FACTORES INTRÍNSECOS Y EXTRÍNSECOS QUE CONTROLAN EL

La cerveza es una bebida con una alta estabilidad microbiológica y, en principio, no constituye un medio adecuado para el crecimiento de la mayoría de los microorganismos debido una serie de factores de estrés microbiano, entre los que se incluyen los siguientes (Jespersen y Jakobsen, 1996; Varnam y Sutherland, 1997; Sendra y Carbonell, 1999; Sanchís et al., 2000; Sakamoto, 2002; Sakamoto y Konings, 2003):

1. Factores intrínsecos. Características naturales de la cerveza: (i) presencia de isohumulonas del lúpulo (17−55 mg de iso-α-ácidos/l); (ii) multiplicación masiva de la levadura seleccionada; (iii) bajo pH (3,8−4,7); (iv) presencia de anhídrido carbónico (aprox., 0,5%, m/vol); (v) baja concentración de oxígeno (< 0,1 ppm); (vi) presencia de etanol (1−10%, vol/vol); (vii) escasos nutrientes residuales, principalmente hidratos de carbono y proteínas, y (viii) presencia de ácidos orgánicos y acetaldehído y otros metabolitos antimicrobianos.

2. Factores extrínsecos. Características de las instalaciones y operaciones: (i) ebullición del mosto, (ii) enfriamiento del mosto en circuito cerrado y en mínimo tiempo, (iii) inoculación inmediata en el mosto de un cultivo masivo de levadura microbiológicamente pura, (iv) renovación regular de la levadura a partir de un cultivo puro del laboratorio, (v) filtración esterilizante excluyendo el oxígeno de los gases del proceso y trasiegos, (vi) filtración de la cerveza después de la maduración, (vii) envasado aséptico, (viii) pasteurización o filtración esterilizante, (ix) mantenimiento de unas

correctas prácticas de higiene y la asepsia, (x) refrigeración y (xi) utilización de conservantes químicos como el dióxido de azufre y sus sales (sulfitos) y el ácido benzoico y sus sales (benzoatos) (Tabla II.1).

De estos factores de estrés microbiano, las isohumulonas del lúpulo (principalmente los iso-α- ácidos) constituyen uno de los más importantes para impedir el crecimiento microbiano en la cerveza. Los iso-α-ácidos, derivados de las flores de la planta del lúpulo (sección II.1.3.3), confieren a la cerveza un sabor amargo y ejercen un efecto bactericida o bacteriostático frente a la mayoría de los microorganismos alterantes de la cerveza, ya que actúan como compuestos ionóforos (compuestos hidrofóbicos que se introducen en la membrana celular y aumentan la permeabilidad a ciertos iones) que disipan el gradiente de pH transmembrana (Simpson, 1993a, b; Sakamoto et al., 2001; Sakamoto, 2002; Iijima et al., 2006; Suzuki et al., 2006). Sin embargo, varias especies de bacterias lácticas, principalmente Lactobacillus spp. y Pediococcus spp., son capaces de crecer y alterar la cerveza (sección II.1.7.1), ya que toleran los iso-α-ácidos del lúpulo (Simpson y Fernandez, 1992; Simpson, 1993b; Sakamoto et al., 2001; Sakamoto, 2002; Iijima et al., 2006; Suzuki et al., 2006).

La resistencia de las bacterias lácticas a estos compuestos antimicrobianos se ha estudiado durante los últimos años, observándose que se debe a la presencia de los genes horA, horB y/o horC (Sami et

al., 1998; Suzuki et al., 2005a, b; Iijima et al., 2007). Sami et al. (1998) aislaron de cerveza la cepa Lactobacillus brevis ABBC45 y demostraron que el gen horA, que se encontraba en el plásmido

pRH45, confería a esta cepa resistencia al lúpulo, permitiéndola crecer y alterar la cerveza. A este respecto, horA codifica una proteína de membrana (HorA) perteneciente al sistema de transporte del tipo ABC (del inglés ATP-Binding Cassette) (sección II.5.1.1), cuya presencia en las bacterias lácticas les permite secretar al medio extracelular los iso-α-ácidos del lúpulo (van Veen et al., 1996; Sami et

al., 1997a; Sakamoto et al., 2001; Sakamoto, 2002). La secuenciación aminoacídica de HorA reveló

