Esta técnica se basa en que todos los microorganismos vivos contienen ATP, molécula responsable de transportar y almacenar la energía en los seres vivos. Este compuesto puede obtenerse mediante un reactivo específico y a través de un complejo enzimático de luciferín-luciferasa de luciérnaga se cataliza una reacción de bioluminiscencia en la que a partir de ATP y en presencia de oxígeno se obtiene luz que se detecta en un espectrofotómetro. La luz es proporcional a la cantidad de ATP presente en los microorganismos y los resultados se obtienen de forma instantánea. El umbral de detección de este método es inferior al de otras técnicas, sin embargo, presenta los inconvenientes de que no permite distinguir el tipo de microorganismo (alterante o no) y sólo puede utilizarse para cervezas filtradas. Así pues, esta técnica debe combinarse necesariamente con un paso previo de filtración e incubación de la muestra a analizar (Sanchís et al., 2000; Takahashi et al., 2000; Nakakita
et al., 2002).
Debido a las alteraciones de la cerveza durante su elaboración y almacenamiento (sección II.1.7), resulta de gran interés la investigación de nuevas metodologías que permitan minimizar el riesgo de alteración microbiana de la cerveza. En este contexto, dado que la seguridad e inocuidad de las bacterias lácticas asociadas a los alimentos se ha aceptado durante mucho tiempo, se ha sugerido su empleo y/o el de sus metabolitos como bioconservantes, para que, formando parte de un sistema de “barreras” u “obstáculos” (Cleveland et al., 2001; Deegan et al., 2006), permitan garantizar la seguridad y la calidad higiénica, y prolongar la vida útil de los alimentos que se consumen (Horn et al., 1998; Cleveland et al., 2001; Vaughan et al., 2005; Deegan et al., 2006). De las sustancias antimicrobianas producidas por las bacterias lácticas, las bacteriocinas (péptidos antimicrobianos de síntesis ribosomal que se sintetizan con o sin modificaciones postraduccionales) son las más interesantes tecnológicamente debido a su posible utilización como bioconservantes alimentarios para inhibir el desarrollo de microorganismos alterantes y patógenos de los alimentos, y que permitirían obtener productos más naturales, más saludables y con menos aditivos químicos (Nes et al., 1996; Cintas y Casaus, 1998; Cintas et al., 2001; Cleveland et al., 2001; O´Sullivan et al., 2002a; Ross et al., 2002; Deegan et al., 2006).
II.2. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS DE SÍNTESIS RIBOSOMAL: BACTERIOCINAS II.2.1. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS DE SÍNTESIS RIBOSOMAL
Los péptidos con actividad antimicrobiana se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, siendo producidos por una gran variedad de organismos, entre los que se incluyen animales vertebrados e invertebrados (mamíferos, aves, anfibios, peces, crustáceos e insectos), plantas y microorganismos (bacterias, hongos y estreptomicetes), en los que constituyen la primera línea de defensa natural y forman parte de su inmunidad innata (Hancock et al., 1995; Nissen-Meyer y Nes, 1997; Hancock y Chapple, 1999; Dutton et al., 2002; Diep y Nes, 2002; Papagianni, 2003). Entre las propiedades que los convierten en péptidos antimicrobianos defensivos efectivos destacan: (i) su toxicidad selectiva, es decir, capacidad de distinción entre células productoras y células diana, (ii) su acción antibiótica rápida, (iii) su espectro antibacteriano amplio y (iv) su baja inducción de aparición de resistencias microbianas (Matsuzaki, 1999). Hasta la fecha, se han descrito y caracterizado una gran variedad de péptidos antimicrobianos que, según su mecanismo de biosíntesis, se clasifican en dos grandes grupos: (i) péptidos de síntesis no ribosomal, entre los que se incluyen diversos antibióticos (por ej.: polimixinas, bacitracinas y glicopéptidos) producidos por bacterias, hongos y estreptomicetos y (ii) péptidos de síntesis ribosomal, producidos por multitud de especies animales, vegetales y bacterianas (denominados, en este último caso, bacteriocinas) (Hancock et al., 1995; Epand y Vogel, 1999; Hancock y Chapple, 1999; Dutton et al., 2002; Lüders et al., 2003). La mayoría de los péptidos antimicrobianos de organismos eucariotas superiores son producidos por las mucosas y superficies corporales y, en el caso de los anfibios, se sintetizan en glándulas especiales (Zasloff, 1987; Kreil, 1994). En los mamíferos, estos péptidos se encuentran en los gránulos de los fagocitos (Lehrer et al., 1993; Boman, 1995), mientras que en los insectos están localizados en la hemolinfa (Boman, 1995).
