Para determinar la identidad de las fracciones de membrana aisladas a partir de las células germinales, luego de su separación por electroforesis, se evaluó la expresión de proteínas marcadoras específicas de diferentes dominios de membrana, mediante su inmunodetección con anticuerpos específicos.
5.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS- PAGE) y Western blot (WB)
Preparación de las muestras
Antes de su separación y análisis, se determinó la concentración de proteínas de las alícuotas de HT y de las fracciones ML, MP y MEP de cada tipo celular que habían sido
reservadas para tal fin (200 µL de 1000 µL) según se describe en el punto 5.4 de esta
sección. Para determinar la concentración de proteínas requerida para la electroforesis, las mencionadas alícuotas se desnaturalizaron agregando un volumen apropiado de buffer Laemmli 5X (Tris-HCl 1.5 M pH 6.8, glicerol 40%, β-mercaptoetanol 20%, SDS 8% y azul de bromofenol 2% como indicador del frente de corrida) en una proporción de 4:1 (muestra: Laemmli). Antes de su siembra en los geles, las muestras se incubaron durante 5 minutos en un baño a 100ºC de acuerdo con el protocolo descrito por (Laemmli, 1970). Los lisados que no se sembraron enseguida se conservaron a -20°C hasta el momento de su siembra, y se incubaron durante 1 minuto en agua hirviendo previo a la misma.
Concentración de proteínas antes de su siembra
En el caso de extractos proteicos de baja concentración (0.5- 0.9 µg/µL), como fue el caso de la fracción de membranas livianas (ML), sus volúmenes resultaron ser demasiado grandes para su siembra en el gel. Para sortear este inconveniente, se aplicó el siguiente procedimiento que permite concentrar proteínas mediante precipitación de las mismas.
A partir de alícuotas de extractos proteicos conteniendo la cantidad específica de proteína que se deseaba precipitar, se hicieron particiones con diferentes volúmenes de solventes en relación al volumen de partida del extracto. Así, para cada 1 volumen de cada extracto proteico a precipitar, se agregó el equivalente a 4 volúmenes de metanol más 1 volumen de cloroformo y se agitó vigorosamente con vórtex obteniendo una única fase.
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durante 1 minuto a 16000 g (13000 rpm) a temperatura ambiente. Se descartó la fase superior, conservando la banda proteica en la interfase. Esas proteínas quedaron suspendidas en una sola fase mediante el agregado de 3 volúmenes de metanol, y después
de una agitación vigorosa se recuperaron en forma de un pellet proteico por centrifugación
durante 2 minutos a 16000 g (13000 rpm) a temperatura ambiente. Luego de retirar el sobrenadante, el pellet conteniendo las proteínas se dejó secar al aire y se resuspendió en
el volumen adecuado de buffer Laemmli 1X previo a la desnaturalización y siembra de las
muestras.
En el caso del método de fraccionamiento de membranas por detergente, el presente procedimiento resultó ser además muy útil para eliminar posibles interferencias de la sacarosa en los pasos de desnaturalización y cuantificación de las proteínas extraídas de la fracción DSM. En este caso, las proteínas precipitadas se resuspendieron en 50 µL de buffer de lisis TNE conteniendo 0.75 µL de inhibidor de proteasas completo, de donde se tomaron
alícuotas de 5 µL para determinar el contenido proteico previo al agregado del buffer
Laemmli 5X.
Electroforesis
La separación de proteínas por peso molecular se realizó mediante electroforesis en
geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE, del inglés
sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis). El gel de resolución estaba formado por acrilamida al 10% ó al 12% (según la proteína de interés) y bisacrilamida 0.26% en Tris-HCl 375 mM pH 8.8 conteniendo SDS 0.1%, persulfato amónico 0.05% y TEMED
0.05%. El gel de stacking o de empaquetamiento estaba constituido por acrilamida 3.8% y
bisacrilamida 0.1% en Tris- HCl 125 mM pH 6.8 conteniendo SDS, persulfato amónico y TEMED en las mismas concentraciones que para el gel de resolución. En este gel se sembraron cantidades equivalentes de proteínas (25 μg/calle) provenientes de los lisados del HT y de las distintas fracciones de membrana, además de 10 µL de marcadores pre- teñidos de peso molecular conocido.
La corrida electroforética se llevó a cabo en buffer de electroforesis de composición
Tris 5mM, glicina 40 mM y SDS 0.2% (pH 8.3), a voltaje variable y amperaje constante de 20 mA durante aproximadamente 2 horas hasta observar la salida del indicador del frente de corrida en el extremo del gel opuesto al de siembra.
