Células NK primarias

Las células NK primarias se obtuvieron a partir de los PBMCs de donantes sanos o de pacientes con cáncer colorectal y cáncer de pulmón. Las muestras de sangre de donantes sanos fueron proporcionadas como capa leuco-plaquetaria (del inglés, buffy coat) por el Banco de Sangre y Tejidos de Aragón con la aprobación del Comité de Ética en la Investigación Clínica de la Comunicad de Aragón (CEICA), número C.I.P.11/006. Las muestras de sangre de pacientes con cáncer fueron proporcionadas como sangre total anticoagulada por el Hospital Clínico Lozano Blesa de Zaragoza, con la aprobación del CEICA número C.P.C.I.14/124.

Línea celular Porcentaje de

Methocell Tiempo de incubación (h) CaCo-2 20% 48 Colo-201 20% 48 Colo-205 20% 48 DLD-1 20% 48 HCT-116 20% 48 HCT-116 GFP 20% 48 HCT-116 bax/bak-/- _{30% 72} HT-29 20% 48 LoVo 30% 72 SKCO-15 30% 72 SW620 30% 72

3.1.2.1 Aislamiento de PBMCs

Para obtener los PBMCs de las muestras de sangre se realizó una separación de células en gradiente de densidad, utilizando la solución de extracción Ficoll (Histopaque®-1077; Anexo 1, Tabla 2). En primer lugar, la sangre procedente de buffy coats se diluyó en 5 volúmenes de PBS estéril; mientras que la sangre total se diluyó a la mitad. Esta sangre diluida se añadió, con cuidado de no mezclar las fases, sobre un volumen de Ficoll en proporción 1:1. Se centrifugó a 500 xg durante 30 min, quitando el freno de la centrífuga, y posteriormente se recuperó el anillo de PBMCs localizado en la interfase. Tras centrifugar a 500 xg durante 5 min para retirar el plasma y Ficoll arrastrados, se lisaron los glóbulos rojos con 2 mL de tampón de lisis (Anexo 1, Tabla 2) mediante una incubación de 5 min a RT. Finalmente, los PBMCs purificados se lavaron 3 veces con PBS estéril y se utilizaron en estudios posteriores, recién aislados o tras ser activados (apartado 3.1.2.2).

3.1.2.2 Generación de células NK activadas a partir de PBMCs 3.1.2.2.a Activación a corto plazo de PBMCs de donantes sanos

Cuando el objetivo del procedimiento fue únicamente la activación de las células NK para incrementar su actividad citotóxica, sin llegar a obtener una expansión de las mismas, se siguió un protocolo de activación a corto plazo que había sido establecido previamente en el laboratorio (Sánchez-Martínez et al. 2015) (527).

Este protocolo, que consideramos estándar, se basa en el empleo de las células estimuladoras R69, que son una línea linfoblastoide (LCL, del inglés, Lymphoblastoid Cell Line) procedente de células B, inmortalizada con el Virus Epstein-Barr (EBV). La línea celular R69 se caracteriza por expresar tanto HLA-I, con todos los epítopos conocidos de los KIR, como HLA-II (527, 528). Previamente a ser utilizadas en co-cultivo con los PBMCs, las células estimuladoras se trataron con mitomicina-C (25 µg/mL; Anexo 1, Tabla 1) en RPMI sin SFB, durante 90 min, a 37°C, para arrestar el ciclo celular. Pasado este tiempo, se inactivó la mitomicina-C añadiendo RPMI completo y se realizó un lavado con el mismo medio. Seguidamente, las células estimuladoras se dejaron incubar en RPMI completo durante 30 min, a 37°C, para eliminar el exceso de droga.

La activación de las células NK se llevó a cabo mediante el co-cultivo de los PBMCs y las células estimuladoras (ratio 10:1; PBMCs:R69) durante 5-7 días. El cultivo se mantuvo en medio de células primarias (RPMI completo sin antibióticos) a una densidad 1x106 _{PBMCs/mL en un}

volumen de 50 mL en frascos de cultivo de 75 cm2_.

3.1.2.2.b Activación y expansión de PBMCs de donantes sanos

Cuando se quiso estudiar la expansión de las células NK, se consideraron varios protocolos basados en la literatura (Sánchez-Martínez et al. 2018) que utilizaban diferentes estímulos solos o en combinación (529).

 Citoquinas: IL-2 (100 UI/mL; Tabla 3.4) y/o IL-15 (5 ng/mL; Tabla 3.4)

 Células estimuladoras: R69 o 721.221 (ratio 10:1; PBMCs:LCL-EBV+_{). Las células 721.221}

también son una línea linfoblastoide de células B inmortalizadas con EBV, deficientes en HLA-I pero que mantienen la expresión de HLA-II (530, 531).