De forma general, los péptidos antimicrobianos de síntesis ribosomal muestran una escasa homología en su estructura primaria, sin embargo, tienen en común su pequeño tamaño molecular (aprox., 20−60 aa) y su naturaleza catiónica y anfipática (presencia de regiones hidrofóbicas e hidrofílicas), responsable de su capacidad de interaccionar con las membranas citoplasmáticas de las células sensibles provocando su permeabilización/desestabilización (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Matsuzaki, 1999; Riley y Wertz, 2002; Papagianni, 2003).
Aunque tradicionalmente se ha considerado que la acción letal de los péptidos antimicrobianos de síntesis ribosomal se basa en la desestabilización de las membranas y su consiguiente despolarización, lo que conduce en última instancia a la muerte celular (Cleveland et al., 2001; Diep y Nes, 2002), se han descrito péptidos capaces de atravesar las membranas intactas e interaccionar con las dianas intracelulares (Nissen-Meyer y Nes 1997; Hancock y Rozek, 2002). A este respecto, se ha sugerido la existencia de diversas dianas potenciales en los microorganismos sensibles, tales como la membrana, la división celular, la síntesis de proteínas, ADN o ARN y la activación autolítica, y que cada uno de los péptidos antimicrobianos “selecciona” una o varias de ellas (Hancock y Rozek, 2002).
Por otra parte, los péptidos antimicrobianos de síntesis ribosomal producidos por células eucariotas y células procariotas (bacterianas) se diferencian en su actividad, espectro de acción y potencia. En primer lugar, la actividad de los péptidos antimicrobianos eucarióticos se dirige a bacterias Gram- positivas y Gram-negativas (actividad antimicrobiana) y, también, a células eucariotas (actividad quimiotáctica y proinflamatoria), mientras que, de forma general, los péptidos antimicrobianos bacterianos únicamente tienen una actividad antimicrobiana y un espectro de acción reducido, dirigiéndose principalmente a especies y géneros relacionados. En segundo lugar, los péptidos antimicrobianos bacterianos son activos a concentraciones del orden pico-nanomolar, por lo que su potencia es superior a la de los péptidos antimicrobianos eucarióticos, ya que éstos son activos a concentraciones del orden micromolar (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Diep y Nes, 2002; Dutton et al., 2002).
La rápida emergencia de poblaciones bacterianas resistentes a numerosos antibióticos en especies con un elevado potencial patogénico ha incrementado el interés por el desarrollo de nuevos compuestos que proporcionen una protección más eficaz frente a las toxiinfecciones bacterianas y que puedan ser empleados en la industria alimentaria y farmacéutica (Bechinger, 1999; Epand y Vogel, 1999; Lohner y Prenner, 1999; Moll et al., 1999b; Pag y Sahl, 2002b; Twomey et al., 2002). Entre estos compuestos se encuentran los péptidos antimicrobianos naturales de síntesis ribosomal, particularmente los que ejercen actividad inmunológica, antitumoral, antifúngica y/o antivírica sin resultar hemolíticos ni citotóxicos para las células sanas de vertebrados (Bechinger, 1999). Aunque los péptidos antimicrobianos producidos por microorganismos eucariotas y procariotas se sintetizan y actúan en circunstancias muy diferentes, estos sistemas de defensa natural poseen elementos comunes a nivel molecular, por lo que la caracterización de los péptidos antimicrobianos eucarióticos puede resultar muy relevante en el estudio de los procarióticos, y viceversa, ya que permitiría optimizar su empleo independiente o conjuntamente en la industria alimentaria y farmacéutica (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Diep y Nes, 2002).
