Para obtener fracciones de membranas a partir de estas células en tres diferentes estadios de su diferenciación (EP, ER y ET) se compararon dos métodos: uno clásico, que incluye la presencia de detergente y otro libre de detergente. Ambos fueron objeto de una
M a t e r i a l e s y M é t o d o s| 57
amplia caracterización a fin de compararlos y decidir cuál era el más adecuado para ser aplicado a los lípidos.
4.1. Aislamiento de fracciones de membrana “resistentes a la solubilización en detergente” (DRM)
A partir de células germinales totales (CT), preparaciones conteniendo los dominios de
membranas resistentes a la solubilización en detergente (DRM, del inglés detergent-
resistant membranes) se obtuvieron mediante el ampliamente utilizado método descrito por
Brown y Rose (1992) esquematizado en la Figura 3A. Luego de 2 lavados con 1 mL de
medio KHs, las CT se lisaron durante 30 minutos a 4°C con el buffer de lisis TNE, pH 7.4, de la siguiente composición: Tris-HCl 50 mM, NaCl 70 mM y EDTA 5 mM con el agregado de Tritón X-100 (Sigma Aldrich, 9002-93-1) 1% en presencia de 15 μL de inhibidor de proteasas
completo (Sigma Aldrich P-8340) por mL de buffer de lisis para evitar la degradación
enzimática. Las células lisadas se homogeneizaron como se describe más adelante para el otro método. El lisado celular se mezcló con un volumen igual de sacarosa al 80% en TNE
para obtener un homogenado total (HT) en buffer TNE con una proporción final de
sacarosa al 40%, parte del cual se guardó para la extracción de lípidos y proteínas. Se cargaron 3 mL del HT en el fondo de tubos de ultracentrífuga de 12 mL, y se agregaron por encima, sucesivamente, 6 mL de sacarosa 36% y 3 mL de sacarosa 5%, formando así un gradiente discontinuo de sacarosa. Los tubos se centrifugaron durante 20 horas a 250000 g (34200 rpm) y 4ºC en un rotor Beckman SW41 utilizando una ultracentrífuga Beckman Coulter Optima L-90K. De la interfase de sacarosa 5% / 36%, se recuperó una única banda
correspondiente a la fracción conteniendo las membranas resistentes a la solubilización en
detergente (DRM). La fracción que quedó por debajo de la anterior (aproximadamente 6 mL
de sacarosa 36% y 3 mL de sacarosa 40%), conteniendo las membranas solubles en
detergente (DSM, del inglés detergent-soluble membranes) y el pellet (Pe) insoluble también
se colectaron con fines comparativos.
4.2. Aislamiento de fracciones de membranas por un método libre de detergente
Para este fin se empleó el protocolo descrito por Luria y colaboradores (2002). Éste se
aplicó tanto a las células germinales totales (CT), como se esquematiza en la Figura 3B,
comoa cada una de las tres poblaciones de células espermatogénicas a estudiar, esto es, a
M a t e r i a l e s y M é t o d o s| 58
Figura 3. Aislamiento de fracciones de membranas a partir de un homogenado total (HT) de células germinales totales (CT) aisladas del epitelio seminífero de rata por cada uno de los procedimientos descritos, mediante ultracentrifugación en un gradiente discontinuo de sacarosa. En (A) se ilustra el método que utiliza detergente siguiendo el clásico protocolo descrito por Brown y Rose (1992), y en (B) se detallan las condiciones del método libre de detergente publicado por Luria y colaboradores (2002). En cada caso, el HT se obtuvo a partir de las mismas CT, lisadas con el mismo buffer, conteniendo (o no) el detergente Tritón X-100 (TX-100). Se indican las concentraciones de sacarosa y las bandas correspondientes a las diferentes fracciones de membranas obtenidas para cada método. Teniendo en cuenta su mayor resolución, y otras ventajas descritas en Resultados, el procedimiento ilustrado en (B) para CT se eligió para la obtención de fracciones de membrana livianas, pesadas y extra-pesadas a partir de las poblaciones de células espermatogénicas en distintos estadios de diferenciación.
