13.1. Diseños experimentales empleados
Los cultivos se realizaron en poblaciones aisladas de CT, EP y ER, suspendidas en 1
mL de medio DMEM baja glucosa (5.5 mM) (Gibco®, 31600034) suplementado con lactato 6
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sembraron en cápsulas de cultivo de 35 mm de diámetro, en una densidad de 4 a 5 x 106
células por cápsula, y se mantuvieron a una temperatura de 33°C, bajo atmósfera de CO2 al
5%. A las 5 horas de cultivo, solubilizado en 1 mL de cada uno de los medios en estudio, se
agregó 1 µCi del precursor radioactivo, [3H]16:0 (57.0 Ci/mmol; Perkin Elmer Life Sciences
Inc, Boston, MA, USA), al cual se le había adicionado la cantidad suficiente de 16:0 no marcado y BSA como para alcanzar una relación BSA/16:0 de 2:1 y una concentración final de 16:0 de 2.5 µM.
En una primera serie de ensayos, las células se preincubaron en presencia de uno de los dos inhibidores empleados (CS o FB1), o de sus respectivos controles (agua o DMSO), durante 5 horas. A continuación se agregó a cada cápsula (1 mL) del mismo medio DMEM completo (esto es, conteniendo los inhibidores para mantener su concentración), y 1 µCi de
[3H]16:0. A partir de este agregado, los cultivos continuaron durante 20 horas adicionales
(Figura 9 A).
Los efectos de la testosterona se realizaron similarmente (Fig. 9 A), esto es, las células se preincubaron en presencia de Tes (y los respectivos controles con su vehículo, etanol) durante 5 horas. A continuación se agregó a las cápsulas el 1 mL del mismo medio
completo conteniendo Tes o etanol para mantener su concentración, y 1 µCi de [3H]16:0. A
partir de este agregado, los cultivos continuaron durante 20 horas adicionales.
En una tercera serie de experimentos, se evaluaron los efectos del agregado del medio condicionado de Sertoli (MCS). En este caso, las células experimentales y controles se preincubaron durante 5 horas con el medio DMEM completo. Una vez cumplidas, se agregó, 1 mL del medio MCS o 1 mL de DMEM/F-12 (control del medio MCS), ambos
conteniendo el 1 µCi de [3H]16:0, y los cultivos continuaron durante 20 horas adicionales
(Figura 9 B).
Finalmente, para evaluar el efecto de MCS en presencia de Tes, se preincubaron las células en el medio DMEM conteniendo Tes (o su vehículo, etanol, como control) durante 5 horas. Cumplidas éstas, a ambos cultivos (sin Tes y con Tes), se les agregó el medio MCS
(1 mL) conteniendo [3H]16:0, prosiguiendo la incubación durante 20 horas (Figura 9 C).
Al cabo de las 20 horas, las células fueron fotografiadas con una cámara adosada a un microscopio óptico Nikon Eclipse TE 2000 para evaluar la morfología celular.
Las suspensiones celulares se procesaron como se detalló previamente en esta
sección para el caso del [3H]20:4 (apartado 10.1), a fin de obtener los extractos lipídicos. En
todos los casos se separaron los lípidos, de los cuales los estudios se concentraron en la
radioactividad proveniente de [3H]16:0 que había sido incorporada en la Cer, la SM y la
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Figura 9. Esquema de los diseños experimentales empleados para investigar la biosíntesis de novo de esfingolípidos utilizando el precursor [3H]16:0, en células aisladas a partir del epitelio seminífero adulto: CT, células espermatogénicas totales; EP, espermatocitos en paquiteno; ER, espermátidas redondas.
13.2. Expresión de los genes CerS3, SMS1, SMS2 y GlcCerS
En células aisladas del epitelio seminífero
Para detectar posibles diferencias cuantitativas en los niveles de ARNm de los genes CerS3, SMS1, SMS2 y GlcCerS entre las poblaciones de células aisladas del epitelio
seminífero (EP, ER, ET, SC y CR), se realizó RT-qPCR utilizando los pares de primers
listados en la Tabla 4, de acuerdo a los procedimientos descritos en detalle en el apartado
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Tabla 4. Secuencias (5´- 3´) de los pares de primers utilizados para qRT-PCR.
En células tratadas con hormonas esteroidales y MCS
Para evaluar los efectos de las hormonas esteroidales sobre la expresión de los cuatro genes en estudio (CerS3, SMS1, SMS2 y GlcCerS) los niveles del ARNm de los mismos se cuantificaron mediante RT-qPCR, inicialmente en cultivos de CT, luego de ser tratados durante 5 horas con cada hormona, 0.1 µM de Tes, 0.1 µM de 17-β-estradiol (E2), o su vehículo (etanol). Las CT fueron cultivadas en las mismas condiciones que las utilizadas
para los ensayos con el precursor radioactivo (33°C en una atmósfera de CO2 al 5%),
agregando a controles y experimentales la misma concentración del vehículo o de hormonas (0.1 µM) y de 16:0 (2.5 µM), en estos casos no marcado.
Las células fueron resuspendidas en el medio habitual (DMEM 5.5 mM glucosa, 6 mM lactato, 10% de SFB, y 100 U/ mL de penicilina y de estreptomicina). Porciones de 750 µL
de esta suspensión celular (conteniendo 2 x 106 células por pocillo) se repartieron en placas
de 24 pocillos, e inmediatamente se agregaron 750 µL de cada uno de los siguientes tres medios: 1) el mismo medio DMEM completo; 2) el medio MCS resultante del cultivo de células de Sertoli; o 3) DMEM/F-12 (control del medio MCS), en los dos últimos casos en proporción final DMEM: F-12 3:1. Los 3 medios estuvieron suplementados con 16:0 sin marcar y BSA libre de ácidos grasos (2:1, mol: mol) para alcanzar una concentración final de 2.5 µM de 16:0. Al mismo tiempo, se agregaron las hormonas esteroidales Tes o E2 (1.5 µL de soluciones 100 µM de etanol) en los pocillos correspondientes, para alcanzar una concentración final de las mismas en el medio igual a 0.1 µM.
Al cabo de 5 horas en cultivo, se extrajo el ARN total de cada muestra y se realizó RT-
qPCR utilizando los pares de primers listados en la Tabla 4. Ensayos similares se realizaron
para medir los niveles de expresión de Elovl2, Elovl4, Elovl5 y Fa2h en cada una de las
condiciones experimentales aquí mencionadas, en este caso utilizando los pares de primers
que aparecen en la Tabla 2. Para llevar a cabo la RT-qPCR se aplicaron los procedimientos
detallados para Elovl4 y Fa2h en la presente sección de Materiales y Métodos.
CerS3 GTCTTTGTGAAAGCGTCCCAC ATTGGCTAGAGGTGTGGCAA 58
SMS1 TGCATAGTTGGCACGCTGTA GCACTTGAGCTTCCCAGTCT 58
SMS2 CTTCCTCTTCAGCGGCCATA TGGTACCACCAGAAGTGACG 58
GlcCerS ACGTAGCTGACAGACAAGGC CATCCCCGTCACACACTTGA 58
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