II.2.2. BACTERIOCINAS II.2.2.1. DEFINICIÓN
El concepto de bacteriocina ha evolucionado paulatinamente desde que, durante la primera mitad del siglo XX, diversos investigadores describieron la asociación entre la actividad antimicrobiana de ciertos microorganismos y la producción de sustancias antimicrobianas y se propusiera el término “bacteriocina” para englobar las diferentes sustancias antimicrobianas de origen bacteriano del tipo de las colicinas, caracterizadas por: (i) su adsorción a receptores de membrana específicos, (ii) su actividad intraespecífica restringida a especies filogenéticamente próximas, (iii) su biosíntesis letal, (iv) su naturaleza proteica, (v) su modo de acción bactericida y (vi) la localización plasmídica de los determinantes genéticos que codifican su producción e inmunidad (Jacob et al., 1953). Posteriormente, a la vista de las diferentes características de las bacteriocinas producidas por bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, Tagg et al. (1976) las definieron como “sustancias antimicrobianas de naturaleza
peptídica y activas frente a bacterias con una estrecha relación filogenética con la especie productora”. Esta definición es válida únicamente para algunas bacteriocinas producidas por las bacterias lácticas, ya que algunas poseen actividad bactericida frente a microorganismos alejados taxonómicamente de las especies que las producen, por lo que Konisky (1982) propuso una definición más general, definiéndolas como “agentes antimicrobianos de naturaleza peptídica cuya síntesis no es letal para la célula productora”. En los últimos años, se ha producido un extraordinario avance en la investigación sobre las bacteriocinas de las bacterias Gram-positivas y, principalmente, de las bacterias lácticas, lo que ha permitido elucidar su estructura, sus características físico-químicas, su modo de acción, la localización de sus determinantes genéticos y los mecanismos de biosíntesis, procesamiento, transporte y regulación. Como consecuencia de todo ello, se han propuesto nuevas definiciones. Así pues, Klaenhammer (1988) las definió como “un grupo heterogéneo de compuestos antibacterianos de naturaleza proteica que varían en su espectro antimicrobiano, modo de acción, tamaño molecular, determinantes genéticos y características bioquímicas”. Por otra parte, Jack et al. (1995) las definieron como “un grupo heterogéneo de sustancias antimicrobianas bacterianas de síntesis ribosomal que se secretan al medio extracelular, con o sin modificaciones postraduccionales, y que poseen un espectro de acción antimicrobiano que puede ser reducido y limitado, al menos, a algunas cepas de su misma especie”. Por último, Stiles (1996) definió a las bacteriocinas como “sustancias cuyas únicas características comunes son su carácter proteico y su actividad antimicrobiana”.
En definitiva, las bacteriocinas son péptidos o proteínas de síntesis ribosomal, con o sin modificaciones postraduccionales, producidos y secretados por bacterias Gram-positivas y Gram- negativas, que poseen actividad antimicrobiana (bactericida o bacteriostática) (Joerger et al., 2000; O’Keeffe y Hill, 2000; Cintas et al., 2001; Hill y O’Keeffe, 2003; Gálvez et al., 2007).
II.2.2.2. BACTERIOCINAS PRODUCIDAS POR BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS vs. BACTERIOCINAS PRODUCIDAS POR BACTERIAS GRAM-POSITIVAS
La capacidad de producir bacteriocinas (bacteriocinogenicidad) es un rasgo fenotípico muy extendido entre las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, no obstante, las bacteriocinas producidas por ambos grupos de microorganismos poseen características diferentes, destacando las diferencias en su tamaño molecular, estructura, espectro y modo de acción, organización genética y mecanismos de secreción, inmunidad y regulación (Tabla II.4).