que presentaba una similitud de un 53% con LmrA de Lactococcus lactis, otra proteína de membrana del sistema de transporte del tipo ABC (Fath y Kolter, 1993; van Veen et al., 1996; Sami et al., 1997a; Sakamoto et al., 2001; Sakamoto, 2002). Además, Suzuki et al. (2005a) han aislado horA del plásmido pRH20690 en Lactobacillus lindneri DSM20690T, y su secuencia aminoacídica mostró una similitud del 99,7% con horA de Lb. brevis. Esta similitud permite considerar que estas bacterias lácticas han adquirido este gen mediante transferencia horizontal de los respectivos plásmidos (Suzuki et al., 2005a). Asimismo, se ha observado que muchas de estas bacterias lácticas aumentan gradualmente su resistencia al lúpulo si se cultivan en medios en los que se van incrementando gradualmente las concentraciones de iso-α-ácidos, denominándose a este fenómeno adaptación al lúpulo (Sami et al., 1997a; Suzuki et al., 2002, 2006). Por el contrario, si se cultivan estas bacterias lácticas en medios sin iso-α-ácidos pierden la capacidad de crecer y alterar la cerveza, debido a que pierden el plásmido que les confiere resistencia frente a estos compuestos (Sami et al., 1998; Suzuki et al., 2004, 2005b). Por otra parte, Suzuki et al. (2002) aislaron una variante de Lb. brevis ABBC45 que no poseía el plásmido pRH45 y la denominaron Lb. brevis ABBC45C_{. Esta cepa mostraba escasa resistencia al lúpulo, que}

ácidos. No obstante, la resistencia al lúpulo de esta variante era siempre menor que la de la cepa original, lo que indicaba que Lb. brevis ABBC45C poseía un mecanismo de resistencia al lúpulo independiente al conferido por la proteína transportadora HorA. En este contexto, se aisló un plásmido, denominado pRH45II, que contiene los genes horB y horC, que ejercen un papel importante en la resistencia al lúpulo de las bacterias lácticas (Suzuki et al., 2004). Así pues, estos genes codifican las proteínas HorB y HorC que constituyen, respectivamente, un regulador de respuesta y una proteína de membrana perteneciente a la superfamilia RND (del inglés Resistance-Nodulation-Cell Division). El gen horB presenta homología con los reguladores pertenecientes a la familia AcrR, que regulan la transcripción de genes que codifican transportadores pertenecientes a la superfamilia RND (horC). Los análisis de HorC indicaron que posee varios dominios transmembrana (TMD, del inglés

Transmembrane Domains) con un gran dominio hidrofílico entre TMD1 y TMD2, una característica

típica de los transportadores pertenecientes a la superfamilia RND (Suzuki et al., 2005b). Estas proteínas se han descrito en varias especies de bacterias lácticas como Lactobacillus backi, Lb. brevis,

Lb. lindneri, Lactobacillus paracollinoides, Pediococcus damnosus y Pediococcus inopinatus, siendo

su secuencia nucleotídica muy similar lo que determina que estos microorganismos han adquirido estos genes mediante transferencia horizontal de los respectivos plásmidos (Suzuki et al., 2005b; Iijima et

al., 2007). Asimismo, las bacterias lácticas que contienen horB y horC en su genoma aumentan su

resistencia al lúpulo al cultivarlas en un medio en el que se incrementan progresivamente las concentraciones de iso-α-ácidos (Iijima et al., 2006); sin embargo, cuando se cultivan en medios sin iso-α-ácidos estas cepas pierden la capacidad de crecer y alterar la cerveza, ya que pierden el plásmido que les confiere resistencia frente a estos compuestos (Sami et al., 1998; Suzuki et al., 2004, 2005b). Además, la presencia de horB y horC en estas bacterias lácticas confiere un aumento de su resistencia a otros compuestos antimicrobianos como el bromuro de etidio y la nisina A (NisA) (Iijima et al., 2006). Con base en lo anterior, horA, horB y horC pueden utilizarse como marcadores genéticos para determinar si una bacteria láctica posee o no capacidad para alterar la cerveza (Suzuki et al., 2005b; Iijima et al., 2007). Finalmente, conviene mencionar que diversos estudios demuestran que las bacterias lácticas también pueden resistir al lúpulo mediante otros mecanismos entre los que se incluyen: (i) la presencia de la proteína transportadora HitA, típica de lactobacilos alterantes de cerveza (Hayashi et al., 2001); (ii) una alteración de la cantidad de ácidos lipoteicoicos presentes en la pared celular (Behr et al., 2006) y/o (iii) modificaciones en la composición lipídica de la membrana citoplasmática (Sakamoto, 2002; Sakamoto y Konings, 2003; Behr et al., 2006).

II.1.7. ALTERACIONES DE LA CERVEZA DURANTE SU ELABORACIÓN Y