad antimicrobiana se debe a la producción, bajo regulación térmica (Cintas, 1995; Cintas et al., 2000d; Criado et al., 2006b), de tres bacteriocinas (cuatro péptidos) (Tabla II.13) de amplio espectro de acción: (i) enterocina L50 (EntL50 [L50A y L50B], sistema de dos péptidos [EntL50A y EntL50B]) (Cintas et al., 1995, 1998a); (ii) EntP (Cintas et al., 2000d) y (iii) EntQ (Cintas et al., 2000d). E. faecium L50 posee actividad antimicrobiana frente a: (i) microorganismos alterantes de los alimentos (por ej.: Cl.
sporogenes, Cl. tyrobutyricum y Propionibacterium spp.); (ii) microorganismos patógenos productores
de toxiinfecciones alimentarias (por ej.: L. monocytogenes, S. aureus, B. cereus, Cl. botulinum y Cl.
perfringens) y de otras patologías humanas y animales (por ej.: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguis y St. agalactiae) y (iii) bacterias
lácticas (Tabla II.14) (Cintas et al., 1998b, 2000d).
Tabla II.13. Características principales de las enterocinas producidas por E. faecium L50
Enterocina Nº aa MM (Da) pI Extensión N- terminala Referencia
Enterocina L50 EntL50A 43 5.190 10,22 − Cintas et al. (1998a) EntL50B 44 5.178 10,07 − Cintas et al. (1998a) Enterocina P 44 4.630 9,81 + (péptido señal) Cintas et al. (2000d) Enterocina Q 34 3.952 9,39 − Cintas et al. (2000d)
Tabla II.14. Especies bacterianas incluidas en el espectro de acción antimicrobiana de E. faecium L50
Género Especie Bacillus B. cereus Clostridium Cl. botulinum Cl. perfringens Cl. sporogenes Cl. tyrobutyricum Enterococcus E. faecalis E. faecium Lactobacillus Lb. acidophilus Lb. bulgaricus Lb. casei Lb. fermentum Lb. helveticus Lb. sakei Lactococcus Lc. cremoris Lc. lactis
Leuconostoc Le. cremoris
Listeria L. innocua L. monocytogenes Pediococcus P. acidilactici P. pentosaceus Propionibacterium Pr. acidilactici Staphylococcus S. aureus S. carnosus Streptococcus St. pneumoniae St. mitis St. oralis St. parasanguis St. agalactiae
Adaptado de Cintas (1995) y Cintas et al. (1995, 1998b).