Tabla 3.4 Interleuquinas (IL)

Intreleuquina Casa comercial Concentración del stock Medio de dilución Concentración

de trabajo

IL-2 Miltenyi Biotec. 200 µg/mL ≈106 _{U/mL PBS + 0,1% BSA 100 U/mL}

IL-15 Miltenyi Biotec. 250 µg/mL PBS + 0,1% BSA 5 ng/mL

Por otro lado, también se valoró el empleo del conjunto de PBMCs al inicio de la expansión o, en su lugar, la fracción de PBMCs remanente tras haber eliminado las células CD3+

(apartado 3.1.2.3) que puedan afectar a la activación y expansión de las células NK.

En esta ocasión, la activación de las células NK se llevó a cabo mediante el cultivo de los PBMCs, o PBMCs-CD3-_{, con los diferentes estímulos durante 21 días, siguiendo el esquema}

Figura 3.2 Protocolo de expansión de PBMCs provenientes de muestras de sangre de donantes sanos.

Para la activación se partió del conjunto de PBMCs, o la fracción enriquecida en células NK, y se añadieron los distintos estímulos (células estimuladoras y/o interleuquinas) según se explica (apartado 3.1.2.2.b).

 El cultivo se inició a una densidad 1x106 _{PBMCs/mL, en un volumen de 3-10 mL, que se}

mantuvo durante los 7 primeros días.

 A día 7, se añadió al cultivo un volumen equivalente de medio de células primarias junto con los estímulos correspondientes. Esto supuso añadir una cantidad de IL doble de la inicial, pero el mismo número de células estimuladoras ya que, a este día, todavía no se ha iniciado la expansión de los PBMCs.

 A partir de día 7, se siguió con la reactivación de los PBMCs cada 2-3 días. En cada reactivación se reajustó la densidad celular a la inicial, para que el cultivo nunca sobrepasara los 2x106 _{PBMCs/mL, y se añadieron de nuevo los estímulos como se ha}

descrito anteriormente, manteniendo un volumen máximo de 10 mL.

En el caso particular de la expansión de células NK destinadas a los ensayos in vivo (apartado 3.5.2.2), se optó por iniciar el cultivo con PBMCs-CD3- _{y utilizar como estímulo la línea}

celular R69 en combinación con IL-2 e IL-15. La producción acumulativa de células NK se mantuvo en volúmenes máximos de 20-30 mL para obtener un mayor número de células NK.

Finalmente, la tasa de expansión de las células NK se determinó mediante el recuento acumulado de los PBMCs en cultivo en cada día de reactivación (apartado 3.1.3) y la caracterización por citometría de flujo de las poblaciones de cada expansión a través de los

de expansión, también se realizó una caracterización más extensa de las subpoblaciones de células NK, por citometría de flujo (apartado 3.3.3), a través de un análisis multiparamétrico de sus proteínas de superficie (Anexo 2).

3.1.2.2 c Activación a corto plazo de PBMCs de donantes sanos con mAbs inmuno- moduladores

De modo excepcional, en los ensayos en que los se estudió el efecto del bloqueo del eje PD- 1/PDL-1 en la activación y función de las células NK, se introdujo una modificación del protocolo “estándar” incorporando al cultivo Pembrolizumab (20 µg/mL; Tabla 3.5), un anticuerpo monoclonal frente a PD-1.

3.1.2.2 d Activación de PBMCs de pacientes con cáncer

Los PBMCs obtenidos de la sangre de pacientes con cáncer se destinaron a estudiar la implicación del eje PD-1/PDL-1 en la actividad citotóxica de las células NK. En este caso se activaron durante 48-72 horas sólos con la combinación con IL-2 (100 UI/mL) e IL-15 (5 ng/mL), en presencia o ausencia de Pembrolizumab (20 µg/mL) en el cultivo.

3.1.2.3 Obtención de células NK

Para estudiar la actividad antitumoral de las células NK, estas se enriquecieron a partir del conjunto de PBMCs. Se utilizó un protocolo de separación inmunomagnética con el sistema MACSTM_{. Éste se basa en el empleo de un anticuerpo unido a microesferas metálicas dirigido}

frente las células de interés (Tabla 3.5). Al hacer pasar una suspensión celular a través de una columna con matriz superparamagnética, colocada en el interior de un campo magnético, sólo las células marcadas con las microesferas quedan retenidas en la columna (Separador inmunomagnético MACS®; Miltenyi Biotec).

Se siguió el protocolo de marcaje del fabricante para los anticuerpos anti-CD56 (separación positiva) o anti-CD3 (separación negativa) unidos a microesferas. De este modo se resuspendieron los PBMCs, purificados de sangre periférica o activados in vitro, con una relación de 80 µL del tampón MACS/ 20 µL de anticuerpo por cada 107 _{células. La suspensión celular se}

incubó 15 min a 4°C, se lavó con tampón MACS (Anexo 1, Tabla 2), y finalmente se hizo pasar por columnas LS según las instrucciones del fabricante. En el caso de la separación positiva, se

retiró la columna del campo magnético y se eluyeron las células NK con el mismo tampón; mientras que en el caso de la separación negativa se recogió la fracción de células que no había quedado retenida en la columna dentro del campo magnético.