Obtención de homogenados celulares
Las CT, y los tres tipos celulares mencionados (aislados mediante el STA-PUT como
M a t e r i a l e s y M é t o d o s| 59
obtenido se trató de lisar durante 1 hora a 4ºC en hielo con dos buffers diferentes: 1) TKM
pH 7.4 compuesto por Tris-HCl 50 mM, KCl 25 mM y MgCl2 5 mM, y 2) TNE pH 7.4 de la
misma composición que el empleado en el método anterior (salvo por la ausencia del detergente), en ambos casos en presencia de 15 μL de inhibidor completo de proteasas
(Sigma Aldrich, P-8340) por mL de buffer de lisis. Si bien a simple vista no se detectaron
diferencias en las bandas correspondientes a las fracciones de membranas, las observaciones cuantitativas iniciales mostraron que cuando se utilizaba TNE como buffer de lisis se conservaban mejor los lípidos (especialmente la esfingomielina y los glicerofosfolípidos) (ver Figura 9 en Figuras y Tablas- Capítulo I), por lo que se decidió utilizar este último. Las células lisadas fueron homogeneizadas y pasadas repetidas veces a través de jeringa de tuberculina, manteniéndolas en el hielo y luego sometiéndolas a ultrasonido durante 3 minutos en un baño sonicador a 50 Hz a 4ºC (Branson Sonifier B-220,
Smithkline Co.) para favorecer al máximo la lisis celular. Al homogenado total (HT)
obtenido se le agregó el mismo volumen de sacarosa 80% en TNE para alcanzar una
concentración final de 40% de sacarosa.
Ultracentrifugación en gradientes de sacarosa
Antes de fraccionarlo, parte del HT conteniendo membranas de cada tipo celular se reservó para la extracción de lípidos y proteínas con fines comparativos. Para formar un gradiente discontinuo de sacarosa, se cargaron 3 mL de cada homogenado celular (en sacarosa al 40%) en el fondo de tubos de ultracentrífuga ultraclear de 12 mL y se agregaron por encima y sucesivamente porciones de 3 mL de concentraciones decrecientes de sacarosa: 35%, 22.5% y 10%. Los tubos se centrifugaron durante 3 horas a 100000 g (28400 rpm) y 4ºC en un rotor Beckman SW41 utilizando una ultracentrífuga Beckman Coulter Optima L-90K. Se obtuvieron 3 bandas, correspondientes a fracciones de membrana que se separaron sobre la base de sus diferencias de densidad. Éstas se denominaron
como sigue: membranas livianas (ML) (interfase sacarosa 10- 22.5%), membranas
pesadas (MP) (interfase sacarosa 22.5- 35%) y membranas extra-pesadas (MEP)
(interfase sacarosa 35- 40%). En adición, se recuperó un pellet (Pe) del fondo de cada tubo.
Lavado de las fracciones de membranas aisladas
Los HT conteniendo membranas sin fraccionar, y las fracciones de membrana ML, MP, y MEP obtenidas, tanto a partir de CT como de cada población celular en estudio, se colectaron por separado en tubos de ultracentrífuga de 4 mL y se lavaron con buffer TNE sin detergente para eliminar la sacarosa, pues ésta interfiere en el análisis lipídico y proteico. Para ello las muestras con las fracciones se sometieron a ultracentrifugación en un rotor Beckman 90Ti a 200000 g (54000 rpm) y 4°C durante 45 minutos utilizando una
M a t e r i a l e s y M é t o d o s| 60
ultracentrífuga Beckman Coulter Optima L-90K. Se descartó el sobrenadante, y los pellets
de membranas resultantes fueron resuspendidos en 1 mL de buffer TNE. De allí, previo
agregado de 3 μL de inhibidor de proteasas completo (Sigma Aldrich, P-8340), se tomaron alícuotas de 200 μL para la cuantificación y análisis de proteínas y para ensayos enzimáticos. La mayor parte (800 μL) de las muestras se destinó al estudio de sus lípidos.