Transferencia de las proteínas y su inmunodetección
Las bandas proteicas separadas por electroforesis se transfirieron desde los geles a membranas de polivinilideno difluoruro (PVDF) Immobilon (Millipore, Bedford, MA, USA) utilizando una cámara de transferencia (modelo Mini Trans-Blot cell electroblotter, BIO-RAD
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Life Science Group, CA, USA) colocada dentro de una cuba de hielo. La transferencia se realizó durante 90 minutos a voltaje variable y amperaje constante de 250 mA. Las
membranas de PVDF habían sido activadas previamente en metanol puro. El buffer de
transferencia estaba compuesto por Tris 250 mM pH 8.3, glicina 1.92 M y SDS 0.5%. A continuación, las membranas fueron bloqueadas por exposición a BSA (Sigma Aldrich, A - 7906) al 5% en buffer TBS-T [Tris-HCl 20 mM (pH 7.4), NaCl 100 mM, Tween 20 0.1% (p/v)] (TBS-T/BSA), durante 2 horas a temperatura ambiente y agitación constante. Después de tres lavados de 5 minutos cada uno con TBS-T, se procedió a incubar la membrana durante la noche a 4°C con el anticuerpo primario específico, diluido en la solución de bloqueo, y en agitación suave constante. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios policlonales de conejo para la detección de las proteínas de interés: anti-flotilina-1 (a una concentración 1:1000 en TBS-T/BSA; sc-25506), anti-caveolina-1 (1:1000; sc-894), anti-calnexina (1:1000; sc-11397) y anti-receptor de estrógeno acoplado a proteína G (anti- GPR30) (1:500; sc-48524), todos adquiridos en Santa Cruz Biotechnology, INC. (Santa Cruz, CA, USA), y el anticuerpo primario policlonal de ratón anti-receptor de transferrina (anti-TfR) (1:1000; H68.4, 13-6800) de Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA). El anticuerpo para caveolina fue gentilmente donado por la Dra. Lorena Milanesi, y el anti-TfR por el Dr. José Luis Daniotti.
Posteriormente las membranas fueron sometidas a tres lavados de 5 minutos cada uno con TBS-T para eliminar el exceso del anticuerpo primario, e incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente con una dilución del anticuerpo secundario correspondiente conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (HRP), diluido en solución de bloqueo (1:2000 en el caso del anti-inmunoglobulina de ratón sc-2005, usado para TfR, y 1:5000 del
anti-inmunoglobulina de conejo sc-20049, usado para las demás proteínas en estudio, y
ambos de Santa Cruz Biotechnology). Luego de 3 lavados de más de 5 minutos cada uno con TBS-T a temperatura ambiente, las membranas fueron incubadas finalmente con los
reactivos de quimioluminiscencia del kit comercial ClarityTM Western ECL (Amersham
Biosciences) y posteriormente expuestas a placas autorradiográficas (Kodak X-Omat AR) para visualizar las proteínas de interés. Para cuantificar las bandas inmunoreactivas, se
utilizó el programa de análisis de imágenes Image J (Image J 1.47h, Wayne Rasband
National Institute of Health, Bethesda, MD, USA).
5.2. Determinación del perfil proteico
Para obtener los perfiles proteicos de los HT de células y de las fracciones de membranas se resolvieron 20 µg de proteínas en geles de poliacrilamida 12% mediante SDS-PAGE. Previo a la siembra, cantidades conocidas de proteína de cada muestra se
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concentraron mediante el procedimiento de precipitación antes descrito. Paralelamente a las muestras, se sembraron en los geles 10 µL de un estándar de pesos moleculares conocidos de origen comercial para estimar el tamaño de las bandas proteicas presentes en cada fracción. Una vez resueltas, las proteínas se visualizaron mediante tinción del gel con el colorante Comassie Blue.
5.3. Actividad de la 5´nucleotidasa
Para determinar el origen de las distintas fracciones de membrana aisladas con los dos procedimientos empleados, dado que el foco principal del estudio estaba puesto sobre las fracciones ML y MP provenientes de la membrana plasmática de las células, se midió la actividad de la 5´ nucleotidasa, enzima considerada marcadora de la misma. Las mediciones se realizaron en el HT, en las fracciones DRM y DSM del método que emplea detergente, y en las fracciones ML, MP, MEP, y Pe del método libre de detergente, de acuerdo al
protocolo descrito por Widnell y Unkeless (1968), resumido en la Figura 4. Este método
mide la liberación de fosfato inorgánico (Pi) a partir del sustrato de la 5´nucleotidasa, adenosina monofosfato (AMP).
Figura 4. Protocolo para la determinación de la actividad de la 5´nucleotidasa según el método descrito por Widnell y Unkeless (1968).
De cada muestra se tomaron alícuotas de 20 µg de proteína, resuspendidas en el buffer Tris-HCl 0.1 M (pH 8.5) y se completó el volumen hasta 50 µL con este mismo buffer.
Luego se agregaron 250 µL del sustrato (AMP 10 mM y MgCl2 10 mM en buffer Tris-HCl 0.1
M, pH 8.5) y se incubó la mezcla por 20 minutos a 37ºC con agitación suave. La reacción terminó con el agregado de 700 µL del reactivo de coloración (consistente en una parte de ácido ascórbico 10% en agua en 6 partes de molibdato de amonio 0.42% en ácido sulfúrico 1 N). El color, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de Pi liberado, se desarrolló
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incubando las muestras durante 1 hora a 37ºC con agitación suave constante y la absorbancia se leyó en espectrofotómetro a 820 nm. Paralelamente se prepararon blancos y una curva estándar, utilizando concentraciones conocidas de una solución de 8 µg/mL de
KH2PO4. Los resultados se presentan como actividad específica de la enzima (nmol Pi/mg
proteína/minuto).
5.4. Determinación del contenido de proteínas
La cuantificación de la cantidad total de proteína en las muestras, ya sea para sembrar cantidades específicas en las electroforesis o para expresar resultados sobre la base del nivel de proteína en tejidos, células o membranas, se realizó utilizando el DC Protein Assay (BIO-RAD Life Science Group, Florida, CA, USA). La absorbancia de las muestras luego de la reacción se leyó en un espectrofotómetro Jasco V-630 a 750 nm. Se utilizó un estándar de BSA de 2 mg/mL en agua para construir las curvas de calibrado.